Universidade Federal do Rio Grande do Sul Laboratório de Sinalização e Plasticidade Celular COMER OU NÃO COMER? EIS A QUESTÃO! O PAPEL DA AUTOFAGIA A BIOLOGIA TUMORAL Msc. Eduardo Cremonese Filippi Chiela - eduardochiela@gmail.com - I
Autofagia... O QUE É? COMO FUNCIONA? QUAL A FUNÇÃO?
AUTOFAGIA = MECANISMO DE MORTE CELULAR? NÃO
MORTE AUTOFÁGICA AUTOFAGIA 2008 2005-2007
O BOOM da autofagia...
AUTO (próprio) + FAGIA (alimentar-se de) Processo homeostático catabólico de quebra de componentes celulares próprios através da via lisossomal DANIFICADOS * autofagocitose / autodigestão ENVELHECIDOS (MENOS FUNCIONAIS) MAL-FORMADOS FISIOLÓGICA BENÉFICA CONSERVADA EVOLUTIVAMENTE
i. Agente Indutor ii. Contexto iii. Intensidade e conteúdo autofagocitado iv. Tempo de indução vs ~90%
autofagossomos pró-núcleo 1 pró-núcleo 2
AUTOFAGIA FISIOLÓGICA desenvolvimento embrionário
Autofagia Fisiológica Processos e Mecanismos nos quais a autofagia exerce alguma função Desenvolvimento Remodelagem tecidual Diferenciação celular Sobrevivência celular AUTOFAGIA Envelhecimento Metabolismo celular Morte Celular
Autofagia Fisiológica Principais indutores de autofagia AGREGADOS PROTÉICOS PRIVAÇÃO DE NUTRIENTES E OXIGÊNIO DANO EM ORGANELAS AUTOFAGIA TOXINAS e MICROORGANISMOS COMPOSTOS QUÍMICOS
Família Atg: Autophagyrelated genes Coordenam o processo autofágico ATP Substratos para a célula
p62: marcadora de lixo intracelular - AUTOFAGIA SELETIVA
MODULAÇÃO DA AUTOFAGIA AUTOFAGIA
MODULAÇÃO DA AUTOFAGIA Vias/Sinais de Ativação da Proliferação A A Via/Sinal de Inibição da Proliferação Via/Sinal de Inibição da Proliferação A A A AUTOFAGIA
A AUTOFAGIA PODE DEGRADAR COMPONENTES ESPECÍFICOS DA CÉLULA A. MITOFAGIA - Mitocôndrias B. PEXOFAGIA* - Peroxissomos C. RETICULOFAGIA Retículo Endoplasmático D. NUCLEOFAGIA* Porções Nucleares (ou núcleos inteiros) E. AGREGADOS PROTÉICOS marcados pela proteína p62 F. LIPOFAGIA Membranas e outros pequenas moléculas lipídicas * bem descritos em leveduras, pouco conhecidos em eucariotos multicelulares
MITOFAGIA RETICULOFAGIA
Expressão reduzida em PARKINSON Acúmulo de mitocôndrias defeituosas + aumento de ROS
A AUTOFAGIA DEGRADA COMPONENTES DE MODO TEMPO-DEPENDENTE
AUTOFAGIA E CÂNCER
AUTOFAGIA: Oncogênico ou Supressor Tumoral? PROCESSO ONCOGÊNICO
i. Sobrevivência durante privação de nutrientes e oxigênio (Ex.: células internas de tumores sólidos) ii. Sobrevivência durante quimioterapia (Ex.: ATP para reparo de DNA) iii. Prevenção de apoptose (Ex.: eliminação de mitocondrias próapoptóticas)
i. Manutenção da estabilidade genética ii. Controle do ciclo celular e indução de senescência iii. Morte Autofágica (Ex.: quimioterapia e radiação)
AUTOFAGIA COMO MECANISMO SUPRESSOR TUMORAL Animais Animais Tipos de tumores desenvolvidos i. Linfomas de Células B (7) ii. Linfoma de células jovens (1) iii. Carcinoma Hepatocelular (7) iv. Linfoma de célula B (1) v. Adenocarcinoma Pulmonar (1)
AUTOFAGIA COMO MECANISMO SUPRESSOR TUMORAL
AUTOFAGIA E APOPTOSE AUTOFAGIA E ESTRESSE OXIDATIVO AUTOFAGIA E CICLO CELULAR
AUTOFAGIA E REPARO AO DNA AUTOFAGIA E SENESCÊNCIA AUTOFAGIA E DANO AO DNA
Autofagia como ALVO TERAPÊUTICO em câncer?
MODULAÇÃO FARMACOLÓGICA DA AUTOFAGIA - ATIVAÇÃO INIBIDORES ATIVADORES ATIVADORES RAPAMICINA AUTOFAGIA
Autofagia como ALVO TERAPÊUTICO em câncer? MODULAÇÃO FARMACOLÓGICA DA AUTOFAGIA - INIBIÇÃO WORTMANNIN 3-METILADENINA (3MA) BAFILOMICINA CLOROQUINA x x x H + H + H + H + H + x x x ATP
MODULAÇÃO FARMACOLÓGICA DA AUTOFAGIA - TERAPIA Desbalanço Energético + Falha Estrutural + Dano Oxidativo X CLOROQUINA Substratos para a célula MORTE CELULAR x ATP
Autofagia como ALVO TERAPÊUTICO em câncer? 2006 = 9 agentes citotóxicos indutores de autofagia AUTOFAGIA = TOXICIDADE
2011 = 22 agentes citotóxicos indutores de autofagia 9 CITOTÓXICOS 12 CITOPROTETORES 1 BYSTANDER
2013 = 50 agentes citotóxicos indutores de autofagia 15 CITOTÓXICOS 35 CITOPROTETORES
Indutores de Autofagia % de Autofagia Citoprotetora 2006 2011 2013 9 0% 22 54% 50 70%
TRIALS CLÍNICOS UTILIZANDO INIBIDORES DE AUTOFAGIA Desbalanço Energético + Falha Estrutural + Dano Oxidativo X CLOROQUINA HIDROXICLOROQUINA Substratos para a célula MORTE CELULAR x ATP
TRIALS CLÍNICOS UTILIZANDO INIBIDORES DE AUTOFAGIA DANO AO DNA =?
METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA
METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA MICROSCOPIA ELETRÔNICA
LC3-GFP METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA LC3 I GFP LC3 II GFP GFP http://www.youtube.com/watch?v=utcdmmjtqvu
WESTERN BLOT LC3 I/II RAPAMICINA 3-METILADENINA BAFILOMICINA CLOROQUINA LC3I LC3II FLUXO AUTOFÁGICO
WESTERN BLOT p62 FLUXO AUTOFÁGICO
E QUANTO AOS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS ATG???
A A E QUANTO AOS NÍVEIS DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS ATG??? Não indicam o FUNCIONAMENTO do mecanismo
METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA mrfp-gfp-lc3 (autofagossomo) mrfp-gfp-lc3 (autofagolisossomo)
mrfp-gfp-lc3 METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA TEMPO
Laranja de Acridina (AO) METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA
METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA AO Fluorescência verde (toda célula, exceto compartimentos ácidos) Fluorescência vermelha (apenas compartimentos acídicos) Sobreposição
METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA AO Fluorescência Verde Sobreposição Fluorescência Vermelha
METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA LC3-GFP mrfp-gfp-lc3 Laranja de Acridina (AO) mrfp-lc3
CO-MARCAÇÃO FLUORESCENTE - Proteínas de fusão - Marcadores químicos - Imunocitoquímica METODOLOGIAS EM AUTOFAGIA VERDE = LC3-GFP VERMELHO = MITOCÔNDRIAS (proteína da cadeia respiratória-rfp) VERDE = LC3-GFP VERMELHO = LISOSSOMOS (Lisotracker )
MANIPULAÇÃO EXPERIMENTAL DA AUTOFAGIA?
MANIPULAÇÃO EXPERIMENTAL DA AUTOFAGIA Manipulação GENÉTICA RNA de interferência 3FASES ATGs NENHUM Atg é FUNDAMENTAL à autofagia
MANIPULAÇÃO EXPERIMENTAL DA AUTOFAGIA MODULAÇÃO FARMACOLÓGICA DA AUTOFAGIA - INIBIÇÃO WORTMANNIN 3-METILADENINA (3MA) BAFILOMICINA CLOROQUINA x x x x x
MANIPULAÇÃO EXPERIMENTAL DA AUTOFAGIA MODULAÇÃO FARMACOLÓGICA DA AUTOFAGIA - ATIVAÇÃO INIBIDORES ATIVADORES ATIVADORES RAPAMICINA AUTOFAGIA
A Inibição pelo 3MA MANIPULAÇÃO EXPERIMENTAL DA AUTOFAGIA 3h x 3-METILADENINA (3MA)
A Inibição pelo 3MA MANIPULAÇÃO EXPERIMENTAL DA AUTOFAGIA
MANIPULAÇÃO EXPERIMENTAL DA AUTOFAGIA
DIFICULDADES EXPERIMENTAIS EM AUTOFAGIA i. INSTABILIDADE / DINAMISMO - autofagossomo: 30-45 min de vida! ii. SUSCEPTIBILIDADE A CONDIÇÕES EXTERNAS - ph - estresse mecânico - temperatura - O 2 iii. POUCO CONHECIMENTO MOLECULAR - Ex.: 3-MA iv. PAPEL DUAL DA AUTOFAGIA NO ORGANISMO DIFICULDADE TRANSLACIONAL
O DESENVOLVIMENTO TUMORAL CARCINOGÊNESE M1.1 CARCINOGÊNESE MORTE CELULAR SENESCÊNCIA (parada na proliferação) M1.2 (mutação não-oncogênica) DIFERENCIAÇÃO Eliminam 1 CÉLULA PRÉ- TUMORAL por HORA! MECANISMOS ANTITUMORAIS ENDÓGENOS M1, M2, M3 e M4 = mutações oncogênicas, = núcleos em mitose normal,, = núcleos em mitose anormal (INSTABILIDADE GENÉTICA) = proteínas alteradas em células tumorais (ONCOGENES) Obrigado! OBRIGADO