Ciência Animal, 13(2):79-87, 2003 PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES OVINOS (In vitro production of sheep embryos) Juliana Bezerra LIMA VERDE, Davide RONDINA & Vicente José de Figueirêdo FREITAS Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução/FAVET/UECE RESUMO Nos últimos anos, tem ocorrido um crescente interesse nas tecnologias de produção in vitro (PIV) de embriões para uma mais rápida disseminação de germoplasma superior em ovinos, devido a problemas encontrados nos programas de superovulação e transferência de embriões nesta espécie. Embora a eficiência da PIV tenha aumentado, o número de embriões e o desenvolvimento a termo ainda continuam baixos. Este trabalho revisa o progresso obtido na otimização da maturação in vitro (MIV), fecundação in vitro (FIV) e sistemas de cultivo in vitro (CIV) em ovinos. A aquisição de um maior número de informações sobre a maturação de oócitos e os requerimentos para cultivo nesta espécie tornam-se críticos para otimizar a eficiência de técnicas modernas de reprodução. PALAVRAS-CHAVE: Ovino; embrião; produção in vitro. ABSTRACT In recent years, there has been an increasing interest in in vitro embryo production (IVP) technologies for faster propagation of superior sheep germplasm because of some problems with superovulation and embryo transfer programs in this species. In spite of the improvement in IVP, number of embryos and development to term are still low. This paper reviews the progress made in optimizing the in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF), and in vitro culture (IVC) systems in sheep. The acquisition of more information on oocyte maturation and culture requirements for this species is critical to optimize the efficiency of advanced reproductive strategies. KEY WORDS: Sheep; embryo; in vitro production. INTRODUÇÃO A indústria de produtos de origem ovina é afetada primariamente pela qualidade e disponibilidade de alimento, pelo manejo dispensado aos animais e pela sua genética. Aliado a estes fatores, destaca-se também a eficiência reprodutiva, que é um ponto crítico em sistemas de produção de carne, pele ou lã. Contudo, no Brasil, esse aspecto é insatisfatório devido às condições desfavoráveis às quais muitos animais são submetidos. Em contrapartida, há uma forte demanda dos produtos de origem ovina pelos mercados interno e externo. *Endereço para correspondência Faculdade de Veterinária/Universidade Estadual do Ceará Av. Paranjana, 1700 60.740-000 Fortaleza,CE Para reduzir a distância entre a demanda e a produção é necessário aumentar os índices reprodutivos e promover o progresso genético na espécie. No entanto, a produção de um grande número de animais de qualidade superior, em um curto espaço de tempo, torna-se de difícil execução através do uso das técnicas reprodutivas convencionais. Técnicas recentes têm possibilitado novas maneiras de acelerar o ganho genético e aumentar o potencial produtivo de ovinos. Dentre essas técnicas, destacam-se a inseminação artificial (IA) e a transferência de embriões (TE). Mais recentemente, a produção in vitro (PIV) de embriões apresentou-se como mais uma alternativa para o aumento do potencial reprodutivo de ovinos (WANG et al., 1998), caprinos (IZQUIERDO et 79
Figura 1. Colheita de oócitos através de ovum pick-up (OPU), guiada por ultra-sonografia, em pequenos ruminantes (Adaptado de GRAFF et al., 1999). blastocistos (ARLOTTO et al., 1992). A maioria dos pesquisadores trabalham selecionando oócitos de acordo com os critérios propostos por LEIBFRIED & FIRST (1979) para a espécie bovina, que classificaram essas estruturas em: a) Excelente (classe I): cumulus e corona radiata completos e citoplasma homogêneo; b) Bom (classe II): mais de duas camadas de células do cumulus; c) Regular (classe III): uma camada de células do cumulus ou cumulus incompleto; d) Ruim (classe IV): sem células do cumulus e/ ou oócito degenerado. Em ovinos, resultados obtidos utilizando a técnica de recuperação oocitária por OPU foram descritos por TERVIT (1996). Quando a mesma é realizada 24 horas após o final do tratamento gonadotrófico, uma média de seis oócitos por ovelha são selecionados para FIV, resultando em 1,1 blastocisto (BALDASSARE et al., 1996). KÜHHOLZER et al. (1997) obtiveram uma taxa de colheita de oócitos de 67,9% quando utilizaram a OPU para recuperação oocitária. Já ALBERIO et al. (2002), utilizando a mesma técnica, obtiveram uma taxa de colheita de 33,6%. Maturação in vitro A aquisição da competência de desenvolvimento do oócito ocorre continuamente ao longo da foliculogênese e a influência do tamanho e da atresia folicular na competência do desenvolvimento foram revistos por MERMILLOD et al. (1999). Contudo, dada a heterogeneidade natural dos oócitos imaturos utilizados para PIV, a maturação oocitária pode ser influenciada, dentre outros fatores, pelos componentes do meio e as várias condições de cultivo (COGNIÉ et al., 2003). Durante o período de maturação, muitas mudanças na organização do citoplasma são observadas, tais como um contínuo aumento do estoque lipídico, redução do complexo de Golgi, rearranjo das motocôndrias e alinhamento dos grânulos corticais ao longo do oolema. O aumento do estoque lipídico está provavelmente relacionado com o pool energético para o oócito suportar o desenvolvimento após a fecundação até o estádio de blastocisto (MERMILLOD et al., 1999). Diferentes fontes de gonadotrofinas exógenas, tais como FSH e LH (COGNIÉ et al., 1991), hmg (WANI et al., 2000), ecg (MUZARMADIEV et al., 1983) ou hcg e estradiol (SHORGAN et al., 1990), são utilizadas no meio de maturação de oócitos ovinos. No entanto, a adição de hormônios ainda é uma controvérsia, pois alguns trabalhos não encontraram diferenças significativas no número de oócitos que chegaram à metáfase II ou oócitos que formaram blastocistos na presença ou ausência de gonadotrofinas exógenas (O BRIAN et al., 1994). O meio TCM-199 suplementado com FSH 81
adicionada ao soro (COGNIÉ & BARIL, 2002). No entanto, NAQVI et al. (2001), utilizando heparina em meio de capacitação para sêmen ovino, obtiveram 65,8% de oócitos fecundados. Já a cafeína deprime as taxas de fecundação quando se utiliza sêmen fresco em ovinos e o seu sinergismo com a heparina afeta negativamente as taxas de clivagem nesta espécie (NAQVI & MADAN, 1997). O sêmen usado em protocolos de FIV pode ser fresco ou congelado/descongelado no momento de sua utilização (MORRIS et al., 2003). Em ambos os processos deve-se realizar a separação dos espermatozóides móveis dos mortos e adicionar o meio de fecundação em quantidade suficiente para que alcance uma concentração desejável, geralmente em torno de 1 x 10 6 espermatozóides/ml (GULER et al., 2000; ALBERIO et al., 2002). Espermatozóides com boa motilidade são separados dos mortos e daqueles com baixa motilidade através da técnicas de swim-up (SLAVIK et al., 1992; WATSON et al., 1994; WANI et al., 2000) ou gradiente de Percoll (COGNIÉ et al., 2003) seguido de centrifugação. Espermatozóides epididimários oriundos de carneiros em abatedouros têm sido utilizados com sucesso, algumas horas após sua morte, para FIV de oócitos ovinos (WANI et al., 2000). O sêmen fresco de ovino foi utilizado com sucesso para FIV após capacitação com cálcio ionóforo A23187 em solução BO (protocolo desenvolvido para coelhos por BRACKETT & OLIPHANT, 1975) contendo 0,6% de BSA e cafeína (WANG et al., 1998; ZHU et al., 1999). Fecundação in vitro O sucesso da FIV depende tanto do protocolo de maturação oocitária como da capacitação espermática. O tempo de interação oócito-espermatozóide, o meio utilizado, a temperatura e a concentração espermática possuem importante papel no sucesso desta técnica. Independente do tipo de sêmen utilizado para este fim, geralmente adicionam-se os espermatozóides em meio de fecundação contendo de 10 a 30 oócitos maturos. Este processo na espécie ovina pode durar 6 (WANG et al., 1998), 6 a 10 (ZHU et al., 1999), 17 (MORRIS et al., 2003), 18 (GULER et al., 2000), 20 (ALBERIO et al., 2002) ou 20 a 24 horas (BYRNE et al., 2000). Para uma melhor avaliação deste processo, estudos são necessários para determinar se, reduzindo o tempo de interação oócitoespermatozóide, ocorre a diminuição dos danos produzidos pelos espermatozóides, melhorando as taxas de implantação após transferência, semelhante ao que ocorre em humanos (GIANAROLI et al., 1996). A temperatura de incubação dos oócitos em conjunto com os espermatozóides podem variar segundo os autores: 37 o C (MORRIS et al., 2003), 38,5 o C (GULER et al., 2000) e 39,5 o C (COGNIÉ et al., 2003). No entanto, todos esses autores utilizaram uma atmosfera de 5% de CO 2. SLAVIK et al. (1992) descreveram a utilização de TCM-199 enriquecido com heparina como meio de fecundação para oócitos ovinos. WALKER et al. (1994) concluíram que a utilização de fluido sintético de oviduto (SOF) adicionado de 2% de soro de ovelha em estro é um modelo adequado para um sistema de FIV em ovinos. Outros autores utilizaram o TCM-199 como meio de fecundação, modificando para 5% a concentração do soro de ovelha em estro (WANG et al., 1998) ou para 1% (NAQVI et al., 1999). COGNIÉ et al. (2003) utilizaram o meio SOF adicionado de 10% de soro de ovelha e 0,5 µg/ml de heparina. A solução BO acrescida de 5 mg/ml de BSA também foi utilizada na FIV de ovinos, promovendo uma taxa de fecundação de 90% (ZHU et al., 1999). Outros meios já foram propostos com esta finalidade: TCM-199 (SLAVIK et al., 1992), Ham F-10 e Ham F-12 (WANI, 2002) e Tyrode (WATSON et al., 1994). Os presumíveis zigotos podem ser avaliados 24 (ALBERIO et al., 2002) a 45 horas (WANG et al., 1998) após a FIV. CROZET (1986) observou uma alta incidência de polispermia (27%) em embriões ovinos fecundados in vitro. Cultivo in vitro de embriões O aprimoramento das condições de cultivo para embriões de ovinos é necessário para melhorar sua viabilidade após a manipulação. Isso permite que os embriões sejam devidamente avaliados antes de serem transferidos para receptoras. Embriões ovinos são normalmente 83
100 80 Percentual 60 40 20 0 demonstrado que embriões cultivados em microgotas de meio sob óleo de parafina clivam mais facilmente que aqueles cultivados em meio sem óleo (WALKER et al., 1992). Os prováveis contaminantes tóxicos do óleo são eliminados através de gradativas passagens em solução salina. A eficiência do cultivo de embriões ovinos nos estádios iniciais até oito células pode ser incrementada pelo co-cultivo destes embriões em presença de monocamadas de células do oviduto (GANDOLFI & MOOR, 1987) ou vesículas trofoblásticas (REXROAD JR & POWELL, 1988). O co-cultivo de embriões ovinos também melhora seu desenvolvimento in vitro (WATSON et al., 1994). A fim de avaliar a eficiência do cultivo in vitro (Fig. 2), é observado o desenvolvimento até o estádio de blastocisto, o que se dá por volta dos seis a oito dias de cultivo (BYRNE et al., 2000). Também pode ser utilizada a contagem das células por embrião, em torno dos sete dias de cultivo, para confirmação do estádio de desenvolvimento, assim como a presença ou ausência da massa celular interna (GULER et al., 2000). Fec Mo/Bl SEG SEP Parâmetro observado Figura 3. Eficiência da produção in vitro de embriões ovinos da fecundação ao parto. Fec (fecundação), Mo/Bl (mórula/blastocisto), SEG (sobrevivência embrionária na gestação), SEP (sobrevivência embrionária ao parto) (Adaptado de ZHU et al., 1999). O percentual que se desenvolveu até os estádios de mórula e blastocisto foi de 64,8%. Os embriões oriundos do cultivo (n = 61) foram transferidos para 20 receptoras, resultando em uma taxa de gestação de 50%. Onze crias nasceram, resultando em uma taxa de sobrevivência embrionária ao parto de 18% (Fig. 3). Considerações finais e perspectivas A PIV de embriões ovinos possuem um grande potencial para desenvolver em direção à produção em larga escala e para aplicações em outras biotecnologias da reprodução, tais como a transgênese e a clonagem. No entanto, a etapa de MIV ainda mostra-se como o principal entrave, necessitando de maiores estudos. No Brasil, existem poucos grupos trabalhando com a PIV de embriões ovinos. Esses grupos estão localizados quase que exclusivamente nas regiões Sudeste e Sul. Torna-se também interessante que outros grupos de pesquisa sejam criados na região Nordeste, levando-se em consideração o potencial produtivo e a importância da espécie para essa região. Transferência de embriões produzidos in vitro Os trabalhos que envolvem a PIV de embriões ovinos, chegando até a transferência propriamente dita para receptoras previamente preparadas, são relativamente escassos. ZHU et al. (1999) obtiveram uma taxa de fecundação de 90%. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem o apoio financeiro sob forma de bolsa de doutorado da FUNCAP e Produtividade em Pesquisa do CNPq 85
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