TUTORIAL: Curvas de Calibração Marcio Ferrarini 2008
Aplicação Curvas de calibração, são curvas contruidas a partir de dados experimentais, que correlacionam a concentração de uma substância com a absorbância ou outra resposta produzida por um método analítico
Utilidade Todo método analítico precisa de um referencial, ao qual irá se referenciar para produzir um resultado confiável. A curva de calibração será utilizada como referencial para determinar o teor de uma amostra desconhecida.
Utilidade Seu uso é rotineiro em: Controle de qualidade análises clínicas bioquímica pesquisa controle de produção
Objetivo Neste tutorial, iremos mostrar, passo a passo, a criação e utilização de uma curva de calibração, utilizando o software Microsoft Excel e uma técnica espectrofotométrica
Primeiro Passo: Definir os Limites Nossa análise irá determinar o teor de furosemida em comprimidos de 250 mg O ponto de maior precisão na leitura de absorbância é quando o equipamento produz uma leitura de 0,5. Este será, então o ponto médio da curva que iremos construir
Primeiro Passo: Definir os Limites Consultando o Merck Index, vemos que, para essa substância, uma absorbância de 0,5 se dá em uma concentração de aproximadamente 0,09 mg/ml ou 90 μg/ml. (E 1% 1cm = 557 em NaOH 0.1N a 273 nm)
Primeiro Passo: Definir os Limites Nossa curva terá 5 pontos, vamos defini-los a seguir: 22,5 μg/ml ponto inferior 45 μg/ml 90 μg/ml ponto médio 135 μg/ml 180 μg/ml ponto superior
Primeiro Passo: Definir os Limites Como definir estes pontos? Procure pensar quais seriam as concentrações mais altas e mais baixas que você poderia encontrar na amostra e faça com que a curva abranja todas essas possíveis concentrações
Primeiro Passo: Definir os Limites Ponto Concentração Teórica (μg/ml) 1 22,5 2 45 3 90 4 135 5 180
Segundo Passo: Calcular as Diluições Esta é a parte mais trabalhosa da construção, precisamos calcular como iremos diluir um padrão, para conseguirmos concentrações próximas das que queremos para construir a curva
Segundo Passo: Calcular as Diluições A solução-padrão mais concentrada seria de 180 μg/ml, podemos prepara-la da seguinte forma: Pesar 180 mg do padrão e diluir para 100 ml (180/100 = 1,8 mg/ml ou 1800 μg/ml) Diluir 10 ml dessa solução para 100 ml (1800 * 10/100 = 180 μg/ml)
Segundo Passo: Calcular as Diluições As outras soluções-padrão seriam preparadas a partir desta: 135 μg/ml: Podemos transferir, com uma bureta, 7,5 ml da solução a 180 μg/ml para balão de 10 ml 180 * 7,5 = X * 10 X=135 μg/ml
Segundo Passo: Calcular as Diluições As outras soluções-padrão seriam preparadas a partir desta: 90 μg/ml: Podemos transferir, com uma bureta, 5,0 ml da solução a 180 μg/ml para balão de 10 ml 180 * 5,0 = X * 10 X=90 μg/ml
Segundo Passo: Calcular as Diluições As outras soluções-padrão seriam preparadas a partir desta: 45 μg/ml: Podemos transferir, com uma bureta, 2,5 ml da solução a 180 μg/ml para balão de 10 ml 180 * 2,5 = X * 10 X=45 μg/ml
Segundo Passo: Calcular as Diluições As outras soluções-padrão seriam preparadas a partir desta: 22,5 μg/ml: Podemos transferir, com uma bureta, 12,5 ml da solução a 180 μg/ml para balão de 100 ml 180 * 12,5 = X * 100 X=22,5 μg/ml Utilizamos um balão maior para poder pegar um volume maior, aumentando a precisão
Terceiro Passo: Executar as Diluições Vamos preparar uma tabela de diluições, para evitar qualquer erro: Ponto Conc. Teórica (μg/ml) Alíquota (ml) Volume Final (ml) 1 22,5 12,5 100 2 45 7,5 10 3 90 5,0 10 4 135 2,5 10 5 180 - -
Terceiro Passo: Executar as Diluições Pesamos, então, 180,5 mg de um padrão de furosemida cujo teor era 99,85% e preparamos todas as soluções, que foram lidas no espectrofotômetro
Quarto Passo: Leitura Ponto Absorbância 1 0,138 2 0,271 3 0,552 4 0,830 5 1,121
Quinto Passo: Construir a curva Para isso, precisamos calcular a concentração real das soluções: Solução 5: 180,5 mg de um padrão de furosemida cujo teor era 99,85% diluidos para 100 ml e em seguida em 10 ml para 100 ml 180,5 x 99,85 x 10 = 180,2 μg/ml 100 100 100
Quinto Passo: Construir a curva Solução 4: 7,5 ml da solução 5 para 10 ml 180,2 μg/ml x 7,5/10 = 135,2 μg/ml Solução 3: 5 ml da solução 5 para 10 ml 180,2 μg/ml x 5/10 = 90,1 μg/ml Solução 2: 2,5 ml da solução 5 para 10 ml 180,2 μg/ml x 2,5/10 = 45,0 μg/ml Solução 1: 12,5 ml da solução 5 para 100 ml 180,2 μg/ml x 12,5/100 = 22,52 μg/ml
Quinto Passo: Construir a curva Vamos colocar estes dados no excel:
Quinto Passo: Construir a curva Selecione os dados e clique em assistente de gráfico :
Quinto Passo: Construir a curva Selecione o tipo Dispersão :
Quinto Passo: Construir a curva Clique avançar 2 vezes e preencha os títulos do gráfico:
Quinto Passo: Construir a curva Clique avançar e selecione como nova planilha e concluir :
Quinto Passo: Construir a curva Eis os pontos, mas ainda falta adicionar a curva, para isso, coloque o cursor sobre um ponto e clique com o botão direito, em seguida clique em adicionar linha de tendência :
Quinto Passo: Construir a curva Na guia TIPO, selecione Linear e na guia OPÇÕES marque Definir Intersecção Exibir equação no gráfico e Exibir valor de R-quadrado no gráfico
Quinto Passo: Construir a curva Pronto, essa é a curva de calibração: Curva de Calibração 1,2 y = 0,0062x R 2 = 0,9998 1 0,8 Absorbância 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Concentração (ug/ml)
Quinto Passo: Construir a curva Vamos ver as informações obtidas: A equação é Y = 0,0062x, mas podemos escrevê-la da seguinte forma: A = 0,0062* C absorbância = 0,0062 * concentração R-quadrado é o chamado coeficiente de correlação, quanto mais próximo de 1, melhor estará o ajuste dos seus dados, neste caso, 0,998 é um ótimo ajuste
Quantificação Utilizando a Curva de Calibração
Quantificação Como dito anteriormente, queremos determinar o teor de furosemida em comprimidos de 250 mg Para isso pesamos 10 comprimidos (massa = 5,231g) e determinamos o PESO MÉDIO, em seguida trituramos os comprimidos no gral Peso médio = 5,231g / 10 = 523,1 mg
Quantificação Com o pó dos comprimidos, vamos fazer uma solução-amostra, que deve ter concentração teórica de próxima ao centro da curva (90 μg/ml) O modo simples seria pesar o equivalente a 180 mg de furosemida e diluir para 100 ml, em seguida, diluir 5 ml dessa solução para 100 ml 180 mg/100 * 5/100 = 0,09 mg/ml ou 90 μg/ml
Quantificação Para saber quanto de pó de comprimidos devemos pesar para que tenhamos 180 mg de furosemida, calculamos a tomada de ensaio Sabemos que 1 comprimido pesa 523,1 mg e possui 250 mg de furosemida, portanto: 523,1 mg 250 mg de furosemida x 180 mg de furosemida x = 376,6 mg
Quantificação Chamamos esse X (376,6 mg) de Tomada de Ensaio, ou seja, a massa que temos que pesar da amostra (pó de comprimidos) para realizar a análise. Não é necessário pesar exatamente essa quantidade, basta pesar uma massa próxima a este valor, e anotar a massa com exatidão, no caso, pesamos 377,8 mg da amostra
Quantificação Preparamos então a amostra: 377,8 mg da amostra 100 ml 5 ml 100 ml ABSORBÂNCIA = 0,516
Quantificação DADOS Tomada de Ensaio= 377,8 mg diluição = 2.000 (100 x 100/5) absorbância = 0,516 Peso médio= 523,1mg Curva de Calibração: A = 0,0062* C
Quantificação Cálculo da Concentração diluição = 2.000 (100 x 100/5) absorbância = 0,516 Curva de Calibração: A = 0,0062* C 0,516 = 0,0062 * C C = 83,23 μg/ml Multiplicando pela diluição: 83,23 μg/ml * 2000 = 166452 μg ou 166,4 mg
Quantificação Cálculo do Teor Tomada de Ensaio= 377,8 mg Peso médio= 523,1mg Estas 166,4 mg de furosemida estavam na tomada de ensaio (TE), portanto para um comprimido: 377,8 mg (TE) 166,4 mg furosemida 523,1 mg (1 comp) X X = 230,4 mg de furosemida
Quantificação Cálculo do Teor A Farmacopéia Britânica especifica que um comprimido de furosemida deve ter de 95 a 105 % do seu valor rotulado (VR), portanto: 250 mg 100% VR 230,4 mg X X = 92,2% VR A amostra analisada não está dentro das espeficicações