RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA - PIBIC/CNPq Instituto Agronômico do Paraná Área de Solos - Laboratório de Microbiologia do Solo

RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA - PIBIC/CNPq Instituto Agronômico do Paraná Área de Solos - Laboratório de Microbiologia do Solo CARACTERIZAÇÃO, COMPETIÇÃO E DIVERSIDADE DE ESTIRPES DE RIZÓBIO EM FEIJOEIRO Orientada: Gabriela S. Machineski, graduanda de Agronomia Orientadora: Diva S. Andrade, PhD. Londrina - PR 1 de agosto de 2008 a 31 de julho de 2009

INFORMAÇÕES RELATIVAS AO BOLSISTA Nome: Gabriela da Silva Machineski Curso: Agronomia Período: 2º ano Inst. Ensino: Universidade Estadual de Londrina - UEL Data de ingresso como bolsista do CNPq: 01 de agosto de 2008 Bolsista de renovação - período: 01/agosto/2009 a 31/julho/2010 INFORMAÇÕES RELATIVAS AO ORIENTADOR Nome: Diva de Souza Andrade Eng. Agrônoma Titulação: Ph.D. Área: Microbiologia do Solo Instituto Agronômico do Paraná - IAPAR INFORMAÇÕES RELATIVA À BOLSA: Título do projeto CNPq: CARACTERIZAÇÃO E COMPETIÇÃO DE ESTIRPES DE RIZÓBIO-PHASEOLUS Período da bolsa: Início: 01/08/2008 a 31/07/2009 Período do relatório: 01/08/2008 23/06/2009 Renovação da bolsa: 01/08/2009 a 31/07/2010 SITUAÇÃO ATUAL DO PROJETO: ( X ) como previsto ( ) andamento ( ) atrasado ( ) concluído

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO...4 2 MATERIAL E MÉTODOS...5 2.1. Origem das estirpes... 5 2.1.1 Isolamento e armazenamento das estirpes...5 2.2 Caracterização fenotípica e genotípicamente das estirpes de rizóbios... 6 2.2.1 Caracterização fenotípica...6 2.2.2 Caracterização genotípica...7 2.2.3Análises dos dados fenotípicos e genotípicos...9 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO...10 3.1 Caracterização Fenotípica... 10 3.2 Caracterização Genotípica... 12 3.2.2 PCR-RFLP da região ITS...12 3.2.3 PCR-BOX...14 3.2.4 PCR-REP...15 4 CONCLUSÕES...16 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...17

1 INTRODUÇÃO Os grãos do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) representam uma importante fonte de proteínas ingeridas pela população brasileira. Pelo papel e importância na economia, segurança alimentar e na sustentabilidade do meio ambiente, o potencial da fixação biológica de N 2 (FBN), em substituir a adubação com fertilizantes nitrogenados é um assunto bastante pesquisado no Estado do Paraná (VOSS, 1983; VOSS et al 1984; HUNGRIA et al., 1997; ANDRADE et al., 2000; ANDRADE et al., 2002a; ANDRADE et al., 2002b; HUNGRIA et al., 2000; KASCHUK et al., 2006, HUNGRIA et al., 2006). Para explorar a FBN na agricultura, é fundamental a seleção de estirpes eficientes com capacidade de fixação do N 2 e infectividade das plantas hospedeiras. Atualmente são autorizadas pelo Ministério da Agricultura e Pecuária para a cultura do feijoeiro, três estirpes de rizóbio, SEMIA 4077 (=CIAT899), SEMIA 4080 (=PRF81=IPR Pv-81) e SEMIA 4088 (H12), todas da espécie Rhizobium tropici, (RELARE, 2001), sendo a SEMIA 4080 isolada de solos do Paraná (HUNGRIA et al., 2000) Fatores que interferem na exploração da FBN são a especificidade simbiótica entre a planta hospedeira e a bactéria, sendo que o genótipo da planta pode desempenhar papel essencial na seleção do simbionte e a seleção de estirpes em laboratório e casa de vegetação, que no campo podem não alcançar o máximo potencial de fixação do N 2, em decorrência, dentre outros fatores, da competição com a população nativa de rizóbio estabelecida do solo e da baixa adaptação às condições ambientais locais (CARVALHO et al., 2005). Neste sentido, são de grande importância os estudos de caracterização e avaliações precisas para recomendações de novas estirpes de alta qualidade na competição e na fixação eficiente de nitrogênio atmosférico para cada leguminosa hospedeira. Para estudos de caracterização de estirpes de rizóbio, o emprego das técnicas de DNA recombinante é uma ferramenta preciosa, especialmente, as técnicas baseadas em PCR (Polymerase Chain Reaction, análise pela reação em cadeia da polimerase) e permitindo, assim, a caracterização de novas espécies (FELICE & ALSHINAWI, 1996). Dentre essas técnicas de biologia molecular conhecidas, baseadas nas análises de PCR que permite a amplificação de seqüências definidas da molécula do DNA, destacam-se as associadas ao método do RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism, polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição) e com primers específicos, como o BOX, ERIC e REP, e os perfis dos produtos obtidos após a reação 4

permitem a diferenciação das estirpes (FERNANDES et al., 2003). Em geral, mesmo sendo amplificações de regiões de genes cromossômicos conservados, as mesmas possuem variabilidade suficiente para detectar diferenças entre gênero e espécie, como o espaço intergênico ITS (Internally Transcribed Spacer) entre as regiões dos genes 16S rrna e 23S rrna (CHUEIRE et al., 2003). Esse método permite discriminar, inclusive, linhagens geneticamente relacionadas. Tomando-se por base um determinado grau de variabilidade, o seqüenciamento de bases dessas regiões gênicas é efetuado, permitindo a definição precisa das espécies (GARRITY & HOLT, 2001). O objetivo neste trabalho foi utilizar técnicas morfo-fisiológicas e moleculares para caracterizar e avaliar a competitividade de estirpes elite de rizóbios inoculadas em duas cultivares de feijoeiro e uma variedade crioula, em solo com população estabelecida. 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Origem das estirpes Foi conduzido um experimento a campo na Estação Experimental do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR) de Ponta Grossa PR na safra 2005/2006, que constou de cultivares de feijoeiro (IPR-Chopim e IPR-Graúna) e da variedade crioula (Chumbo). Foi utilizado o sistema de plantio direto em solo corrigido com calcário e adubação com fósforo e potássio de acordo com recomendação para o feijoeiro (Phaseolus vulgaris L). As sementes foram inoculadas ou não com inoculante turfoso contendo uma mistura das estirpes elite de rizóbio (IPR Pv -580; -583; -589; -616; -652; -2604; -2608) obtidas na Coleção de Microrganismos Fixadores de Nitrogênio do Laboratório de Microbiologia de Solos do IAPAR. No florescimento, as plantas foram coletadas para isolamento das estirpes a partir de nódulos para caracterização e avaliação da competitividade entre as estirpes elites inoculadas e da diversidade das estirpes naturalizadas do solo. 2.1.1 Isolamento e armazenamento das estirpes Para realização do isolamento das estirpes de rizóbio, cortou-se a parte aérea de cada planta crescida no experimento e retiraram-se as raízes juntamente com os blocos de solo onde elas estavam inseridas. Estes blocos foram trazidos para o Laboratório 5

de Microbiologia de Solos do IAPAR Londrina, onde se realizou a lavagem das raízes para a retirada do excesso de solo. Aleatoriamente, retiraram-se alguns nódulos em todo o sistema radicular. Os nódulos foram imersos por 30 s em álcool a 70% para quebrar a tensão superficial e em seguida, foram transferidos para uma solução de hipoclorito de sódio 3% por 2 min e lavados por seis vezes em água destilada e esterilizada. Após a última lavagem, o nódulo foi macerado em água destilada com o fórceps estéril e o material foi riscado em placas de petri contendo meio de extrato de levedura-manitol-ágar - ELMA (VINCENT, 1970). Da cultivar IPR-Chopim obteve-se um total de 19 estirpes, sendo que, dessas, 10 do tratamento inoculado com as estirpes elite (IPR Pv-2730 a -2739) e nove do tratamento sem inoculação (IPR Pv-2740 a -2748). Da IPR-Grauna foram isoladas 10 estirpes do tratamento inoculado (IPR Pv-2765 a -2774) e 10 do controle sem inoculação (IPR Pv-2775 a -2784). Da variedade crioula Chumbo, foram isoladas nove estirpes do tratamento inoculado (IPR Pv-2785 a -2793) e 10 do controle sem inoculação (IPR Pv-2794 a -2803). Essas 58 estirpes foram autenticadas para comprovar a capacidade de formação de nódulos no feijoeiro. Para isso, foram montados vasos com solução nutritiva sem nitrogênio, plantadas sementes de feijão pré-germinadas e inoculadas as estirpes isoladas, previamente crescidas em meio líquido extrato de levedura-manitol (ELM) conforme descrito por Vincent (1970). Após comprovada a capacidade de formação de nódulos, as 58 estirpes de rizóbio foram conservadas em glicerol e estocadas em ultra-freezer a -80 o C e também, em ampolas após liofilização. 2.2 Caracterização fenotípica e genotípicamente das estirpes de rizóbios 2.2.1 Caracterização fenotípica As estirpes de rizóbio foram caracterizadas quanto à morfologia colonial em meio de cultura ELMA, observando-se tamanho, forma, textura, absorção de corante, produção de goma, elevação, bordos, estrutura, brilho e transparência. Essas estirpes foram, também, caracterizadas fisiologicamente quanto à produção de melanina e alteração de ph do meio. Para análise da produção de melanina preparou-se meio de cultura sólido com triptona, extrato de levedura, cloreto de cálcio, L-tirosine e sulfato de cobre, onde foram transferidas as estirpes de rizóbio que cresceram por três dias. Após esse período, adicionouse solução de SDS 10% sobre as colônias observando-se o desenvolvimento da coloração 6

final do meio. As colônias que não apresentaram pigmentação não produzem melanina, e as colônias que apresentaram coloração marrom ou preta produzem melanina. A avaliação da capacidade de alterar o ph foi realizada em meio ELM, acrescentando-se 2,5 ml L -1 de corante azul de bromotimol 0,5%, com ph ajustado para 6,8. Foram distribuídos e autoclavados 5 ml do meio em tubos com tampa. As bactérias foram inoculadas e incubadas por 3 dias a 28 ºC, verificando-se a alteração do ph através da coloração adquirida. O meio de cultura contendo azul de bromotimol tem a coloração verde em ph 6,8, porém, quando o meio torna-se ácido, sua coloração altera para amarela, e em ph alcalino a coloração do meio fica azulada. 2.2.2 Caracterização genotípica 2.2.2.1 Extração de DNA Para identificar as estirpes presentes nos nódulos, transferiu-se 1 ml de células cultivadas em meio líquido ELM para extração do DNA das estirpes e caracterização genotípica. O DNA foi extraído segundo método modificado Ausubel et al., (1994) e visualizado em gel de agarose a 0,9%, em cuba para eletroforese. Em seguida, o gel foi corado por 10 min em brometo de etídeo, lavado com água para retirar o excesso de brometo, e fotografado com luz ultravioleta. 2.2.2.2 PCR-RFLP da região ITS A amplificação do DNA, foi realizada com a técnica PCR (Polymerase Chain Reaction) com oligonucleotideos que amplificam a região genômica (16S-23S rrna) do ITS (Internally Transcribed Spacer). Para esta reação, foram utilizados 29 µl de água destilada, 5 µl de Tampão, 5 µl MgCl 2 (10 mm); 3 µl DNTP (Deoxynucleotide set), 3 µl do primer fc 16 S (10 mm) e 3 µl do primer rd 23 S (10 mm), 0,2 U de Taq DNA polimerase (5 U µl -1 ) e 5 µl de DNA. A amplificação foi realizada usando os seguintes ciclos: 1 ciclo de desnaturação inicial a 94 ºC por 3 min, 40 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 30 s, anelamento dos iniciadores a 58 ºC por 30 s, extensão a 78 ºC por 45 s, um ciclo de extensão final a 72 ºC por 3 min e manutenção a 4 ºC. O produto da amplificação da PCR foi aplicado em gel de agarose 0,9%, corrido em cuba para eletroforese com tampão TBE 1X, sob corrente elétrica de 100 V por uma hora. No gel de agarose foi aplicado na primeira canaleta 4 µl do padrão de peso molecular 1Kb plus DNA Ladder. 7

Os produtos de PCR foram digeridos com quatro enzimas de restrição (HaeIII, HhaI, DdeI, MboI) segundo o método RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). Para a reação foram utilizados 0,6 µl de água esterilizada (Milli-Q), 8 µl do produto da PCR, 4 µl da enzima (10 U µl -1 ), 1 µl de Tampão e 0,2 µl de BSA (Bovine Serum Albumin). Incubaram-se as amostras por 12 h em BOD a 37 ºC e os fragmentos de DNA foram corridos com em gel de agarose 1,8% em cuba para eletroforese com solução tampão TBE 1X, em corrente elétrica de 100 V por duas horas. Aplicaram-se 4 µl do marcador 1Kb plus DNA Ladder molecular na primeira canaleta do gel. 2.2.2.3 PCR-BOX Com o DNA extraído dos isolados, foi realizado o PCR com amplificação de regiões repetitivas do DNA utilizando-se o primer BOX-A1R (5 - CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3 ). A reação foi composta de 5 µl de água esterilizada (Milli-Q), 2,5 µl de Tampão (10X), 1,2 µl MgCL 2 (10 mm); 6 µl DNTP (Deoxynucleotide set), 1,5 µl do primer BOX (50 pmol -1 ) e 0,5 U de Taq DNA polimerase (5 U µl -1 ) e 1 µl de DNA. Foi utilizado o termociclador modelo MJ Research Inc. PTC-100 com a programação dos seguintes ciclos de amplificação: um ciclo de desnaturação inicial a 95 ºC por 37 min, 35 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 1 min, anelamento dos iniciadores a 53 ºC por 1 min, extensão a 65 ºC por 8 min, um ciclo de extensão final a 65ºC por 16 min e manutenção a 4 ºC. O produto da amplificação da PCR foi aplicado em gel de agarose (1,5%), corrido em cuba para eletroforese com tampão TBE 1X, sob corrente elétrica de 100 V por 6 h. No gel de agarose foi aplicado na primeira canaleta 4 µl do padrão de peso molecular 1Kb plus DNA Ladder. 2.2.2.4 PCR-REP Através da técnica de PCR foram amplificadas regiões repetitivas do DNA de cada estirpe estudada, com os primers REP ( Repetitive Extragenic Palindromic ) REP1R, 3 -CGGICTACIGCIGCIIII-5 e REP2-I, 5 -GICTTATCIGGCCTAC-3. Para as reações utilizou-se 8 µl de água (mili Q esterilizada); 6 µl de DNTPs [1,5 mm de solução para cada um dos quatro nucleotídeos (C, G, T e A)]; 3 µl de tampão 10 X (500 mm KCl; 100 mm Tris-HCl, ph 8,3); 3,5 µl de MgCl 2 (50 mm); 3 µl de cada primer (50 pmol µl -1 ); 0,7 µl de Taq DNA polimerase (5 U µl -1 ) e 5 µl de DNA (50 ng) tendo um volume final de 27,2 µl. A amplificação se deu em termociclador com o seguinte programa para o PCR- 8

REP: um ciclo inicial de desnaturação a 95 ºC por 6 min, 35 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 1 min, anelamento a 40 ºC por 1 min e extensão a 65 ºC por 8 min, 1 ciclo final de extensão a 65 ºC por 16 min; mantendo-se a 4 ºC. Ao produto de amplificação foram adicionados 2 µl de tampão de amostra por tubo (tampão de amostra preparado com 0,25% de azul de bromofenol e 30% de glicerol), em seguida, aplicou-se todo o volume em um gel de agarose 1,5% de 20 x 25 cm, diluído em tampão TBE 1X. Foi então utilizada uma corrente elétrica de 100 V por 6 h. 2.2.3 Análises dos dados fenotípicos e genotípicos Para as características morfo-fisiológicas foram atribuídos valores binomiais (0 e 1) e a dissimilaridades das estirpes foram comparadas pelo coeficiente Euclidiana pelo método COMPLETE e os dados foram agrupados e representados graficamente por um dendrograma. Para avaliar as características genotípicas, os géis foram corados com brometo de etídeo (25 mg L -1 ) por 15 min e descorado em água, e as bandas foram visualizadas em transluminador com lâmpada ultravioleta e fotografado com câmera KODAK Digital Science ld 3.5. com o auxílio do programa Kodak Digital Science os géis foram analisados, sendo atribuídos valores de 0 para ausência e 1 para presença de bandas e construída uma matriz binária. As similaridades das estirpes foram comparadas pelo coeficiente de Jaccard e os dados foram agrupados pelo método UPGMA e representados graficamente por um dendrograma. Para análise de agrupamento das estirpes com base nos dados fenotípicos e genotípicos foi utilizado o programa NTSYS-pc (Numerical Taxonomic and Multivariate Analyis System, versão 2.1, Exeter Software, USA). A diversidade e a riqueza da população de rizóbios independente dos tratamentos aplicados (cultivar e inoculação) foram estimadas com base nas análises de agrupamento dos dados fenotípicos e genotípicos (ITS), e considerando 70% de similaridade para separar as estirpes em grupos. As estirpes que foram inoculadas no experimento e as autorizadas (SEMIA -4077, -4080 e -4088) não foram consideradas na análise. Os índices de diversidade e riqueza foram calculados com o auxílio do programa PAST (http://folk.uio.no/ohammer/past/download.html). 9

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Caracterização Fenotípica Para comparar as características fenotípicas das estirpes isoladas com as eliteinoculadas, foi montado um dendrograma de similaridade baseado nas 12 características fenotípicas avaliadas (tamanho, forma, textura, absorção de corante do meio de cultura, produção de goma, elevação, bordos, superfície, brilho, transparência, alteração de ph do meio de cultura, produção de melanina). Foram comparadas também com as estirpes recomendadas para feijoeiro: SEMIA-4077, -4080, -4088 da espécie Rhizobium tropici (Fig. 1). Verificaram-se características diversas entre as estirpes isoladas das cultivares de feijoeiro IPR-Chopim, IPR-Graúna e da variedade crioula Chumbo, sendo que se apresentaram com maior freqüência: o tamanho da colônia maior que 2 mm, forma circular, textura não viscosa, absorção de corante do meio de cultura, produção de goma, planas, com bordos e superfície lisas, brilhosas e translúcidas. Observou-se que 72% das estirpes acidificaram o meio de cultura ELMA contendo o azul de bromotimol como indicador e 28% deixaram o meio de cultura neutro. Quanto à capacidade de produzir melanina 47 estirpes de rizóbio não produziram pigmentação escura, representando 81%. Através do dendrograma baseado nas características fenotípicas, observou-se a formação de dois grandes grupos com total diferença para as características avaliadas 10

I II 2730 2784 2800 2731 2777 2767 2745 4077 4080 4088 580 2604 2608 589 2732 2798 2739 2746 2747 2773 2780 2790 2740 2744 2768 2792 2795 2796 2776 2797 2801 2733 2791 2736 2782 2794 2734 2737 2771 2735 2766 2770 2775 652 2786 2783 2799 2738 2779 2748 2741 583 2803 2765 2743 2772 2802 2742 2785 2769 2787 0.00 2.50 5.00 7.50 10.00 Coefficient Fig. 1. Dendrograma de dissimilaridade das estirpes de rizóbio-phaseolus isolados de nódulos das cultivares de feijoeiro IPR-Chopim, IPR-Graúna, variedade Chumbo, estirpes elite e três estirpes recomendadas para feijoeiro: SEMIA-4077, -4080, -4088, baseado em 12 características fenotípicas. Análise realizada pelo método COMPLETE e coeficiente Euclidiana. Observou-se que a estirpe IPR Pv -2775 (IPR-Graúna), mostrou características fenotípicas semelhantes a uma das estirpes inoculadas, a IPR Pv -652. No caso da cultivar IPR-Chopim também foi verificado que a estirpe IPR Pv -2745 se agrupou com as elite inoculadas IPR Pv -580, -2604 e -2608 e com as autorizadas pelo MAPA. (SEMIA-4077; -4080; -4081), para produção de inoculantes no Brasil. Essas estirpes da espécie Rhizobium tropici apresentam colônias circulares, convexas, semitranslúcidas e, usualmente, com diâmetro de 2 a 4 mm em 2 a 4 dias de crescimento em meio de cultura (HUNGRIA et al., 2000).

3.2 Caracterização Genotípica As técnicas moleculares empregadas permitiram caracterização genotípica das estirpes de rizóbio. Um exemplo dos géis obtidos é apresentado na figura 2 A, B e C. (A) (B) (C) Fig. 2: Exemplos de perfis de bandas obtidos pelas técnicas: (A) PCR-RFLP na região genômica ITS; (B) BOX-A1R; (C) PCR-REP. Na linha nº 1 dos géis: marcador molecular 1Kb plus DNA Ladder. 3.2.2 PCR-RFLP da região ITS Após a amplificação da região intergênica do DNA das estirpes isoladas das cultivares de feijoeiro IPR-Chopim, IPR-Graúna, variedade crioula Chopim e das estirpes elite inoculadas, e digestão com enzimas de restrição HaeIII, HhaI, DdeI, MboI, foi possível observar um polimorfismo nas bandas visualizadas no gel de agarose. Os tamanhos de fragmento de DNA amplificado com primers que codificam a região intergênica (16 23S) variaram de 70 a 1310 pares de bases (Fig. 2A). Com os perfis de banda da região intergênica foi montado um dendrograma, para avaliar a competitividade das estirpes elite inoculadas no experimento, observando-se a similaridade destas com as isoladas das cultivares IPR-Chopim, IPR- Graúna e da variedade crioula Chumbo (Fig. 3). 12

I II Fig. 3: Dendrograma de similaridade baseado nas características genotípicas (PCR-ITS, enzimas de restrição HaeIII, HhaI, DdeI, MboI). Estirpes de rizóbios isoladas das cultivares de feijoeiro, IPR-Chopim, IPR-Graúna, variedade Chumbo, estirpes inoculadas no experimento (IPR Pv -580; -583; -589; -616; -652; -2604 e -2608) e as autorizadas. Análise realizada com o algoritmo UPGMA e o coeficiente de Jaccard (J). Com um coeficiente de 70% de similaridade, houve a formação de dois grupos, sendo o grupo II formado apenas pela estirpe IPR Pv -2735. No grupo I, houve um agrupamento com 100% de similaridade das estirpes IPR Pv -2790 e -2794, ambas isoladas da variedade crioula Chumbo, sendo que a primeira recebeu inoculação e a segunda não. Pode-se observar, com um coeficiente de 98% de similaridade, o agrupamento das estirpes IPR Pv -2776 e -2778, isoladas da cultivar de feijoeiro IPR- Graúna que não receberam inoculação das estirpes elite. No mesmo coeficiente, houve um agrupamento das estirpes IPR Pv -2604 e -2608, inoculadas no experimento e outro da estirpe IPR Pv -2787, isolada da variedade crioula Chumbo, que recebeu inoculação, com as estirpes IPR Pv -2790 e -2794. Neste Coeficiente, não houve agrupamento das estirpes isoladas das cultivares de feijoeiro com estirpes inoculadas no experimento. 13

As estirpes elite IPR Pv -616 e -652 agruparam-se com 90% de similaridade, porém não houve agrupamento das elite com as estirpes isoladas das cultivares IPR-Chopim, IPR-Graúna e variedade crioula Chumbo para esta característica neste coeficiente. 3.2.3 PCR-BOX Com a amplificação de regiões repetitivas do DNA com a técnica de PCR-BOX, foi possível observar bandas polimórficas, que variaram de 177 a 1982 pares de bases (Fig. 2 B) e assim construído um dendrograma para comparar as características genotípicas das estirpes (Fig. 4). I II Fig. 4: Dendrograma de similaridade baseado nas características genotípicas (PCR-BOX). Estirpes de rizóbios isoladas das cultivares de feijoeiro, IPR-Chopim, IPR-Graúna, variedade Chumbo, estirpes inoculadas no experimento (IPR Pv-580; -583; -589; -616; - 652; -2604; -2608) e as autorizadas. Análise realizada com o algoritmo UPGMA e o coeficiente de Jaccard (J). Foi possível verificar, a partir do dendrograma de similaridade construído com as características genotípicas com a técnica PCR-BOX, a formação de três grandes grupos com 8% de similaridade (Fig. 4). O grupo I foi constituído com as estirpes IPR Pv - 2793, isolada da variedade Chumbo inoculada e a inoculada -580, enquanto o grupo II incluiu as demais estirpes. As estirpes IPR-Pv -2743 e -2744, isoladas da cultivar IPR- 14

Chopim, e as estirpes IPR-Pv -2795 e -2796, isoladas da variedade crioula Chumbo, se agruparam com um coeficiente de, aproximadamente, 77% de similaridade. O agrupamento das estirpes isoladas das cultivares IPR-Chopim, IPR-Graúna e variedade Chumbo com as estirpes elite inoculadas no experimento, só se deu em um índice de 50% de similaridade (Fig. 4). 3.2.4 PCR-REP A amplificação de regiões repetitivas do DNA das estirpes com os primers REP1R e REP2-I, apresentou fragmentos com tamanho variando de 150 a 2050 pares de bases (Fig. 2C). Não se obteve amplificação das estirpes isoladas da variedade Chumbo e IPR-Graúna. Com aproximadamente 5% de similaridade houve a formação de dois grandes grupos. O grupo I formou-se com a maioria demais estirpe e as estirpes IPR-Pv - 2736 e -2739; -2731-2733 mostraram-se idênticas (Fig. 5). O grupo II formado apenas pelas estirpes IPR Pv 2741 e -2746, Só houve estirpes que se agruparam com as inoculadas com coeficiente de similaridade abaixo de 90% para a característica genética obtida com a técnica PCR- REP. I II Fig. 5: Dendrograma de similaridade baseado nas características genotípicas (PCR-REP). Estirpes de rizóbios isoladas da cultivar de feijoeiro IPR-Chopim, estirpes elite inoculadas no experimento e as autorizadas. Análise realizada com o algoritmo UPGMA e o coeficiente de Jaccard (J). 15

As estirpes de rizóbios naturalizadas no solo após anos de cultivo com feijoeiro predominaram nos nódulos avaliados. Isso evidencia duas coisas, primeiro: as estirpes elite inoculadas apresentaram baixa capacidade competitiva ou uma segunda hipótese a metodologia utilizada: número de nódulos avaliados (10 de cada tratamento) e metodologia de retirá-los ao acaso em todo sistema radicular não foi adequada para uma amostragem representativa. Estirpes inoculadas não se movimentam naturalmente no solo, portanto, formando a maioria dos nódulos na região da coroa (5 a 7 cm) conforme relatado para soja (KAMICKER & BRILL, 1987) e para feijoeiro, soja e amendoim (CARDOSO et al., 2009). Para avaliar a diversidade da população de rizóbio naturalizada, independente das cultivares, foram calculados os índices com base nos dados fenotípicos e genotípicos (Tabela 1). Tabela 1: Índices de diversidade (Shannon) e de riqueza (Margalef) das subpopulações de rizóbio isoladas de nódulos do feijoeiro inoculado ou não com uma mistura de estirpes. Os dados foram analisados estatisticamente com o teste t com 95% de confiança. Variáveis Índice de diversidade (Shannon) Índice de riqueza (Margalef) Não inoculadas Inoculadas Não inoculadas Inoculadas Fenotípica 1.82 a 1.94 a 2.415 a 2.47 a Genotípica 2.60 a 2.46 a 4.69 a 4.29 a Os índices de diversidade (Shannon) e de riqueza da população de rizóbios, independente das cultivares, foram altos e não foram observadas diferenças significativas entre os tratamentos com e sem inoculação (Tabela 1). 4 CONCLUSÕES - Não houve diferença significativa para a diversidade das estirpes isoladas do feijoeiro que receberam ou não a inoculação das estirpes elite de rizóbio. - As estirpes presentes nos nódulos isolados das plantas de feijoeiro apresentaram alta diversidade e perfis genotípicos diferentes das estirpes inoculadas. - As estirpes elite de rizóbios IPR Pv-580; -583; -589; -616; -652; -2604; -2608 mostraram baixa competitividade, em solo com alta população estabelecida de rizóbio. 16

5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ANDRADE, D. S.; COLOZZI FILHO, A.; BALOTA, E. L.; HUNGRIA, M. Fixação Biológica do Nitrogênio em Leguminosas de Grãos. In: Cultura do feijoeiro: IAPAR Londrina, PR, 2000, p. 49-57. ANDRADE, D. S.; MURPHY, P. J.; GILLER, K. E. Effects of liming and legume/cereal cropping on populations of indigenous rhizobia in an acid Brazilian Oxisol. Soil Biology & Biochemistry., v.34, p.477-485, 2002a. ANDRADE, D. S.; MURPHY, P. J.; GILLER, K. E. The diversity of Phaseolusnodulating rhizobial populations is altered by liming in acid soil planted with Phaseolus vulgaris L. in Brazil. Applied and Environmental Microbiology. v.68, p.4025-4034, 2002b. AUSUBEL, F.; BRENT, R.; KINGSTON, R. E.; SEIDMAN, J. G.; SMITH, J. A.; STRUHL, K. Current Protocols in molecular Biology. Greene Publishing & Wiley Interscience, New York, 1994. CARDOSO, J. D.; GOMES, D. F.; GOES, K. C. G. P.; FONSECA JUNIOR, N. S.; DORIGO, O. F.; HUNGRIA, M.; ANDRADE, D. S. Relationship between total nodulation and nodulation at the root crown of peanut, soybean and common bean plants Soil Biology & Biochemistry, 2009. CARVALHO, F. G.; SELBACH, P. A.; BIZARRO, M. J. Effectiveness and competitiveness of spontaneous mutants isolated from Bradyrhizobium spp strains recommended for soybean crop (Glycine max). Rev. Bras. Ciênc. Solo, Viçosa, v. 29, n. 6, 2005. CHUEIRE, L. M. O.; BANGEL, E.; FERREIRA, M. C.; GRANGE, L.; CAMPO, R. J.; MOSTASSO, F. L.; ANDRADE, D. S.; PEDROSA, F. O.; HUNGRIA, M. Classificação taxonômica, baseada na caracterização molecular, das estirpes de rizóbio recomendadas para as culturas da soja e do feijoeiro. Londrina: Embrapa-CNPSo, 32 p, 2000. FELICE, A. E.; ALSHINAWI, C. Polymerase chain reaction in molecular biotechnology; appropriate technology for developing countries. World Journal of Microbiology and Biotechnology, Oxford, v.12, p.467-471, 1996. FERNANDES, M. F.; FERNANDES, R. P. M.; HUNGRIA, M. Caracterização genética de rizóbios nativos dos tabuleiros costeiros eficientes em culturas do guandu e caupi. Pesquisa Agropecuária Brasileira. [online]. vol.38, n.8, p. 911-920, 2003. GARRITY, G. M.; HOLT, J. G. The road map to the manual. In: KRIEG, N. R.; HOLT, J.G. (Ed.). Bergey's manual of systematic bacteriology. Baltimore: Williams & Wilkins, p. 119-154, 2001. HUNGRIA, M.; ANDRADE, D. S.; COLOZZI FILHO, A.; BALOTA, E. L. Interação entre microrganismos do solo, feijoeiro e milho em monocultura ou consórcio. Pesquisa Agropecuária Brasileira. v.32, p.807-818, 1997. 17

HUNGRIA, M.; VARGAS, M. A. T.; ARAÚJO, R. S. Fixação biológica do nitrogênio no feijoeiro. In: Biologia dos solos dos cerrados. EMBRAPA, Planaltina, p. 187-294, 1997. HUNGRIA, M.; ANDRADE, D. S.; CHUEIRE, L. M. O.; PROBANZA, A.; GUTTIERREZ MANERO, F.; MEGIAS, M. Isolation and characterization of new efficient and competitive bean (Phaseolus vulgaris L.) rhizobia from Brazil. Soil Biology & Biochemistry. v.32, p.1515-1528, 2000. HUNGRIA, M.; CHUEIRE L. M. O.; MEGIAS M.; LAMRABET Y.; PROBANZA A.; GUTTIERREZ-MANERO F. J.; CAMPO, R. J. Genetic diversity of indigenous tropical fast-growing rhizobia isolated from soybean nodules. Plant Soil. v.288, p.343-356, 2006. KAMICKER, B.J., BRILL, W.J. Methods to alter the recovery and nodule location of Bradyrhizobium japonicum inoculant strains on field-grown soybeans. Applied and Environmental Microbiology. v.53, 1737 1742, 1987. KASCHUK, G.; HUNGRIA,M.; SANTOS, J. C. P.; BERTON-JUNIOR J. F. Differences in common bean rhizobial populations associated with soil tillage management in southern Brazil. Soil & Tillagre research, v.87, p.205-217, 2006. REDE DE LABORATÓRIOS PARA RECOMENDAÇÃO RELARE. Padronização e difusão de tecnologia de inoculantes microbianos de interesse agrícola. Protocolo RELARE. 2001. Disponível em: <http://www.relare.org.br/>. VINCENT, J.M. A manual for the practical study of the root nodule bacteria. Blackwell Scientific Publ., Oxford and Edinburgh, 1970. VOSS, M.; FREIRE, J. R. J.; SELBACH, P. A. Potencial de fixação de N2 de estirpes de Rhizobium phaseolus, de regiões produtoras de feijão no estado do Rio Grande do Sul. Revista Brasileira de Ciência do Solo, Campinas, v. 7, n. 2, p. 203-207, 1983. VOSS, M. ; FREIRE, J. R. J. ; SELBACH, P. A.. Efeito de níveis de calcário no solo e na capacidade de competição de estirpes de Rhizobium phaseolus por sítio de nodulação. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 19, n. 5, p. 433-439, 1984. 18