Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/12

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5ª Rodada Contagem de Estafilococos Coagulase Positiva em Matriz Queijo RELATÓRIO FINAL ORGANIZAÇÃO E COORDENAÇÃO Fundação Oswaldo Cruz - Fiocruz Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde - INCQS Avenida Brasil, 4365 - Manguinhos Rio de Janeiro - RJ Brasil - Cx. Postal 96 - CEP: 1040-900 COMISSÃO ORGANIZADORA DA RODADA - COMISSÃO DO PROGRAMA DE ENSAIO DE PROFICIÊNCIA Armi Wanderley da Nóbrega Coordenador Geral Marcus Henrique Campino de la Cruz Coordenador Técnico Maria Helena Wohlers Morelli Cardoso Coordenadora da Qualidade - COMITÊ TÉCNICO Carla de Oliveira Rosas Juliana de Castro Beltrão da Costa Marcelo Luiz Lima Brandão Márcia Barbosa Warnken Rodrigo Rollin Pinheiro Silvia Maria Lopes Bricio Valéria de Mello Medeiros 6/NOVEMBRO/01 Autorizada a emissão Armi W. da Nóbrega (Coordenador Geral) Página 1 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 SUMÁRIO 1. Introdução... 3. Objetivos... 4 3. Produção dos Itens de Ensaio... 4 3.1. Escolha da Matriz... 4 3.. Preparo do Item de Ensaio... 4 3.3. Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio... 4 3.4. Envio dos Itens de Ensaio... 5 4. Análise dos Resultados... 5 4.1. Resultados das Medições dos Laboratórios... 5 4.. Estabelecimento do Valor Designado... 5 4.3. Análise Estatística... 5 4.3.1. Avaliação da Homogeneidade dos Itens de Ensaio... 6 4.3.. Avaliação da Estabilidade dos Itens de Ensaio... 6 4.3.3. Desvio Padrão para Avaliação de Proficiência... 6 4.3.4. Índice z... 6 4.3.5. Análise Robusta... 7 5. Resultados da Avaliação da Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio... 7 5.1. Avaliação da Homogeneidade... 7 5.. Avaliação da Estabilidade de Armazenamento e de Transporte... 8 6. Atribuição dos Valores Designados... 9 7. Avaliação do Desempenho dos Laboratórios Participantes... 9 7.1. Laboratórios Participantes... 9 7.. Resultados dos Laboratórios Participantes... 9 7.3. Cálculo do Índice z... 1 8. Conclusões... 16 9. Confidencialidade... 17 10. Referências Bibliográficas... 17 11. Laboratórios Participantes... 18 Anexo A Homogeneidade Segundo o Protocolo Harmonizado... 19 Anexo B Valor Designado e Desvio Padrão Robusto Segundo a Norma ISO 1358... 1 Página de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 1. Introdução Ensaio de proficiência (EP) é o uso de comparações interlaboratoriais com o objetivo de avaliar a habilidade de um laboratório em realizar um determinado ensaio ou medição de modo competente e demonstrar a confiabilidade dos resultados gerados. Em um contexto geral, o EP propicia aos laboratórios participantes: avaliação do desempenho e monitoração contínua; evidência de obtenção de resultados confiáveis; identificação de problemas relacionados com a sistemática de ensaios; possibilidade de tomada de ações corretivas e/ou preventivas; avaliação da eficiência de controles internos; determinação das características de desempenho e validação de métodos e tecnologias; padronização das atividades frente ao mercado e reconhecimento de resultados de ensaios, em nível nacional e internacional. Com a crescente demanda por provas regulares e independentes de competência pelos organismos reguladores e clientes, o EP é relevante para todos os laboratórios que testam a qualidade de produtos. Além do baixo número de provedores de EP na área de alimentos, os custos cobrados para a participação nestes ensaios principalmente de provedores internacionais, são normalmente muito elevados, o que inviabiliza, em muitos casos, a participação de um laboratório em um número maior de ensaios. Como forma da avaliação da qualidade técnica de laboratórios de microbiologia de alimentos, provedores de EP disponibilizam escopos de ensaios envolvendo micro-organismos de importância na área. Dentre as bactérias associadas às doenças de origem alimentar, destacam-se os estafilococos, sendo o Staphylococcus aureus é o mais comumente associado a surtos de doenças de origem alimentar. Alguns fatores de virulência dos estafilococos têm sido associados à sua capacidade enterotoxigênica, dentre eles, a produção da enzima coagulase (Hennekinne et al, 010). Embora não haja uma relação direta entre a produção da coagulase e das enterotoxinas, o teste da coagulase é o mais amplamente utilizado em laboratórios para correlacionar a cepa isolada com a produção dessas toxinas (Wong; Bergdoll, 00). A legislação brasileira que estabelece os parâmetros microbiológicos para alimentos descreve, para o controle de bactérias estafilocócicas, o grupo dos estafilococos coagulase positivo (ECP) como parâmetro. Assim, a realização de programas de EP no Brasil é fundamental para o aumento da confiabilidade dos resultados das medições aqui realizadas, trazendo maior confiabilidade aos resultados emitidos, facilitando o comércio internacional e prevenindo barreiras técnicas. Visando a promoção da saúde e em apoio a maior competitividade da indústria nacional, o INCQS promoveu o Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5ª Rodada Contagem de Estafilococos Coagulase Positiva em Matriz Queijo, seguindo as diretrizes da ISO/IEC 17043 e ILAC G-13, apresentando neste relatório os resultados da avaliação de desempenho dos laboratórios participantes. Página 3 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1. Objetivos Determinar o desempenho de laboratórios na realização do ensaio de contagem de estafilococos coagulase positiva em matriz queijo; Contribuir para o aumento da confiabilidade dos resultados das análises dos laboratórios; Propiciar subsídios aos laboratórios para a identificação e solução de problemas. 3. Produção dos Itens de Ensaio Os procedimentos de preparo dos itens de ensaio e as análises foram realizados no Setor de Alimentos do Departamento de Microbiologia (DM) do INCQS/Fiocruz. O referido Setor possui certificado de acreditação na metodologia analítica de contagem de Estafilococos Coagulase Positiva, pela Cgcre do Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial (Inmetro), segundo a norma ABNT ISO/IEC 1705. 3.1. Escolha da Matriz O queijo tipo Minas Frescal é um produto tipicamente nacional, de tecnologia simples e de larga aceitação no país. Por ser um alimento de pronto consumo, e indicado para idosos, gestantes e convalescentes, inclusive em dietas hospitalares, a sua inocuidade é de suma importância para que estes produtos não venham a causar riscos à saúde do consumidor. 3.. Preparo do Item de Ensaio Foi utilizado como matriz queijo minas produzido pelo processo de ultrafiltração. Antes da utilização do alimento foi verificada a ausência de contaminação por bactérias do grupo dos estafilococos coagulase positiva. Foram distribuídos assepticamente gramas de queijo em frascos de vidro estéreis. Para a cultura bacteriana foi utilizada a cepa de Staphylococcus aureus nº34 da coleção de pesquisa do Setor de Alimentos do Departamento de Microbiologia do INCQS. O lote obtido foi armazenado em ultrafreezer a -70ºC. 3.3. Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio Para a avaliação da homogeneidade foram separados aleatoriamente 4 (vinte e quatro) itens de ensaio preparados e, após a reconstituição e homogeneização do liófilo, foram preparadas diluições decimais. Foram realizados estudos de estabilidade de curta duração (transporte) e de longa duração (armazenamento e referência). Para os estudos de longa duração foi feito o controle de estoque a -70ºC (temperatura de referência) e a -0 C (temperatura de armazenamento durante o EP). Os testes da estabilidade a -70ºC e -0 C foram iniciado após o preparo do lote e abrangeram o tempo disponibilizado aos laboratórios participantes do EP para a análise do item de ensaio. Página 4 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 A estabilidade de curta duração, que verificou a influência da temperatura nas condições de transporte, foi estudada por 4 dias, em diferentes temperaturas: 4ºC, 30ºC e 35ºC, utilizandose o modelo Isócrono (Lamberty, Schimmel e Pauwels, 1997). Os testes estatísticos foram feitos segundo o Protocolo Harmonizado (Homogeneidade) e a ISO GUIDE 35 (Estabilidade); os resultados obtidos nos testes estão apresentados nos itens 5.1 e 5. deste relatório. 3.4. Envio dos Itens de Ensaio Para cada laboratório inscrito na 5ª Rodada do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos Contagem de Estafilococos Coagulase Positiva em Matriz Queijo foram enviados dois itens de ensaio, contendo S. aureus em aproximadamente g de queijo liofilizado, cada um, a uma concentração não declarada. Os itens de ensaio foram enviados aos laboratórios participantes, em frascos devidamente lacrados e rotulados com as seguintes informações: nome do programa, item a ser ensaiado, código da amostra e rodada em questão. Os frascos foram acondicionados em caixas para transporte de material biológico contendo gelo seco e enviadas por via aérea. 4. Análise dos Resultados 4.1. Resultados das Medições dos Laboratórios Os laboratórios receberam dois itens de ensaio contendo amostra queijo liofilizado e foram orientados a proceder como nas análises rotineiras realizadas no laboratório, a expressar os resultados analíticos em UFC/g e informar a metodologia e os meios de cultura utilizados nas análises do EP no Formulário de Registro de Resultados. 4.. Estabelecimento do Valor Designado As técnicas de estatística robusta são utilizadas para minimizar a influência de resultados extremos sobre estimativas de média e desvio-padrão. Assim, a Coordenação deste Ensaio de Proficiência adotou como valor designado para a contagem de ECP, aquele oriundo do cálculo da estatística robusta apresentado no item 5.6 da norma lso 1358. Seguindo os critérios desta norma, o valor designado foi obtido pela média robusta dos resultados emitidos pelos laboratórios participantes, dentro do estabelecido nos itens 1 e do tópico Valor de Referência e Desvio Padrão Alvo do protocolo deste ensaio, e pelo INCQS, conforme os procedimentos estatísticos descritos no item 4.3.5 deste relatório. 4.3. Análise Estatística Neste tópico estão descritas as análises estatísticas utilizadas para a obtenção do valor designado e do desvio padrão utilizado na análise da proficiência, para a avaliação da Página 5 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 homogeneidade, da estabilidade das amostras e para a avaliação do desempenho dos laboratórios participantes. 4.3.1. Avaliação da Homogeneidade dos Itens de Ensaio O Protocolo Harmonizado foi seguido na avaliação da homogeneidade dos itens de ensaio. Um resumo do procedimento estabelecido neste documento para avaliação da homogeneidade dos itens de ensaio é apresentado no Anexo A. 4.3.. Avaliação da Estabilidade dos Itens de Ensaio Esses testes foram empregados para se avaliar a estabilidade da concentração de ECP na matriz em função do tempo (longa duração) e do tempo-temperatura (curta duração). Assim, foram estimadas as variâncias dos valores utilizados na regressão linear, observando-se se os valores de contagem apresentavam alguma tendência através da ferramenta estatística de análise de variância (ANOVA). A concentração de ECP foi considerada estável quando a inclinação da reta (ou a não linearidade) não foi significativa e o gráfico da concentração em função do tempo não apresentou tendências. 4.3.3. Desvio Padrão para Avaliação de Proficiência Nesta rodada de EP o desvio padrão para avaliação de proficiência dos laboratórios participantes foi calculado como recomendado no item 6.6 da norma ISO 1358, isto é, a partir do desvio padrão robusto calculado a partir dos resultados dos participantes (e do INCQS), usando o algoritmo A do anexo C desta norma. O procedimento adotado no cálculo do Desvio Padrão Robusto é descrito no Anexo B. 4.3.4. Índice z Para a qualificação dos resultados dos laboratórios, o índice z (z-score, medida da distância relativa do resultado da medição do laboratório em relação ao valor designado do EP) foi calculado de acordo com a Equação 1. * Yi X z * (1) S onde: Y i representa o valor do laboratório participante, X* representa o valor designado e S*, o desvio padrão robusto. A interpretação do valor do índice z está descrita abaixo: z - Resultado satisfatório < z < 3- Resultado questionável z 3 - Resultado insatisfatório Página 6 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 4.3.5. Análise Robusta Nesta rodada o valor designado foi calculado através da análise robusta (ISO 1358), documento complementar à ISO/IEC 17043. O procedimento adotado no cálculo do valor designado é descrito no Anexo B. 5. Resultados da Avaliação da Homogeneidade e Estabilidade dos Itens de Ensaio 5.1. Avaliação da Homogeneidade No teste de homogeneidade para cada um dos 4 itens de ensaio foram realizadas duas análises completas produzindo dois resultados (A e B), como mostrado na Tabela 1. Tabela 1: Dados gerados no teste de homogeneidade. Amostra Contagem (UFC/g) Log 10 UFC/g A B A B 1 3,44E+05 3,55E+05 5,54 5,55 3,73E+05 4,44E+05 5,57 5,65 3 3,10E+05 5,05E+05 5,49 5,70 4,51E+05,73E+05 5,40 5,44 5 3,06E+05 4,38E+05 5,49 5,64 6 3,51E+05 5,1E+05 5,55 5,7 7 3,95E+05 3,10E+05 5,60 5,49 8 3,35E+05 3,60E+05 5,53 5,56 9,38E+05 3,46E+05 5,38 5,54 10 3,75E+05 5,07E+05 5,57 5,71 11 3,55E+05 3,95E+05 5,55 5,60 1 3,37E+05,57E+05 5,53 5,41 13 5,57E+05 4,71E+05 5,75 5,67 14 3,78E+05 4,13E+05 5,58 5,6 15 3,44E+05 3,8E+05 5,54 5,58 16 3,19E+05 3,68E+05 5,50 5,57 17,80E+05 3,50E+05 5,45 5,54 18 3,6E+05 3,9E+05 5,56 5,59 19,81E+05,16E+05 5,45 5,33 0,95E+05,68E+05 5,47 5,43 1,86E+05 1,98E+05 5,46 5,30 3,6E+05 4,40E+05 5,51 5,64 3 3,94E+05 5,53E+05 5,60 5,74 4 3,74E+05,69E+05 5,57 5,43 UFC- Unidades Formadoras de Colônias A Tabela apresenta os resultados da análise estatística do estudo de homogeneidade. Tabela : Sumário das análises estatísticas, em log 10 UFC/g. Média p all s an s sam c Resultado ECP 5,5470 0,5 0,00563 0,0065 0,00413 0,01171 Suficientemente homogêneo ECP- Estafilococos coagulase positiva; UFC - Unidades Formadoras de Colônias Desta forma, consideraram-se os itens de ensaio suficientemente homogêneos para a finalidade deste Ensaio de Proficiência. Página 7 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 5.. Avaliação da Estabilidade de Armazenamento e de Transporte No decorrer do EP, foram avaliadas as flutuações temporais na concentração de ECP nas temperaturas de referência (-70 o C) e de armazenamento durante o EP (-0 C) (Tabelas 3 e 4). A influência da temperatura nas condições de transporte também foi estudada por 4 dias (Tabela 5). Estas avaliações foram realizadas utilizando-se a análise de resíduos da regressão linear. Tabela 3: Teste de estabilidade na temperatura de referência (-70 o C), em Log 10 UFC/g. Resultados Dias Frasco 1 Frasco A B A B Log das Médias 0 4,6E+07 6,5E+05 6,0E+05 7,E+05 6,8 14 8,5E+05 1,E+06 3,9E+05 4,3E+05 5,81 30 5,E+05 6,E+05 5,4E+05 6,7E+05 5,77 44 6,3E+05 5,6E+05 5,7E+05 5,0E+05 5,75 57 3,6E+05 3,7E+05 6,9E+05 6,9E+05 5,70 70 6,7E+05 1,0E+06 7,1E+05 1,1E+06 5,93 84 7,9E+05 6,9E+05 6,3E+05 6,5E+05 5,84 10 3,0E+05 3,4E+05 4,7E+05 4,8E+05 5,59 UFC- Unidades Formadoras de Colônias Tabela 4: Teste de estabilidade na temperatura de armazenamento (-0 C), em Log 10 UFC/g. Resultados Dias Frasco 1 Frasco A B A B Log das Médias 0 5,6E+05 4,7E+05 3,8E+05 3,1E+05 5,6 7 5,7E+05,5E+06 5,8E+05 6,4E+05 5,93 14 1,E+06 1,3E+06 8,7E+05 9,4E+05 6,03 3 5,4E+05 6,6E+05 4,4E+05,9E+05 5,66 9 1,E+06 1,3E+06 9,6E+05 8,3E+05 6,03 37 5,9E+05 7,5E+07 5,1E+05 5,6E+05 6,8 50 6,7E+05 7,5E+05 5,0E+05 3,7E+05 5,74 63 8,E+06 7,9E+05 6,3E+05 7,9E+05 6,13 77 6,5E+06 8,7E+05 7,3E+05 7,7E+05 6,13 113 7,0E+06 5,8E+05 6,4E+05 7,3E+05 6,07 UFC- Unidades Formadoras de Colônias Tabela 5: Análise de regressão para os diferentes estudos de estabilidade, em Log 10 UFC/g.dias -1. Intervalo de confiança ECP Coeficiente Angular Erro padrão Inferior Superior Resultado Referência -0,00330 0,00167-0,00739 0,00079 Estável Armazenamento 0,0087 0,00194-0,0016 0 0,00734 Estável Transporte 4 o C 0,08691 0,0665-0,1477 0,9860 Estável Transporte 30 o C 0,1580 0,00 0,05513 0,19647 Não Estável Transporte 35 o C 0,0846 0,03546-0,03040 0,19533 Não Estável * * Apresentou tendência UFC- Unidades Formadoras de Colônias Página 8 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 Os resultados obtidos no tratamento estatístico dos dados gerados nos estudos de estabilidade de armazenamento e de transporte à 4 0 C evidenciaram que o valor do intervalo de confiança para o coeficiente angular abrange o valor zero (0). Conclui-se, portanto, que os itens de ensaio mostraram-se suficientemente estáveis nestas condições. 6. Atribuição dos Valores Designados Os valores designados relativos à concentração de ECP empregados neste ensaio de proficiência foram calculados segundo procedimento estatístico descrito no item 4.3.5; o respectivo desvio padrão para avaliação de proficiência foi obtido pelo algoritmo A do anexo C da norma ISO 1358, conforme o item 4.3.3. O valor designado, o seu respectivo desvio padrão e a incerteza combinada e expandida do valor designado, bem como os laboratórios que contribuíram para este cálculo, estão apresentados na Tabela 6. Tabela 6: Valor designado, desvio padrão (Log 10 UFC/g), incertezas do Valor designado e laboratórios. Valor designado Desvio Padrão u c U k Laboratórios (x*) (s*) (Log 10 UFC/g) (Log 10 UFC/g) Todos os que enviaram 5,61 0,4 0,10,11 0, resultados 7. Avaliação do Desempenho dos Laboratórios Participantes 7.1. Laboratórios Participantes Vinte e sete laboratórios se inscreveram no Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5ª Rodada Contagem de Estafilococos Coagulase Positiva em Matriz Queijo, vinte e cinco (9,6 %) enviaram os resultados. Dos laboratórios que enviaram resultados, dois (8,0 %) são acreditados na norma ISO/IEC 1705 no referido ensaio e nove (36,0 %) estão em processo de acreditação nesta ensaio. 7.. Resultados dos Laboratórios Participantes Os dados reportados pelos laboratórios participantes do ensaio de proficiência foram tratados de acordo com os procedimentos descritos na ISO/IEC 17043 e na ILAC G-13. A Tabela 7 apresenta os resultados dos laboratórios para as análises dos dois itens de ensaio enviado e a metodologia empregada. O gráfico da dispersão dos resultados dos laboratórios participantes encontra-se na Figura 1. Neste gráfico a linha central representa o valor designado e as linhas pontilhadas o intervalo da incerteza expandida (U) do valor designado. Página 9 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 Tabela 7: Resultados por análise (UFC/g) e Metodologia Empregada Código dos Laboratórios Item Resultado (1) Item Resultado Metodologia () MIB 05/003 184 5,0E+04 09 4,0E+04 MMAMAA, 4 th ed., 010 MIB 05/006 145 9,3E+05 193,0E+05 APHA, 001 MIB 05/009 07 7,6E+05 108 7,4E+05 BAM/FDA MIB 05/00 1,0E+06 4 9,3E+05 APHA, 001 MIB 05/08 7 3,55E+04 9 3,8E+04 IN nº 6/003 - MAPA MIB 05/033 174,66E+05 10,74E+05 BAM/FDA MIB 05/044 176 6,0E+0 1 8,8E+05 MMAMAA, 4 th ed. MIB 05/049 081 4,1E+05 103,E+05 APHA, 5 th ed. MIB 05/053 183 5,6E+06 06,4E+06 APHA MIB 05/057 155 6,4E+05 197 4,1E+05 APHA, 4 th ed., 001 MIB 05/061 1 5,5E+05 6 6,E+05 BAM/FDA MIB 05/069 050 3,5E+05 104 1,5E+05 APHA MIB 05/074 094,3E+04 100 1,E+04 BAM/FDA MIB 05/076 05 6,0E+05 113 7,1E+05 APHA, 001 MIB 05/081 171 1,9E+06 15 4,7E+05 APHA, 001 MIB 05/085 177 6,3E+04 19 4,8E+04 Não informado MIB 05/093 078 1,5E+06 111 1,E+06 APHA, 4 th ed., 001 MIB 05/111 170 9,6E+04 198 6,4E+04 MMAMA, 1997 MIB 05/119 199 8,1E+05 00 9,3E+05 APHA, 001 MIB 05/154 061 6,7E+05 107 9,E+05 APHA, 4 th ed., 001 MIB 05/173 064 5,6E+05 110 4,E+05 SMMEDP - APHA,17 th ed., 004 MIB 05/177 03,5E+05 05 3,5E+05 APHA, 001 MIB 05/180 053 4,1E+05 114 5,8E+05 APHA, 001 MIB 05/19 180 9,3E+06 19 3,8E+06 APHA, 4 th ed., 001 MIB 05/195 077 1,0E+06 099 8,8E+04 IN nº 6/003 - MAPA INCQS H A 3,4E+05 H B 3,8E+05 BAM/FDA H A = Média da homogeneidade, Contagem A e H B = Média da homogeneidade, Contagem B (1) Casas decimais como informado pelos laboratórios. () BAM Bacteriological Analytical Manual-FDA, on line, 001 MMAMAA da silva, N.; Junqueira, V. C. A.; Silveira, N. F.A.; Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos e Água - 4 ed 010 MMAMA da silva, N.; Junqueira, V. C. A.; Silveira, N. F.A.; Manual de Métodos de Análise Microbiológica de Alimentos, 4 th ed., 1997 MAPA Instrução Normativa n 6/003 Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento APHA AMERICAM PUBLIC HEALTH ASSOCIATION - Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4 ed, 001 SMMEDP-APHA Standard Methods for the Microbiological Examination of Dairy Products, 17 th ed., 004 Página 10 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 Figura 1: Dispersão dos resultados das contagens Página 11 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 7.3. Cálculo do Índice z A avaliação de desempenho dos laboratórios participantes e do INCQS, expressa através do índice z (Equação 1), está apresentada na Tabela 8. Tabela 8: Valores do índice z obtidos pelos laboratórios participantes e pelo INCQS. Código do Laboratório Item z-score Item z-score MIB 05/003 184 -, 09 -,4 MIB 05/006 145 0,9 193-0,7 MIB 05/009 07 0,6 108 0,6 MIB 05/00 0,9 4 0,9 MIB 05/08 7 -,5 9 -,4 MIB 05/033 174-0,4 10-0,4 MIB 05/044 176-6,7 1 0,8 MIB 05/049 081 0,0 103-0,6 MIB 05/053 183,7 06 1,8 MIB 05/057 155 0,5 197 0,0 MIB 05/061 1 0,3 6 0,4 MIB 05/069 050-0, 104-1,0 MIB 05/074 094-3,0 100-3,6 MIB 05/076 05 0,4 113 0,6 MIB 05/081 171 1,6 15 0,1 MIB 05/085 177-1,9 19 -, MIB 05/093 078 1,3 111 1,1 MIB 05/111 170-1,5 198-1,9 MIB 05/119 199 0,7 00 0,9 MIB 05/154 061 0,5 107 0,8 MIB 05/173 064 0,3 110 0,0 MIB 05/177 03-0,5 05-0, MIB 05/180 053 0,0 114 0,4 MIB 05/19 180 3, 19,3 MIB 05/195 077 0,9 099 3, INCQS H 1-0, H -0,1 ND = Não detectado;azul = resultado questionável, Vermelho = resultado insatisfatório. As Figuras e 3 apresentam os resultados de índice z obtidos pelos laboratórios participantes para os dois itens de ensaio. A Figura 4 apresenta um gráfico de dispersão de Youden, onde podem ser verificados os erros sistemáticos e/ou aleatórios contribuintes para os resultados do índice z. A área demarcada em pontilhado azul é a dos resultados satisfatórios, a área entre o azul e o pontilhado em amarelo a dos resultados questionáveis e a fora do pontilhado amarelo, a dos resultados insatisfatórios. Página 1 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 Figura : Gráfico de z-score dos laboratórios participantes para os Itens de Ensaio de menor numeração. Página 13 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 Figura 3: Gráfico de z-score dos laboratórios participantes para os Itens de Ensaio de maior numeração. Página 14 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 Figura 4: Gráfico de Youden dos laboratórios participantes para a Contagem de Estafilococos Coagulase em Matriz Queijo. Página 15 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 Assim, de acordo com os resultados obtidos, oito dos vinte e cinco laboratórios participantes obtiveram resultados questionáveis ou insatisfatórios para, pelo menos, um item de ensaio analisado. De um total de cinquenta resultados reportados, aproximadamente 76,0% foram considerados satisfatórios (trinta e oito resultados), 14,0% foram considerados questionáveis (sete resultados) e 10,0% insatisfatórios (cinco resultados). Os laboratórios MIB 05/111 (item de ensaio 170) e MIB 05/180 informaram que os liófitos apresentaram dificuldades de solubilização. O laboratório MIB 05/081 informou que mesmo após o tempo de homogeinização mecânica as amostras ainda apresentaram alguns grumos. A metodologia mais utilizada foi a da Americam Public Health Association, com quinze laboratórios utilizando. Lembramos que o índice z é apenas um indicativo do desempenho do laboratório, cabendo a cada laboratório participante fazer a sua interpretação e implementar as ações corretivas, caso necessário. 8. Conclusões A análise criteriosa dos dados gerados neste EP sugere: Desempenho dos laboratórios: pode-se considerar como razoável, visto que três laboratórios tiveram todos os resultados considerados insatisfatórios, um laboratório teve um dos resultados questionável e outro insatisfatório e quatro laboratórios apresentaram resultados questionáveis para os dois itens de ensaio. Somente dezesseis laboratórios (64%) apresentaram todos os resultados satisfatórios; Preenchimento do formulário: Excetuando-se um laboratório que não informou a metodologia, todos os outros laboratórios preencheram o formulário conforme estabelecido; Ações corretivas: Para os laboratórios que obtiveram resultados insatisfatórios ou questionáveis, ações corretivas devem ser adotadas para o aprimoramento das suas medições, particularmente quando resultados insatisfatórios foram também obtidos em rodada anterior desse EP. Uma avaliação detalhada, desde o recebimento do material e seu armazenamento, até o preenchimento do Formulário para Registro dos Resultados, e a avaliação de todos os passos da metodologia de análise, serão importantes para a identificação dos pontos críticos. Finalmente, é importante ressaltar que o estabelecimento de ações corretivas e a contínua participação em ensaios de proficiência desta natureza são ferramentas de grande contribuição para o aprimoramento das medições realizadas pelos laboratórios. Página 16 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 9. Confidencialidade Os resultados deste Ensaio de Proficiência são confidenciais, isto é, cada laboratório é identificado por código individual que é conhecido apenas por ele e pela Coordenação deste Ensaio de Proficiência. Os resultados poderão ser utilizados em trabalhos e publicações pelo INCQS respeitando-se a confidencialidade dos laboratórios. 10. Referências Bibliográficas ABNT ISO/IEC 1705. Requisitos Gerais para a Competência de Laboratórios de Ensaio e Calibração, 005. Bennett, R.W.; Lancette, G.A. Staphylococcus aureus. In: Bacteriological Analytical Manual Online; FDA, 001. Disponível em: <http://www.fda.gov>. Acesso em Julho 01. Brandão, M. L. L.; Bricio, S. M. L.; Rosas, C. O.; Costa, J. C. B.; Vieira, L. R.; Medeiros, V. M.; Nascimento, J. S. Produção de Material de Referência para Contagem de Estafilococos Coagulase Positiva em Matriz Leite em Pó. In: Congresso Brasileiro de Microbiologia - 6; 011, Foz do Iguaçu Paraná. 011. Anais do 6º CBM 011. Sociedade Brasileira de Microbiologia, 011. Disponível em: <http://www.sigeventos.com.br>. Acesso em: 11 jan. 01. Brandão, M. L. L.; Costa, J. C. B.; Farias, F. M.; Rosas, C. O.; Bricio, S. M. L.; Nascimento, J. S. Produção de Material de Referência para Ensaio de Proficiência Destinado à Contagem de Estafilococos Coagulase Positiva em Matriz Queijo. In: Simpósio de Segurança Alimentar - 4., 01, Gramado Rio Grande do Sul. 01. Anais do 4º SSA 01. Sociedade Brasileira de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 01. CD-ROOM. Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial. Vocabulário Internacional de Metrologia: Conceitos Fundamentais e Gerais e Termos Associados (VIM 008). Rio de Janeiro, 008. International Laboratory Accreditation Cooperation- ILAC G13.Guidelines for the requirements for the competence of providers of proficiency testing schemes, 007 International Organization for Standardization ISO/IEC 17043 - Conformity assessment General requirement for proficiency testing. Geneva, 010. International Organization for Standardization ISO GUIDE 35 - Reference materials General and statistical principles for certification. Geneva, 006 International Organization for Standardization ISO 1358 - Statistical methods for use in proficiency testing by interlaboratory comparisons. 005. Lamberty, A.; Schimmel, H.; Pauwels, J. The study of the stability of reference materials by isochronous measurements. Fresenius Journal Analytical Chemistry, Vol.360, 359 361, 1998. Rosas, Carla de Oliveira, et al. Desenvolvimento de Material de Referência em Microbiologia de Alimentos. Rev. Inst. Adolfo Lutz, 010: 15-. The International Harmonized Protocol for the Proficiency Testing of Analytical Chemistry Laboratories.Pure Appl. Chem., Vol. 78, N o. 1, pp. 145 196, 006. Página 17 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 11. Laboratórios Participantes A lista dos laboratórios que enviaram os resultados à coordenação do Programa é apresentada na Tabela 9. Tabela 9: Laboratórios participantes do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5ª Rodada Contagem de Estafilococos Coagulase Positiva em Matriz Queijo. Instituição Laboratório de Enterotoxina em Alimentos / Serviço de Microbiologia /DIVISA/IOM/FUNED Fundação Ezequiel Dias Laboratório de Microbiologia Alimentar Instituto Adolfo Lutz Centro de Laboratório Regional de Santos Microbiologia de Água e Alimentos LACEN/CE Laboratório de Saúde Pública Dr.Giovanni Cysneiros - LACEN /GO Laboratório de Microbiologia de Alimentos Laboratório Central de Saúde Pública Estadual (LACEN/MS) Laboratório Central de Saúde Pública de Alagoas LACEN/AL Laboratório de Saúde Pública Dr. Jefferson Ignácio de Araújo Prefeitura Municipal de Guarulhos Núcleo de Ciências Químicas e Bromatológicas - Laboratório de Microbiologia de Alimentos Centro de Laboratório Regional Instituto Adolfo Lutz de Ribeirão Preto VI Seção de Microbiologia de Águas e Alimentos Laboratório Central do Estado do RS/IPB - LACEN - FEPPS Zínia Análises Químicas e Microbiológicas LTDA Microbiologia de Alimentos da Gerência de Controle Sanitário e Ambiental Laboratório Central Noel Nutels Centro de Laboratório Regional Santo André VIII - Instituto Adolfo Lutz LACEN/SP Microbiologia de Alimentos - LACEN /PR Laboratório de Microbiologia de Produtos e Ambiente Laboratório Central Dr. Almino Fernandes LACEN/RN Laboratório de Microbiologia de Produtos - Divisão de Produtos - LACEN /AC Setor de Microbiologia de Alimentos LACEN /PA Laboratório de Controle de Produtos Superintendência de Vigilância e Fiscalização Sanitária em Zoonoses Centro de Laboratório Regional - IAL Campinas Instituto Adolfo Lutz Laboratório Central de Saúde Pública Drª Telma Lobo - LACEN /PB Grupo Mattos e Mattos Laboratório de Alimentos e Asses. M. Mattos Ltda Laboratório de Microbiologia de Alimentos Laboratório Central de Saúde Pública Prof. Gonçalo Moniz LACEN/BA Núcleo de Microbiologia - Instituto Adolfo Lutz Laboratório de Microbiologia de Alimentos - Laboratório Central de Saúde Pública de Rondônia LACEN/RO Laboratório de Segurança Microbiológica em Alimentos (LSMA) - Instituto Mineiro de Agropecuária Laboratório Nacional Agropecuário Lanagro MG Total de participantes: 5 laboratórios O código de cada participante não está associado à ordem da lista de participantes. Página 18 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 Anexo A Homogeneidade Segundo o Protocolo Harmonizado Da temperatura de referência, foram retirados aleatoriamente vinte e quatro itens de ensaio, que após a reconstituição e homogeneização do liófilo, duas alíquotas de 0,1 ml foram semeadas em placas de Petri contendo ágar Baird Parker. Os frascos foram analisados em ordem aleatória e sob condições de repetitividade, segundo a metodologia descrita por Bennett e Lancette (001). Para verificar a ocorrência de problemas estatísticos, os dados foram dispostos num gráfico simples de resultados x número de amostra e analisados visualmente em busca de características usuais em diagnóstico, tais como: (a) tendências ou descontinuidades; (b) distribuição não-aleatória de diferenças entre o primeiro e segundo resultado de ensaio; (c) arredondamento excessivo; e (d) resultados dispersos intra-amostras. Como não foi verificado nenhum problema estatístico, os dados foram usados para estimar as variâncias analíticas e amostral conforme descrito abaixo: Valores Dispersos Primeiramente foi aplicado o teste de Cochran aos resultados, com o propósito de eliminar possíveis valores dispersos. Assim, calculou-se a soma, S i, e a diferença, D i, de cada par de resultados, para i = 1 até 10. Calculou-se a soma dos quadrados S DD das m diferenças a partir da Equação 1: S DD D i A estatística do teste de Cochran (Equação ) é a razão entre quadrado, e a soma dos quadrados das diferenças: (1) D max, a maior diferença ao D C S Foi calculada a razão acima e comparada com o valor crítico apropriados da tabela de teste de Cochran para um nível de confiança de 95 %. max DD () Não-homogeneidade significativa A mesma soma dos quadrados das diferenças (Equação 4) foi utilizada para calcular a variância analítica, s an, Equação 3. Página 19 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 s an D / m MS (3) Onde D i é a diferença de cada par de resultados do teste de homogeneidade e m é o número de recipientes selecionados para o teste de homogeneidade. w i A seguir, calculou-se a variância V S das somas S i de acordo com a Equação 4: Onde s é a média de S i. vs MSB (si s) /(m 1) (4) Calculou-se a variância amostral, s, de acordo com a Equação 5 sam s sam (MS MS )/ (5) B w Calculou-se a variância amostral aceitável, para avaliação da homogeneidade. all, como all ( 0,3 p) onde p é o desvio padrão Xm -1; 0,95 Tomando-se os valores de F 1 e F, onde F1 e F (m 1) crítico de homogeneidade para o ensaio como (Equação 6): (F m-1;m; 0,95 1), calculou-se o valor Como s sam 1 all F san c F (6) < c, não há evidência de que o desvio-padrão amostral na população de amostras ultrapassa a fração aceitável do desvio-padrão alvo. Página 0 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 Anexo B Valor Designado e Desvio Padrão Robusto Segundo a Norma ISO 1358 A Norma ISO 1358 é um documento complementar à ISO/IEC 17043 e fornece os métodos estatísticos a serem empregados nos ensaios de proficiência. Este documento descreve a análise robusta envolvendo o emprego da estimativa do algoritmo A para o cálculo do valor designado e do desvio padrão. Inicialmente, todos os valores objetos da análise (valores enviados pelos laboratórios participantes e pelo INCQS) foram colocados em ordem crescente. A seguir, foram calculados os valores da mediana de x i (x*) e do desvio padrão (s*), conforme as Equações 1 e. x* medianade x i (1) s* x * 1,483 med xi () Onde: med é a mediana; x i valor de concentração reportado pelo laboratório. Em seguida, foi calculado o valor de F i, segundo a Equação 3, e a partir da estimativa de F i, calculou-se o novo valor inferior (concentração inferior), e o novo valor superior (concentração superior), através das Equações 4 e 5. F i = 1,5s* (3) Novo Valor Superior= x* + F i (4) Novo Valor Inferior= x* - F i (5) Os novos valores, superior e inferior, foram comparados a cada um dos resultados individuais dos laboratórios participantes, e os que estavam acima do valor superior ou abaixo do valor inferior foram descartados, ou seja, foram considerados valores dispersos ou discrepantes e substituídos pelos novos valores superiores e inferiores. Este procedimento compreende a um ciclo ou Ciclo 0. Iniciou-se um novo ciclo, a partir do cálculo da média robusta (x*) 1 e do desvio padrão (s) dos novos valores encontrados, e a seguir calculou-se o novo desvio padrão robusto (s*). O novo valor de s* foi calculado pela Equação 6: (6) Em seguida, calculou-se novamente o valor de F i, os novos valores superiores e inferiores, conforme descrito, respectivamente, nas Equações 3, 4 e 5, sendo os valores discrepantes substituídos pelos novos limites. Este procedimento corresponde a outro ciclo ou Ciclo 1. 1 Na ISO 1358 quando se inicia o Ciclo 1, x* passa a ser denominado como média robusta, uma vez que advém de um algoritmo robusto. Na ISO 1358 quando se inicia o Ciclo 1, s* passa a ser denominado como desvio padrão robusto, uma vez que advém de um algoritmo robusto. Página 1 de

Relatório Final do Ensaio de Proficiência em Microbiologia de Alimentos 5 a Rodada MIB 05/1 O ciclo é reiniciado até o momento em que os valores da nova média robusta (x*) e do novo desvio padrão robusto (s*) convergirem, ou seja, até que não haja nos ciclos, diferença entre eles. Neste momento o ciclo é finalizado e os novos valores de x* e s*, que são os valores da média robusta (valor designado do EP) e do desvio padrão robusto. Para a incerteza do valor designado, foi adotada a fórmula apresentada no item 5.6. da norma ISO 1358, específica para valores designados obtidos a partir do algoritmo A. A incerteza padrão foi calculada pela Equação 7: (7) Onde, s * é o desvio padrão robusto e p é o número de laboratórios. Página de