THIAGO FONSECA FERREIRA. ISOLAMENTO E CULTIVO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS Revisão de Literatura

THIAGO FONSECA FERREIRA ISOLAMENTO E CULTIVO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS Revisão de Literatura Goiânia 2011

ii THIAGO FONSECA FERREIRA ISOLAMENTO E CULTIVO DE CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS Revisão de Literatura Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto Qualittas de Pós- Graduação, como requisito parcial para obtenção do titulo de pós-graduado em Clínica Médica e Cirúrgica de Pequenos Animais. Nível: Especialista. Orientador: MV. MSc. Benito Juarez Nunes Alves de Oliveira EV/UFG Co-orientador: MV. MSc. Luiz Augusto de Souza EV/UFG Goiânia 2011

iii SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 1 2 REVISÃO DE LITERATURA 2 2.1 Células-tronco mesenquimais 2 2.2 Colheita de medula óssea 5 2.3 Isolamento celular 7 2.3.1 Gradiente de densidade 7 2.3.2 Determinação do rendimento e viabilidade celular 9 2.3.2 A Método de exclusão pelo azul de Trypan 9 2.3.2 B Contador eletrônico de células cell counter 11 2.3.3 Protocolos de isolamento celular 11 2.3.4 Performance inadequada no isolamento celular 13 2.4 Cultivo celular 14 2.4.1 Histórico 14 2.4.2 Tipos de culturas celulares 16 2.4.2 A Explante primário versus desagregação 16 2.4.2 B Subculturas 17 2.4.3 Ambiente de cultivo 18 2.4.3 A Substratos 18 2.4.3 B Fase gasosa 19 2.4.3 C Propriedades físico-químicas 19 2.4.3 D Condições fisiológicas 20 2.4.4 Método de tripsinização 21 2.4.5 Protocolos de cultivo celular 21 3 CONSIDERAÇÕES FINAIS 23 4 REFERÊNCIAS 24

iv LISTA DE FIGURAS FIGURA 1 Diagrama esquemático da hierarquia proliferativa das células progenitoras mesenquimais, demonstrando as duas principais divisões contendo células-tronco mesenquimais multipotentes indiferenciadas ou progenitores mesenquimais diferenciados com decrescentes origens, sendo indicado pelo triângulo. Os progenitores mesenquimais são denominados de Unidades Formadoras de Colônias (CFU), e se diferenciam em S, estroma de suporte hematopoiético; O, osteoblastos; C, condrócitos; T, tenócitos; A, adipócitos; skm, esquelético; smm, liso; cm, células musculares cardíacas; As, astrócitos; OI, oligodendrócitos; e N, neurais. A terceira divisão representa apenas os fenótipos mesenquimais maturos (Fonte: MINGUELL et. al., 2000). 3 FIGURA 2 Origem e tipos celulares derivadas das células-tronco mesenquimais (Fonte: Adaptado de POUNTOS & GIANNOUDIS, 2005). 4 FIGURA 3 Agulhas de biópsia dos tipos Jamshidi (A) e Rosenthal (B), para coleta de medula óssea (Fonte: www.cardinalhealth.com). 5 FIGURA 4 Colheita da MO em coelhos utilizando seringa de 20 ml contendo 0,1 ml de solução heparinizada (1:1000), Em A, punção da crista ilíaca e, em B do tubérculo umeral (Fonte: OLIVEIRA et al., 2006). 6 FIGURA 5 Amostra de aspirado de medula óssea após separação por gradiente de densidade. Observar o anel celular (seta azul) situado entre o plasma (A) e o gradiente ficoll (B). Sedimento de eritrócitos e granulócitos (C) (Fonte: OLIVEIRA, 2009). 8

v FIGURA 6 Câmara hemocitométrica de Neubauer. A lamínula é colocada sob a superfície da câmara e a suspensão celular depositada na câmara de contagem. Os quatro quadrantes dos extremos (1, 2, 4 e 5) e o quadrante central (3) são utilizados para a contagem das células (Fonte: Adaptado de PHELAN, 2006). 10 FIGURA 7 À esquerda, a cultura explante em frasco demonstra a migração e crescimento das células em sentido radial a partir do explante, visto no diagrama abaixo. À direita, na desagregação tecidual enzimática, as células em suspensão estão dispostas em uma monocamada, como observado no diagrama (Fonte: FRESHNEY, 2005). 16 FIGURA 8 Recipientes de cultivo celular. Placas de Petri (A), microplacas (B) e frascos de Roux (C). (Fonte: www.bdbioscience.com). 18

vi LISTA DE QUADROS QUADRO 1 Protocolos de isolamento celular adotados de acordo com a espécie e a fonte de obtenção das CTMs. 12 QUADRO 2 Principais complicações, causas e soluções para alterações no desempenho dos procedimentos de isolamento celular por gradiente de densidade ficoll. (fonte: AMERSHAM BIONSCIENCES, 2002). 13 QUADRO 3 Principais meios disponíveis no mercado para cultivo de célulastronco mesenquimais (Fonte: REYNA, 2003). 20 QUADRO 4 Protocolos de cultura de células-tronco mesenquimais nas diferentes espécies. 21

vii LISTA DE ABREVIATURAS MO medula óssea CTMs células-tronco mesenquimais CFU-F unidade formadora de colônias fibroblásticas CTHs células-tronco hematopoiéticas CT células-tronco PBS solução salina tamponada SFB soro fetal bovino DMEM meio de cultivo modificado de Dulbecco

1 1. INTRODUÇÃO Considera-se como célula-tronco um tipo especial de célula que apresenta capacidade de se renovar e originar diferentes tipos celulares especializados, não possuindo nenhuma função específica até que essa receba um sinal do ambiente, direcionando-a a diferenciação em uma célula especializada (KIRSCHSTEIN, 2001). Esses sinais incluem danos aos tecidos como: trauma, fraturas, inflamação, necrose e tumores (PALERMO et. al., 2005). Dentre as células-tronco, as mesenquimais são alvo de muito interesse em pesquisas por não apresentarem barreiras éticas, pela facilidade de obtenção e ainda por serem utlizazadas em transplantes autólogos, sendo a medula óssea a maior fonte para utilização (HUANG et al., 2004). As pesquisas atuais relacionadas à fração de células mononucleares contendo células-tronco têm apontado inúmeras possibilidades para a reparação tecidual e melhoria na qualidade dos processos regenerativos quando essas são transplantadas em número igual ou superior a 2 x 10 6 (SUTER et al., 2004). Apesar de o número limitado dessas células na cavidade medular óssea, a proliferação e expansão das mesmas, sob condições adequadas, são facilmente obtidas in vitro (KRAUS & KIRKER- HEAD, 2006). Após a demonstração de que células derivadas da medula óssea apresentam um número de linhagens celulares diferentes, incluindo algumas células responsáveis pela osteocartilogênese, diversos tipos de culturas e manutenção de tais elementos foram descritos (PEREIRA et al., 2008). Esse novo avanço no cultivo de células permitiu a formulação de uma variedade de meios de cultura, acrescidos de substâncias responsáveis pelo melhor desenvolvimento celular in vitro, possibilitando assim o cultivo de células originárias da maioria dos tecidos e órgãos (ASSIS et. al., 2002). Apesar dos avanços obtidos no emprego de células-tronco como auxiliares no tratamento de inúmeras enfermidades, muitos questionamentos ainda não foram esclarecidos. Assim, é possível argumentar que a grande preocupação acerca dos fatores de sucesso e insucesso dos procedimentos de cultura celular tem relação com o número de células obtidas nas colheitas, sua diferenciação e viabilidade nos meios utilizados (PEREIRA et al., 2008), principalmente, quando se trata das células com potencial reparador, as chamadas células-tronco mesenquimais (PROCKOP et al., 2003). Portanto, diante desse vasto campo para aplicação das células-tronco e considerando os resultados descritos pelas pesquisas científicas sobre esse assunto, em nosso meio, considera-se que o número de trabalhos publicados ainda é pequeno diante do leque de possibilidades de aplicação que se abre a cada estudo concluído, em especial como auxiliar de protocolos terapêuticos mais modernos. Na tentativa de ampliar conhecimentos e averiguar as informações mais recentes sobre o assunto, este trabalho tem como objetivo fazer uma revisão bibliográfica sobre os principais protocolos de obtenção, isolamento e cultura de células-tronco mesenquimais, fornecendo assim subsídios técnicos relevantes para a confecção e realização de protocolos de isolamento e expansão in vitro, para posterior aplicabilidade in vivo.

2 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Células-tronco mesenquimais A existência de células-tronco não-hematopoiéticas na medula óssea (MO) foi inicialmente sugerida por Cohnheim, há mais de 130 anos. No entanto, foi com os achados de FRIEDENSTEIN et al., (1966) que essa teoria foi comprovada com a descoberta das células-tronco mesenquimais (CTMs) (BITTENCOURT et al., 2006). Os autores encontraram em uma cultura de células da medula óssea uma população celular aderida ao plástico, em formato de fuso e semelhante a fibroblastos. Observaram também que essas células estavam dispostas em colônias derivadas de uma única célula precursora, conhecidas como Unidade Formadora de Colônia Fibroblásticas (CFU-F) (FRIEDENSTEIN et. al., 1966; PROCKOP, 1997). A medula óssea é composta por duas linhagens celulares distintas e dependentes, a hematopoiética e o estroma associado, que formam um sistema cooperativo. As células do estroma medular, também conhecidas como células-tronco mesenquimais, estão relacionadas à manutenção de um microambiente de preservação das células-tronco hematopoiéticas (CTHs), sendo que a progênie já diferenciada recebe os sinais necessários para a maturação celular (SCHWINDT et. al., 2005). As CTMs da MO apresentam algumas características que as distinguem das hematopoiéticas, mas ambos os tipos celulares são de fácil separação in vitro. Quando a medula óssea é dissociada e o material é colhido em um gradiente de densidade, as CTMs apresentam a propriedade de se aderir a tubos e frascos de cultura, enquanto que as CTHs não possuem essa capacidade de adesão (KIRSCHSTEIN, 2001). O cultivo de CTMs é feito selecionando-se as células com propriedade de adesão ao plástico, sendo que as células que permanecem em suspensão são facilmente removidas. Os outros tipos celulares contaminantes como os macrófagos, são eliminados após um determinado número de passagens em cultura (JAVAZON et. al., 2004). Laboratorialmente, as células mesenquimais isoladas e posteriormente expandidas podem ser conduzidas a diferenciação em múltiplas linhagens fenotípicas, quando cultivadas em meios específicos contendo fatores de crescimento ou outras substâncias como a dexametasona, indometacina, hidrocortisona e fatores de crescimento de transformação (TGF- ) (JONES et. al., 2002). As CTMs exibem ampla capacidade de diferenciação em diversas linhagens celulares, bem como a aptidão de dar origem e regenerar diversos tecidos, incluindo ossos, cartilagem, tecido adiposo, tendões e músculos (Figura 1) (POUNTOS & GIANNOUDIS, 2005). Já as CTH são utilizadas clinicamente no restabelecimento dos componentes do sangue e do sistema imunológico (KIRSCHSTEIN, 2001).

3 FIGURA 1 Diagrama esquemático da hierarquia proliferativa das células progenitoras mesenquimais, demonstrando as duas principais divisões contendo células-tronco mesenquimais multipotentes indiferenciadas ou progenitores mesenquimais diferenciados com decrescentes origens, sendo indicado pelo triângulo. Os progenitores mesenquimais são denominados de Unidades Formadoras de Colônias (CFU), e se diferenciam em S, estroma de suporte hematopoiético; O, osteoblastos; C, condrócitos; T, tenócitos; A, adipócitos; skm, esquelético; smm, liso; cm, células musculares cardíacas; As, astrócitos; OI, oligodendrócitos; e N, neurais. A terceira divisão representa apenas os fenótipos mesenquimais maturos (Fonte: MINGUELL et. al., 2000). Inicialmente as CTMs da MO foram isoladas do baço e timo. Subsequentemente, aspirados da medula óssea foram considerados por serem mais acessíveis e apresentar fontes ricas em CTMs. Atualmente, essas vêm sendo isoladas de vários locais do organismo humano e animal, incluindo cartilagem, periósteo, sinóvia, líquido sinovial, músculos e tendões (FRIEDENSTEIN et. al., 1966). Tecidos fetais, placenta, vasos sangüíneos e sangue do cordão umbilical são citadas como fontes de CTMs (HU et. al., 2003) (Figura 2). Todavia, apresentam pouca quantidade desse tipo celular comparado com a MO, além de ainda não estarem bem estabelecidas às condições ideais de cultivo (WEXLER et. al., 2003).

4 FIGURA 2 Origem e tipos celulares derivadas das células-tronco mesenquimais (Fonte: Adaptado de POUNTOS & GIANNOUDIS, 2005). As células-tronco (CT) podem ser definidas segundo três propriedades: I) auto-renovação, ou seja, capacidade de originar outra célula com características idênticas; II) habilidade de se diferenciar em mais de uma linhagem celular; e III) capacidade de originar células funcionais nos tecidos derivados da mesma linhagem (VERFAILLIE, 2002). Assim, as CT são células indiferenciadas capazes de se diferenciar originando progenitores maduros e células efetoras completamente diferenciadas (SCHWINDT et. al., 2005). As CTMs são a fonte de tecido que envolve a medula óssea e, portanto, espera-se que elas se diferenciem em células das linhagens osteogênica, adipogênica e condrogênica in vitro. Com freqüência ocorre mineralização da matriz extracelular e expressão de marcadores fenotípicos, que indicam a presença de células dessas três linhagens na cultura. No entanto, é o comportamento de linhagens clonais após transplante, e não o fenótipo observado in vitro, que define o grau de potencialidade das CTMs (BIANCO et. al., 2001). Mas nem todas as CFU-F da medula óssea apresentam de fato característica multipotencial. Analisando-se as colônias individualmente, nota-se a heterogeneidade da população em cultura relacionada à taxa de proliferação e à morfologia. Assim, sugere-se que a medula óssea seja composta pela mistura de células progenitoras diferenciadas e indiferenciadas. É importante distinguir as CT dos

5 muitos tipos de células progenitoras, de forma que as primeiras se auto-renovam por toda a vida de um organismo, enquanto as progenitoras possuem auto-renovação e potencialidade limitadas. O isolamento e conseqüente caracterização das variedades celulares presentes é dificultado pela ausência de marcadores antigênicos específicos bem estabelecidos (SCHWINDT et. al., 2005). 2.2 Colheita de medula óssea A utilização de células in natura da medula óssea tem sido reportada com sucesso no tratamento de fraturas com não união e/ou união retardada (OLIVEIRA et al.; 2006). Porém, a quantidade de CT encontradas na MO, segundo STRAUER & KORNOWSKI (2003), é de aproximadamente 0,05%. Para tanto, são necessárias alternativas para aumentar o número de células para transplante (COTTLER-FOX et al., 2003; LEE et al., 2004). As CT estão distribuídas de maneira esparsa na medula (TIEDEMAN et al., 1991), sendo que estudos de cicatrização óssea, foi constatado que a adoção de técnicas de concentração das células osteoprogenitoras favorece a osteogênese, já que a formação óssea está relacionada ao número de CT (CONNOLLY et al., 1989). A MO pode ser obtida em diversos locais, sendo a crista ilíaca a principal fonte. A colheita é realizada por meio de punção com agulha de biópsia (Figura 3 A e B) (DEL CARLO et al., 2004) ou por agulha hipodérmica (OLIVEIRA et al., 2006), não necessitando de incisão de pele, portanto ocasionando redução da perda sanguínea, ausência de dor e formação de escaras (DEL CARLO et al., 2004). FIGURA 3 Agulhas de biópsia dos tipos Jamshidi (A) e Rosenthal (B), para coleta de medula óssea (Fonte: www.cardinalhealth.com)

6 A obtenção das células se dá por meio de aspirações sucessivas, sendo os pontos de punção espaçados de 1 a 2 cm, que tem por finalidade obter pequenas quantidades em cada aspiração, prevenindo a diluição dos elementos da medula com o sangue colhido (CONNOLLY, 1995). Recomendase entre as aspirações que a seringa e a agulha sejam lavadas com 4 ml de solução salina heparinizada, com o propósito de evitar a formação de coágulos (TIEDEMAN et al., 1991). Em um estudo cientifico, a medula foi aspirada da crista ilíaca (Figura 4A) de coelhos adultos anestesiados, empregando agulha hipodérmica que foi rotacionada cuidadosamente, acoplada a uma seringa de 20 ml umedecida com 0,1 ml de solução de heparina (1:1000). Foram colhidos 2,0 a 3,0 ml por sítio, até um total de 7,0 a 10 ml por animal (CONNOLLY et al., 1989). Já OLIVEIRA, (2009) citou o tubérculo umeral como local de fácil aspiração (Figura 4B), devido a disposição anatômica da articulação escápuloumeral. O autor conclui que, a partir de amostras de menores volumes de MO, pode-se atingir um alto rendimento e viabilidade celular. A B FIGURA 4 Colheita da MO em coelhos utilizando seringa de 20 ml contendo 0,1 ml de solução heparinizada (1:1000), Em A, punção da crista ilíaca e, em B do tubérculo umeral (Fonte: OLIVEIRA et al., 2006). A utilização de heparina não é recomendada como anticoagulante, pois pode causar alterações nas propriedades tintoriais das células, sendo sugestivas de dano celular. Mais contrariando essa afirmação, diversos estudos têm demonstrado que a heparina não afeta a viabilidade das células isoladas da medula óssea (SALAMA & WEISSMAN, 1978). OLIVEIRA, (2009) e SOUZA, (2009) após colheita de 2 ml de MO do tubérculo umeral diluídos em 0,1 ml de solução salina heparinizada (5000 U/mL), constataram que os valores de viabilidade celular foram superiores á 90%. Acrescente-se que a epífise proximal da tíbia também tem sido utilizada como fonte de medula óssea. IM et al., (2001) e NISHIMORI et al., (2006), em estudos de reparos osteocondrais com CTMs em coelhos, realizaram a colheita da medula por incisão de aproximadamente 1 cm na face medial da tíbia proximal, seguida pela

7 criação de um orifício ósseo de 2 mm e aspiração de 2 ml de MO com seringa contendo 0,1 ml de heparina (3000 UI/mL). Em estudos experimentais empregando ratos e camundongos, a MO dos fêmures e tíbias pode ser coletada mediante eutanásia dos animais, limpeza dos tecidos moles adjacentes e lavagens da cavidade óssea com solução fisiológica estéril (TOGNOLI et al., 2007) ou com meio de cultivo modificado de Dulbecco (DMEM) (BITTENCOURT et al., 2006). Porém, independente da forma de obtenção, uma das estratégias utilizadas para terapia celular é baseada no princípio que uma quantidade numerosa de CT esteja presente nos aspirados de MO, para que o concentrado provoque efeitos terapêuticos benéficos, sem necessitar de cultura celular (KRAUS & KIRKER-HEAD, 2006). Contudo, pela importância atribuída às CT e sua quantidade relativamente pequena em relação as células mononucleares da medula (1:1000), as pesquisas têm sido direcionadas para seu isolamento, purificação e concentração (CONNOLLY, 1995). 2.3 Isolamento celular 2.3.1 Gradiente de densidade Em testes de histocompatibilidade, imunoensaios celulares in vitro, protocolos de cultivo celular e outros procedimentos em geral, têm sido utilizados diversos gradientes de densidade de alto peso molecular. Dentre eles estão o Ficoll-Hypaque, Histopaque, Isolymph e Nycomed, os quais apresentam a função de isolar linfócitos e células mononucleares do sangue periférico e da medula óssea (ISLAM, 1994). BOYÜM (1968) foi o primeiro pesquisador a descrever a técnica de isolamento de células mononucleares utilizando o ficoll como gradiente de densidade. Nesse estudo, o autor demonstrou que a baixa viscosidade do gradiente, comparado com outros agentes de agregação de eritrócitos, foi eficaz no isolamento in vitro de linfócitos do sangue periférico humano, a partir de centrifugações rápidas e de baixa velocidade. O gradiente de densidade ficoll tem merecido destaque, por ser de fácil aplicabilidade, rápido e favorecer a concentração de células mononucleares da MO, atingindo altos níveis de rendimento celular (KAPLAN et al., 1982; OLIVEIRA, 2009). O Ficoll-Paque 400 é uma solução aquosa com densidade de 1,077 ± 0,001 g/ml contendo 5,7g de Ficoll, 9g de diatrizoato de sódio e 0,0231g de ácido etilenodiaminotetracético para cada 100mL. Essa composição é responsável pela formação de uma solução de baixa viscosidade e alta densidade (AMERSHAM BIOSCIENCES, 2002). O princípio da técnica de separação baseia-se na densidade do gradiente em relação aos linfócitos, monócitos e plaquetas, os quais não conseguem penetrar pelo gradiente. Esses se depositam na interface entre o ficoll e o plasma, formando o chamado anel celular. A migração celular durante o processo de centrifugação com o ficoll resulta na formação de camadas contendo diferentes tipos celulares (Figura 5). A fração celular constituída de eritrócitos e granulócitos atravessam o gradiente e sedimentam no fundo dos tubos, podendo ocorrer o aprisionamento de alguns linfócitos durante a

8 agregação eritrocitária da MO a fresco. Contudo, esse processo pode ser evitado diluindo-se inicialmente o sangue, aumentando assim o rendimento celular e reduzindo a agregação das células vermelhas (AMERSHAM BIOSCIENCES, 2002). As principais soluções para a diluição da MO são a solução salina tamponada (PBS) (OLIVEIRA, 2009) e meios de cultivo modificados (CURY, 2005), podendo este último ser suplementado com soro fetal bovino (SFB) a 10% (BITTENCOURT et al., 2006). A amostra de medula óssea diluída é, em seguida, depositada lentamente sobre o gradiente de densidade de separação de células (CURY, 2005; OLIVEIRA, 2009). Outro fator a ser considerado é a temperatura de centrifugação. A agregação eritrocitária é favorecida em altas temperaturas (37ºC), enquanto que em baixas (4ºC), a taxa de agregação é reduzida, porém, o tempo de separação é aumentado, o qual também reduz o rendimento celular. Uma temperatura de 18-20ºC geralmente fornece bons resultados no processo de isolamento (AMERSHAM BIOSCIENCES, 2002). FIGURA 5 - Amostra de aspirado de medula óssea após separação por gradiente de densidade. Observar o anel celular (seta azul) situado entre o plasma (A) e o gradiente ficoll (B). Sedimento de eritrócitos e granulócitos (C) (Fonte: OLIVEIRA, 2009). Após o processo de centrifugação, o plasma sobrenadante é desprezado utilizando-se pipeta de Pasteur e o anel celular é removido e transferido para outro tubo. Lavagens subseqüentes são

9 recomendadas com soluções salinas balanceadas, com a finalidade de remover o remanescente de plasma, plaquetas e a solução de ficoll (AMERSHAM BIOSCIENCES, 2002). Os procedimentos de lavagem pelos métodos padrões de isolamento geralmente são eficientes na remoção das plaquetas do botão celular. Caso as plaquetas estejam presentes, pode-se realizar a centrifugação com gradiente de sucrose a 4-20% (PERPER et al., 1968), bem como com adenosina-5-difosfato (ADP) após a separação dos linfócitos (VIVES et al., 1971), os quais auxiliam na remoção do remanescente. O rendimento e a diminuição da pureza dos linfócitos dependem consideravelmente da eficácia na remoção das células vermelhas. Diversos produtos comerciais estão disponíveis como a solução de lise FACS (NAKAGE et al., 2009) e/ou preparadas em laboratório, como o cloreto de amônio 0,16 M em solução de Tris 0,17 M, ph 7,6, recomendando-se diluir 1mL ao botão celular isolado e manter em repouso durante cinco minutos. O tampão de lise, segundo estudos, favorece a contagem das células na câmara hemocitométrica de Neubauer, reduzindo as falhas na determinação do rendimento celular (OLIVEIRA, 2009). 2.3.2 Determinação do rendimento e viabilidade celular No momento que a integridade da membrana celular foi rompida, em um processo de morte celular como exemplo, a viabilidade de tais células estaria, por conseqüência, comprometida (BACSÓ et al., 2000). Existem atualmente vários testes para a determinação da integridade celular. Um deles é o método do azul de Trypan, um corante que tem a capacidade de penetrar no interior da célula, cuja membrana esteja rompida. Tal teste é largamente empregado devido a sua praticidade, porém possui o inconveniente de produzir artefatos na penetração do corante, comprometendo a sua determinação (MASCOTTI et al., 2002). Há protocolos alternativos ao azul de Trypan, como aqueles baseados na citometria de fluxo, os quais utilizam uma combinação de marcadores, como a Anexina, uma proteína que possui afinidade pelos fosfolipídios expostos pela membrana celular, e o corante 7-AAD, o qual penetra no interior da célula, fornecendo informações acerca da formação de poros da membrana celular (HÖPPNER et al., 2002). Esses métodos de determinação do rendimento e viabilidade celular precisam ser o mais confiável possível, a fim de refletirem o estado de integridade da membrana, uma vez que o sucesso de um transplante celular depende dessa integridade, a fim de que as células possam colonizar a área afetada em uma determinada lesão, interagindo com as demais células do hospedeiro e recuperando o tecido lesado (CURY, 2005). A ) MÉTODO DE EXCLUSÃO PELO AZUL DE TRYPAN (PHELAN, 2006) Materiais Etanol (v/v) a 70%; Suspensão celular; Azul de Trypan a 0,4%; Câmara hemocitométrica de Neubauer com lamínula; Contador manual; Pipeta de Pasteur; Microscópio.

10 Preparação da Câmara 1. Limpe a superfície da lâmina da câmara e da lamínula com álcool a 70%; 2. Limpe os cantos da lamínula com água destilada e coloque-a sobre a câmara, recobrindo a área de contagem prateada. Procedimento 3. Realize a diluição 1:1 da suspensão celular com azul de trypan a 0,4%. Pode ser diluído posteriormente com PBS caso necessário; 4. Suspender as células cuidadosamente com uma pipeta de Pasteur; 5. Cubra a câmara hemocitométrica com uma lamínula, e deposite a suspensão celular da pipeta pela extremidade em forma de V entre a câmara e a lamínula. Repita a operação do outro lado. É importante não preencher excessivamente a câmara, apenas a quantidade necesária para que o soluto possa fluir pela superfície, pela ação de capilaridade; 6. Coloque a câmara no microscópio; 7. Inicialmente, focalize as linhas da câmara em menor aumento; 8. A hemocitômetro consiste de nove quadrantes de 1mm, as quais são divididas em 25 quadrantes menores. Com uma objetiva x 10 e contador manual, deve-se quantificar as células presentes nos quadrantes 1 a 5 (Figura 6). Lamínula grade Depositar a suspensão celular 1mm FIGURA 6 Câmara hemocitométrica de Neubauer. A lamínula é colocada sob a superfície da câmara e a suspensão celular depositada na câmara de contagem. Os quatro quadrantes dos extremos (1, 2, 4 e 5) e o quadrante central (3) são utilizados para a contagem das células (Fonte: Adaptado de PHELAN, 2006).

11 Cálculo do rendimento celular 9. Determina as células/ml pelo seguinte cálculo: células/ml = média contada por quadrante x fator de diluição x 10 4 total de células = células/ml x volume total da suspensão celular da amostra; O número 10 4 é o fator de correção do volume do hemocitômetro: cada quadrante é 1/1mm e a profundidade é 0,1mm. Cálculo da viabilidade celular 10. Contar o número de células totais da amostra e o número de células viáveis (não coradas) (Figura 7). Calcular a porcentagem de viabilidade pela seguinte fórmula: % viabilidade celular = nº células viáveis x 100 nº células totais B) CONTADOR ELETRÔNICO DE CÉLULAS - CELL COUNTER É um dispositivo capaz de contar e medir partículas em suspensão. Esse sistema é formado por dois eletrodos e um amplificador, os quais registram e transmitem as oscilações na resistência a passagem das células pelo orifício, armazenando e analisando os dados em seguida (REYNA, 2003). 2.3.3 Protocolos de isolamento celular No quadro 1 estão especificados diferentes protocolos de isolamento recomendados pela literatura, variando quanto a espécie e fonte de obtenção das CTMs, bem como seus resultados de rendimento e viabilidade celular.

12 QUADRO 1 Protocolos de isolamento celular adotados de acordo com a espécie e a fonte de obtenção das CTMs. AUTORES ESPÉCIE FONTE PROTOCOLOS - Colheita de 2mL de MO diluído em 0,1mL de solução fisiológica heparinizada (5000UI), diluído em PBS (1:1). - Centrifugação em gradiente Ficoll OLIVEIRA, 2009 Coelhos MO* 1,077g/mL (diluição 2:1) a 495g, durante 30 min a 15ºC. - Lavagens com PBS e DMEM baixa glucose suplementado com soro fetal bovino 10%, 493g durante 10 minutos a 4ºC. - Rendimento: 6,25 x 10 6 células/ml - Viabilidade: 93,56% OLSSON et al., 2009 Canina MO - Colheita de 10ml/kg MO em bolsas de coleta contendo 0,1mL de heparina (10000UI). - Centrifugação a 440g, na diluição 1:1 com gradiente Histopaque 1,077g/mL, temperatura entre 18-26ºC. - Lavagens celulares com solução salina 0,9%, DMEM e soro sanguíneo autólogo estéril, a 440g durante 5 minutos. - Rendimento: 2,57 x 10 6 células/ml - Viabilidade: 96, 72% - Gordura subcutânea fragmentada e lavada com PBS 2%. - Digestão enzimática com colagenase PEREIRA et al., 2008 Coelhos TA** (2mg/mL), DMEM, BSA (20mg/mL) penicilina e estreptomicina, durante 50 minutos a 37ºC. - Bloqueio enzimático com SFB - Pellet diluído em DMEM e SFB a 10%

13 - Lavagem para colheita da MO com 10mL de meio Knockout DMEM e DMEM-alta BITTENCOURT et al., 2006 Ratos MO concentração de glucose. - Centrifugação a 1200rpm por 10 minutos. - Rendimento: 6 x 10 6 células/ml - Viabilidade: >95% * MO Medula óssea ** TA Tecido adiposo 2.3.4 Performance inadequada no isolamento celular Segundo OLSSON et al., (2009), o maior desafio da manipulação celular é a preservação das características funcionais e a manutenção da viabilidade das células. Muitos problemas podem estar relacionados ao processo de isolamento celular, reduzindo assim as taxas de rendimento, bem como a viabilidade das células mononucleares. As principais complicações relacionadas ao processo de isolamento por gradiente de densidade estão listadas no quadro 2. QUADRO 2 Principais complicações, causas e soluções para alterações no desempenho dos procedimentos de isolamento celular por gradiente de densidade ficoll. ALTERAÇÕES NO PRINCIPAL CAUSA DO COMENTÁRIOS DESEMPENHO PROBLEMA Células vermelhas aumentadas e contaminação dos linfócitos Baixo rendimento e viabilidade de linfócitos A. Temperatura muito baixa B. Baixa velocidade de centrifugação e/ou tempo de centrifugação muito curto. Temperatura muito alta A densidade do ficoll é grande em baixas temperaturas e as células vermelhas são menos agregadas. Contudo, granulócitos e eritrócitos são impedidos de atravessar a camada de ficoll. Mantenha a temperatura entre 18-20ºC. Adequado tempo e força g devem ser utilizados para promover completa sedimentação das células não linfóides. O gradiente ficoll é menos denso em altas temperaturas, e alguns linfócitos podem penetrar no gradiente. A

14 Baixo rendimento de linfócitos com viabilidade normal Baixo rendimento com aumento da contaminação de granulócitos Baixo rendimento e viabilidade de linfócitos com contaminação por outros tipos celulares Sangue não diluído 1:1 com solução salina balanceada; incomum alto hematócrito Vibração do rotor da centrífuga, misturando o gradiente Amostra contém células com densidade diferentes viabilidade celular pode também ser afetada. Uma alta densidade celular resulta em um grande número de linfócitos aprisionados pelos agregados de células vermelhas. Deve-se diluir a amostra previamente. Vibrações podem causar um alargamento da banda de linfócitos, misturando-se a outras células. Verifique se o rotor está corretamente balanceado Pode ser encontradas em amostras patológicas, amostras de sangue não humanas ou de outras fontes que não o sangue periférico. Nesses casos, podese utilizar o gradiente Percoll para separação de células Fonte: AMERSHAM BIONSCIENCES, 2002 2.4 Cultivo celular 2.4.1 Histórico O cultivo de tecidos se desenvolveu a partir dos últimos anos do século XIX, como uma continuação das técnicas de embriologia. Wilhem Roux, em 1885, manteve células do embrião de aves em solução salina durante alguns dias. Porém, o zoólogo Ross Harrison é considerado o pioneiro no cultivo de tecidos animais. Harrison, em 1907, empregou técnicas in vitro para o estudo de fenômenos in vivo, realizando cultivos de medula espinhal embrionária de anfíbios. Pôde observar o crescimento dos axônios dos neuroblastos e estabeleceu que o axônio se formava por expansão, a partir do corpo neuronal e não pela fusão de uma cadeia de células (REYNA, 2003). Inicialmente, a primeira limitação para o estabelecimento de cultivos era desenvolver um meio nutritivo adequado. Burrows, em 1910, utilizou plasma de aves para nutrir explantes de tecidos embrionários e provou ser um método eficaz o qual lhe permitiu observar o crescimento de tecido nervoso, coração e pele. Neste mesmo ano, Burrows e Carrel realizaram os primeiros intentos de estabelecer cultivos de células de mamíferos e conseguiram manter explantes obtidos a partir de cães, gatos e coelhos, assim como no crescimento de tumores sólidos. Demonstraram que se pode prolongar

15 a vida do cultivo mediante subculturas. Os meios empregados foram plasma suplementado com extratos de embrião. Em 1916, Rous e Jones utilizaram, pela primeira vez, extratos enriquecidos em tripsina para dissociar células embrionárias, estabelecendo o primeiro cultivo celular. Um dos maiores problemas constatados no cultivo foi o aparecimento de múltiplas contaminações e se desenvolveram numerosos métodos de manipulação em condições assépticas, que ainda são utilizadas até hoje (FRESHNEY, 2005). Em 1913, Carrel demonstrou a possibilidade de manter em cultivo células extraídas de embrião de aves, por um período de tempo superior à vida deste. Manteve em cultivo células de aves durante 34 anos, o que só foi possível pela utilização do frasco de Carrel (SONDAHL & SHARP, 1977). Entre os anos de 1920 e 1940, foram desenvolvidas diferentes estratégias de obtenção de cultivo e a manutenção das condições estéreis, mas sem grandes avanços. A partir dos anos 40, com o surgimento dos primeiros antibióticos, se desenvolveram numerosas aplicações dentre as quais se podem destacar: (REYNA, 2003). EARLE et al., (1948) isolaram células da linha celular L e mostraram que eram capazes de formar clones no cultivo de tecidos, mediante a alimentação com nutrientes corretos; GEY et al., (1952) estabeleceram a primeira linha celular contínua, atualmente conhecidas como células HeLa. O meio empregado era extremamente complexo e pouco definido: plasma de aves, extrato de embrião bovino e soro do cordão umbilical de humanos; COHEN et al., (1954) constataram que o fator de crescimento nervoso estimula o crescimento de axônios em cultivo de tecidos; EAGLE (1955) realiza a investigação sistemática sobre os requerimentos nutritivos das células em cultivo. Cita que as soluções corporais completas podem ser satisfatórias ao cultivo, como o soro eqüino a 1% em um meio com aminoácidos e açúcares; HAYFLICK & MOORHEAD (1961) foram os pioneiros na utilização de antibióticos para prevenir a contaminação de cultivos de fibroblastos. HAM (1965) introduziu o primeiro meio livre de soro capaz de manter algumas células de mamíferos em cultivo; AUGUSTI-TOCCO & SATO (1969) obtiveram a primeira linhagem celular estável a partir de neuroblastomas, e observaram que esses eram eletricamente excitáveis; KOHLER & MILSTEIN (1975) detectaram a primeira linhagem celular produtora de anticorpos monoclonais; HAYASHI & SATO, (1976) publicaram trabalhos que demonstram que as diferentes linhagens celulares requerem misturas distintas de hormônios e fatores de crescimento, para se desenvolverem em meios livres de soro.

16 2.4.2 Tipos de Culturas Celulares A) EXPLANTE PRIMÁRIO VERSUS DESAGREGAÇÃO Quando as células são isoladas do tecido do doador, elas podem ser mantidas sob diversas formas. Um pequeno fragmento de tecido que se adere à superfície de crescimento, seja espontâneo ou por auxílio mecânico, como os coágulos ou uma matriz extracelular constituinte (colágenos), geralmente dão suporte ao crescimento celular. Esse tipo de cultura é conhecido com um explante primário e as células que migram do tecido são células em crescimento (Figura 8). Essas são selecionadas, no primeiro instante, pela sua habilidade em migrar do explante e subseqüentemente, se subcultivadas, pela habilidade de proliferação. Quando uma amostra de tecido é desagregada, seja mecânica ou enzimaticamente, forma-se uma suspensão de células e pequenos agregados capazes de se ligarem a um substrato sólido, formando uma monocamada (Figura 8). As células da monocamada com capacidade de se proliferar são então selecionadas da primeira subcultura e, como as do explante primário, possivelmente originam uma linhagem celular. A desagregação tecidual é capaz de produzir largas culturas com mais rapidez que a cultura explante, porém esta última pode ser preferida quando são obtidos pequenos fragmentos de tecidos ou quando a fragilidade das células impede sua sobrevivência após a desagregação (FRESHNEY, 2006). FIGURA 7 À esquerda, a cultura explante em frasco demonstra a migração e crescimento das células em sentido radial a partir do explante, visto no diagrama abaixo. À direita, na desagregação tecidual enzimática, as células em suspensão estão dispostas em uma monocamada, como observado no diagrama (Fonte: FRESHNEY, 2005).

17 A vantagem dessas culturas é que, quando são recentemente removidas da sua situação in vitro, espera-se que as suas características funcionais se assemelhem a das células in vivo. Como desvantagens, são citadas as reações das culturas as mudanças do ambiente nos primeiros dias ou semanas in vitro, os danos e sua recuperação durante a remoção das células do animal e por fim, as alterações na composição da cultura ocasionadas por células de culturas mistas que morrem e outras que proliferam e/ou diferenciam (MATHER & ROBERTS, 1998). Na desagregação, o tecido passa pelos estágios de lavagem, dissecação, e ainda desagregação mecânica ou digestão enzimática em tripsina e/ou colagenase. Este geralmente é requerido não para se ter uma suspensão celular simples, pois muitas células primárias sobrevivem melhor em pequenos agregados (FRESHNEY, 2006). A desagregação tecidual contém uma variedade de diferentes tipos celulares, sendo necessária a utilização de técnicas de isolamento como por gradiente de densidade de separação (PRETLOW & PRETLOW, 1989), ou imunotipagem em vidrarias magnetizadas, utilizando frascos com magneto positivo para se selecionar as células de interesse (CARR et. al., 1999) ou negativos para eliminar as células indesejadas (SAALBACH et. al., 1997). A população celular deve ser enriquecida posteriormente por meios de cultivos adequados, dos quais estão disponíveis comercialmente (FRESHNEY, 2006). B) SUBCULTURAS As subculturas podem ser requeridas periodicamente, com a intenção de promover nova fonte de nutrientes e espaço para o crescimento contínuo das linhagens celulares. A freqüência de subcultura, a proporção de semeadura e a densidade de células plaqueadas dependem das características de cada linhagem celular. Caso as células sejam rompidas com freqüência ou são plaqueadas a uma baixa densidade, essas podem não se desenvolver sob cultivo. Com isso, diferentes tipos celulares podem ser selecionados ao crescimento, quando se trata de culturas mistas (MATHER & ROBERTS, 1998). Nas subculturas, deve-se realizar a remoção do meio de crescimento, lavagem da placa, dissociação das células aderentes pela tripsina e diluição da suspensão celular em meio fresco, método este conhecido como passagem. As trocas do meio devem ser feitas quando as células atingirem aproximadamente 70% de confluência com o substrato, ou seja, aderidas as placas ou frascos de cultura (PEREIRA et al., 2008). As passagens celulares para novos recipientes de cultura podem ser realizadas inúmeras vezes, com o objetivo de se obter um rendimento expressivo de células (FRESHNEY, 2006). Caso a subcultura seja feita em soro e a proporção de semeadura seja alta, não se faz necessária a remoção da tripsina residual. Entretanto, em culturas mantidas em meios livres de soro, deve-se neutralizar a enzima utilizando um inibidor de protease, como o inibidor de tripsina soybean (MATHER & ROBERTS, 1998). Espera-se que, nos primeiros dias de subcultura, as CTMs da MO apresentem um formato arredondado e refringência, e que, com o passar do tempo, elas adquiram uma aparência fibroblástica (Figura 9, A e B) (BOURIN et al., 2008).

18 2.4.3 Ambiente de cultivo Para o cultivo celular são utilizados meios artificiais, preparados mediante a mescla de componentes purificados ou de soluções orgânicas completas, instrumentos que mantêm as condições físico-químicas adequadas e recipientes que isolam as células do meio externo. Por este fato, considera-se que o meio de cultivo é formado por quatro elementos: (1) a natureza do substrato onde as células crescem; (2) a natureza e composição da fase gasosa; (3) as condições físico-químicas e fisiológicas do meio e (4) as condições de incubação, como a temperatura e a umidade (REYNA, 2003). A) SUBSTRATOS Os principais materiais empregados como substratos são: a. Vidros tem como vantagem o custo baixo, ser de fácil limpeza e esterilização e de boa qualidade óptica, facilitando a observação ao microscópio. b. Plástico descartável O plástico mais utilizado é o de poliestireno, que possui boa qualidade óptica. Por ser de característica hidrofóbica, requer tratamento por irradiação gama, química ou por descargas elétricas. Estão disponíveis em diversos tipos de recipientes: Placas de Petri: disponíveis em tamanhos de 3,5, 6 e 10 cm de diâmetro. Por serem ventiladas, não é recomendada para a manutenção das linhagens celulares (Figura 10A). Multiplacas: placas que contém de 6 a 96 poços (Figura 10B). Frascos de Roux: podem ser ventilados ou não, disponíveis em diversos tamanhos. São muito utilizados para o crescimento e manutenção de linhagens celulares (Figura 10C). FIGURA 8 Recipientes de cultivo celular. Placas de Petri (A), microplacas (B) e frascos de Roux (C). (Fonte: www.bdbioscience.com )

19 B) FASE GASOSA Os componentes mais significativos da fase gasosa são o oxigênio e o dióxido de carbono. As necessidades de oxigênio para a maioria dos cultivos celulares é gerada pela tensão atmosférica, porém, há outros que necessitam de uma tensão de oxigênio superior (95%), possivelmente pela dificuldade de difusão do gás em seu interior (REYNA, 2003). O dióxido de carbono tem um importante papel na regulação do ph e na quantidade de íons HCO3 -. Um incremento nas concentrações de íon bicarbonato associada a uma adequada tensão de oxigênio, promovem a estabilização do ph em 7,4 (FRESHNEY, 2006). Os cultivos com baixa densidade e em um recipiente aberto precisam de uma atmosfera de CO 2, cuja concentração esteja em equilíbrio com o bicarbonato de sódio do meio. Em concentrações celulares muito reduzidas, é necessário acrescentar dióxido de carbono quando os frascos são fechados. Todavia, quando a densidade celular é mais elevada, possivelmente não seja necessário acréscimo de CO 2 em frascos fechados, mas deve ser acrescido em frascos abertos (REYNA, 2003). C) PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS ph e capacidade de tamponamento: o ph ótimo de crescimento para a maioria dos tipos celulares é de 7,4, ainda que existam pequenas variações. Algumas linhagens normais de fibroblastos crescem melhor entre ph 7,4 e 7,7, e já as células diferenciadas na margem de ph 7,0 a 7,4. O meio de cultivo deve ser tamponado, a fim de evitar alterações bruscas de ph. A solução tampão mais utilizada é o bicarbonato, pelo seu baixo custo e toxicidade, além de trazer benefícios nutricionais para o cultivo (EAGLE, 1973). Osmolaridade: as células geralmente tem uma ampla tolerância a osmolaridade do meio, crescendo bem entre 260 e 320 mosm/kg, podendo ocorrer variações de acordo com a espécie. É recomendado empregar meios ligeiramente hipotônicos para compensar a evaporação durante o período de incubação, principalmente em estufas sem controle da umidade ambiente (FRESHNEY, 2006). Temperatura: tem grande influência na taxa de crescimento das células, e deve ser controlada durante o período de incubação. Recomenda-se ajustar o ph do meio 0,2 unidades abaixo do ótimo, a temperatura ambiente (37ºC). Também se pode preparar o meio completo acrescido de soro, deixar equilibrar na estufa e depois ajustar o ph, antes de acrescentá-las ao cultivo (FRESHNEY, 2006). Viscosidade: tem pouca influência no crescimento das células, porém, é importante na redução dos danos celulares pela agitação do cultivo (quanto maior a viscosidade, menor os danos) e na

20 tripsinização. Pode-se aumentar a viscosidade, especialmente em meios livres de soro, acrescentando carboxi-metil-celulose ou polivinilpirrolidona (BIRCH & PIRCH, 1971). Tensão superficial: a tensão deve ser mantida baixa. Em geral, observa-se alterada quando há a formação de espumas nos cultivos pelo borbulhamento de CO 2, levando a uma desnaturação de proteínas e incrementando os riscos de contaminação. Recomenda-se utilizar um agente anti-espumante de silicone (REYNA, 2003). D) CONDIÇÕES FISIOLÓGICAS A principal dificuldade para o estabelecimento das linhagens celulares é de se obter meios nutritivos adequados, que sejam capazes de reproduzir o meio natural como extratos embrionários, hidrolizados de proteínas e soros (FRESHNEY, 2006). Depois de anos de investigação sobre a composição dos meios, a seleção deste ainda permanece empírica (REYNA, 2003). Alguns meios de cultivo disponíveis comercialmente estão listados no quadro 3. QUADRO 3 Principais meios disponíveis no mercado para cultivo de células-tronco mesenquimais. Nome comercial Meio Basal de Eagle (BME) Meio Mínimo Essencial de Eagle (MEM) Meio MEM modificado por Dulbecco (DMEM) Descrição Meio contendo apenas aminoácidos essenciais. Necessita ser suplementado com soro fetal bovino a 10%. Contém mais aminoácidos e em maior concentração que o BME. Requer suplementação com SFB. Contém quatro vezes a concentração de aminoácidos e vitaminas que o BME. Meio DMEM modificado por Iscove (IMDM) Meio completo que inclui na formulação albumina bovina, transferrina, selênio, e outros. Requer suplementação com SFB. Meio F-10 de Ham Meio que pode ser suplementado com proteínas e hormônios. Contém metais como o ferro, cobre e zinco.

21 Meio F-12 de Ham Fornece suplementação protéica as células. Pode ter seu uso combinado ao IMDM Fonte: REYNA, 2003 2.4.4 Método de tripsinização A maior parte das células que se mantém em cultivos de desagregação tecidual precisa estar aderida ao substrato (frascos e placas de cultivo) para o seu desenvolvimento e manutenção. Para se resuspender essas células, deve-se realizar a desagregação mecânica ou digestão enzimática, empregando o método de tripsinização (FRESHNEY, 2006). REYNA (2003) descreveu que para a maioria das linhagens celulares, após as trocas do meio de cultivo, deve-se utilizar tripsina 0,01 a 0,5% diluída em solução salina tamponada (PBS), e mantidas em estufa a 37ºC durante 5 a 15 minutos. 2.4.5 Protocolos de cultivo celular No quadro 4 estão alguns protocolos de cultura de CTMs recomendados na literatura, de acordo com a espécie em questão. QUADRO 4 Protocolos de cultura de células-tronco mesenquimais nas diferentes espécies. AUTORES ESPÉCIE FONTE PROTOCOLOS - Coleta de 9mL MO diluída em 1mL solução salina heparinizada (1000U/mL). - Adição de DMEM (2:1) suplementado com SFB 10%, penicilina G (100U/mL), estreptomicina (0,1mg/mL), anfotericina B (0,25µg/mL). - Separação por gradiente percoll (1,073g/mL), BRUDER et al., lavadas e plaqueadas 10 7 células/frasco. Canina MO 1998 - Incubadas em estufa 5% CO 2 a 37ºC - Troca do meio realizado no 4º dia do cultivo, e após duas vezes por semana. Passagens realizadas no 9º, 10º e 11º dias de cultivo, por replaqueamento de 8 x 10 3 células/cm 2. - Total de 3 x 10 7 células transplantadas. HUANG et al., 2005 Humanos MO - Coleta 5 8mL MO diluída em heparina (100U). - Adição de DMEM suplementado com SFB 10%,

22 TA produzindo a suspensão celular por centrifugação. - Resuspenso em 5mL de DMEM e SFB 10%. - Separação por gradiente percoll (70% de densidade inicial). - TA foi macerado e lavado duas vezes em PBS. - Digestão enzimática com colagenase 0,075% e centrifugação para a obtenção da suspensão celular. - Plaqueadas 1 x 10 6 células/frasco. IM et al., 2001 Coelhos MO - Ambas cultivadas em monocamadas na estufa 5% CO 2 a 37ºC, até atingir confluência de 80%, - Remoção das células aderentes com tripsina 0,25% - Amostra de 2mL MO diluída em 0,1mL heparina (3000UI). - Separação por gradiente ficoll (0,7mL), 200g por 15 minutos. - Lavagens tripla em meio Ham F-12 200g por 5 minutos. - Cultivo em meio Ham F-12 suplementados com SFB 10%, penicilina G (100U/mL), estreptomicina (0,1mg/mL), anfotericina B (0,25µg/mL), estufa 5% CO 2 em frascos de cultura de 25 cm 2. - Meio trocado a partir do 3º dia, e após todos os dias até o 20ºdia. - Remoção das células aderentes com tripsina 0,25% e 0,001M EDTA, 3 lavagens em meio Ham F-12 e contagem das células em hemocitômetro. - O número médio de células foi de 3,4 (±1,5)x 10 6 antes e 2,3 (±0,6)x10 6 após a cultura. MO Medula óssea, TA Tecido adiposo, SFB Soro fetal bovino, PBS solução salina tamponada

23 3. CONSIDERAÇÕES FINAIS O desenvolvimento tecnológico e científico crescente das instituições de ensino e, principalmente das empresas voltadas a produção de materiais para cultivo de células, têm auxiliado os pesquisadores na obtenção de protocolos de isolamento e de culturas mais eficazes. Esses materiais, como as estufas com controle de temperatura e umidade, frascos e meios de cultivo, buscam fornecer um ambiente in vitro adequado as células, assemelhando-se as condições in vivo, para que essas possam se proliferar e diferenciar em linhagens celulares específicas. Nesta revisão observou-se que as células-tronco mesenquimais com potencial reparador podem ser obtidas, isoladas e expandidas de diferentes formas e condições, devido a diversidade dos protocolos de isolamento e cultura existentes. Essa diversidade traz benefícios relacionados ao desenvolvimento de procedimentos que forneçam alto rendimento e viabilidade das células mesenquimais, aumentando assim o número de células finais transplantadas. Atualmente, o foco chave para a elaboração de pesquisas científicas tem sido acerca do mecanismo de diferenciação in vitro das células-tronco cultivadas em laboratório. Para isso, têm-se utilizado em associação substâncias exógenas como os fatores de crescimento, dentre os quais estão às proteínas morfogenéticas ósseas (BMP), fatores de crescimento fibroblásticos (FGF), fatores de crescimento neurotróficos (NGF), e outros. Espera-se que, no futuro próximo, as vias de sinalização para a diferenciação celular sejam melhor compreendidas, possibilitando o controle, direcionamento e diferenciação em células com capacidade de regenerar tecidos lesados.