Efeito da redução do teor de NaCl na mortalidade do micro crustáceo Artemia franciscana Sara Costa Laboratório de Ecotoxicologia, do Grupo de Disciplinas de Ecologia da Hidrosfera, da Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade Nova de Lisboa, Monte da Caparica, Quinta da Torre Resumo Neste trabalho foi estudada a toxicidade de cloreto de sódio (NaCl) no micro crustáceo A. franciscana. Elaboraram se meios com diferentes concentrações de NaCl e quantificou se o efeito de cada uma na mortalidade dos micro crustáceos, logo após o nascimento dos mesmos, pois sabese que estes são mais sensíveis a mudanças de toxicidades nessa altura, do que em estado adulto. O CL5 24horas (concentração letal para 5% da população testada após 24 horas de exposição) foi de,57735455 g/l. Palavras chave: Artemia franciscana, NaCl, CL5 1. Introdução A Artémia é um pequeno crustáceo de coloração e tamanho variável (entre,2 a 16 mm) consoante o que consome. Em ambiente natural a Artémia alimenta se sobretudo de micro algas, bactérias, diatomáceas, flagelados e alguns detritos orgânicos. Porém, em aquacultura, esta é alimentada com micro algas verdes obtidas por meio de coral em pó dissolvido na água em grande quantidade, levedura de cerveja, fermento biológico em pó, adubo orgânico, farinha de trigo, pó de arroz, pó de ovo ou alimentos industrializados próprios. Ao consumir determinado tipo de alimento, a Artémia pode tomar as cores desde rosa pálido a avermelhado, branco ou esverdeado. O habitat natural da Artémia são as regiões de água salgada concentrada (salinas), onde, por haver poucos predadores a sua sobrevivência é maior. No entanto, como foi referido acima, existe a criação de Artémias em cativeiro (aquacultura), e isto deve se principalmente à composição rica em proteínas, vitaminas (A e Caroteno) e sais minerais deste ser, que os torna num dos melhores alimentos para os peixes. Ajudam na recuperação rápida de doenças dos peixes e os seus náuplios são indispensáveis na alimentação de várias espécies de alevins de aquacultura. São animais em constante estado de locomoção, pois são animais filtradores e dependem disso para se alimentarem e respirarem. Esta locomoção é possível pela existência de 11 pares de pernas torácicas, cada uma com 7 enditos com finíssimos sílios que actuam na filtração e recolha de alimentos. Esta morfologia ajuda na alimentação, porque as pernas formam caixas filtradoras quando se movimentam para a frente, confinando o alimento que será filtrado. São também um animal osmorregulador e por isso conseguem sobreviver em ambientes de concentrações de sal que vão de 2,6% até ambientes super saturados em NaCl (Doyle e McMahon, 1995).
Quanto à reprodução da Artémia, pode se dizer que apresenta um fácil dimorfismo sexual e que atinge a fase adulta aproximadamente aos 2 dias de vida. A morfologia da fêmea é diferente da do macho. A fêmea possui uma bolsa incubadora no último segmento torácico enquanto o macho apresenta apêndices abdominais e antenas maiores que servem para envolver a fêmea durante a copulação. Pode se reproduzir sexuadamente por copulação, produzindo dois tipos de ovos: uns de envolto fino e frágil, outros de envolto rijo e forte; por viviparidade, ocorrendo a libertação directa de náuplios; ou por oviparidade, na qual os embriões se desenvolvem até a fase gástrula e se encapsulam nesse estágio dentro de uma casca interrompendo o seu metabolismo e podendo permanecer como cistos durante um longo período de tempo. Ainda se pode reproduzir por partenogénese, que consiste no desenvolvimento dos óvulos não fecundados, dando origem a descendentes clones da mãe visto terem o mesmo património genético resultado da não fecundação. Fig 1. Principais diferenças entre a Artémia Fêmea (imagem da esquerda) e a Artémia Macho (imagem da direita) (http://clientes.netvisao.pt/ut2157/artemia_sp.htm ) Nesta experiência o objectivo foi o de descobrir até que ponto, sendo a Artémia um ser osmorregulador, consegue suportar determinadas reduções de teor em sal, logo após o nascimento dos mesmos, pois sabe se que estes são mais sensíveis a mudanças de toxicidades nessa altura, do que no estado adulto (Doyle e McMahon, 1995). Fig 2. Fotografia de uma artémia retirada com o auxílio do microscópio óptico 2. Material e Métodos As Artémias utilizadas nesta experiência eram da espécie Artemia franciscana e foram disponibilizadas em cistos, tendo sido necessário realizar a sua eclosão. Para tal, como são animais
de águas salgadas, é necessária a utilização de uma água marinha artificial (solução de concentração de salinidade de 35, contendo NaCl, KCl, CaCl2, MgCl2, MgSO4, NaHCO3, H3BO3) num balão volumétrico de 1ml (Libes, 1992). Porém, como o objectivo da experiência foi o de se verificar o efeito da salinidade na mortalidade destes organismos, e sabendo que estes são animais marinhos, o tóxico para eles será portanto, uma solução com reduzida concentração de sais (água doce artificial). Assim, produziuse 2ml de água doce artificial (contendo os sais NaHCO3, CaCl2, MgSO4 e KCl ). Diluiu se a solução marinha artificial com a água doce artificial, usando um factor de diluição de 1:1, até se obterem duas novas soluções em balões volumétricos de 5 ml. Determinou se a condutividade das 4 soluções (água marinha 25, 1ªdiluição 3,5, 2ª Diluição,35 e Água doce) que serviram de referência para estudos subsequentes. A condutividade será relacionada com a salinidade (peso em gramas dos compostos sólidos, secos a peso constante a 48 C, obtidos a partir de 1 kg de água do mar), que é determinada através da clorosidade (peso de halogéneos, excepto o flúor, expresso em gramas de cloro por litro de água do mar) e da cloronidade (peso de halogéneos, excepto o flúor expresso em gramas de cloro por kg de água do mar). Essa relação foi estabelecida num gráfico, tendo se desenhado para tal, uma curva de calibração, que serviu de referência para os restantes cálculos de salinidade. A clorosidade foi determinada pelo método de Mohr, através de uma titulação com nitrato de prata, uma vez que a maior parte dos sais dissolvidos na água do mar existe sob a forma de halogéneos (Sawyer et al, 1994). Os resultados laboratoriais relacionados com a determinação da salinidade e cloronidade foram registados num quadro idêntico ao quadro 1. Quadro 1. Folha de registo de resultados laboratoriais utilizada na determinação da cloronidade e da salinidade. Vamostra Amostra (l) Branco (água desionizada) Água diluição,35 3,5 35 Vágua desionizada (l) N titulante (AgNO3) Vtitulante (l) Cl- na amostra (g/l) cloronidade ( ) salinidade ( ) Os cálculos efectuados na determinação da cloronidade e da salinidade foram os seguintes: Cl na amostra (g/l) = [Ar(Cl) (g/mol) * N titulante (AgNO3) * Vtitulante (l)] [(Ar(Cl) (g/mol) * N titulante (AgNO3) * Vtitulante (l) *Vágua desionizada (l)] cloronidade ( ) = Cl na amostra (g/l) / Va (l) / massa de água do mar por litro de água do mar (g) * 1 = Cl na amostra (g/l) / Va (l) / 119,2 * 1 Salinidade ( ) = 1,8655 * cloronidade ( ), segundo Knudsen Os cistos foram incubados numa placa de Petri com 1 ml da solução marinha artificial, a 25 C, e com uma intensidade luminosa de 3 4 lux. Eclodiram num período de 3 horas.
Fig 3. Placa de Petri após as 3 horas de incubação das Artémias Preparou se o teste preliminar, com soluções com as seguintes concentrações: H2O marinha 35, 1ª Diluição 8,75 (C2), 2ª Diluição 2,188 (C3), 3ª Diluição,547 (C4), 4ª Diluição,137 (C5). Na preparação destas soluções, diluiu se a água marinha com a água doce, tendo se utilizado um factor de diluição de 1:4. Determinou se a condutividade destas soluções. Determinou se a salinidade de cada uma das soluções, usando a recta de calibração entre a condutividade e a salinidade. Com as soluções C1, C2, C3, C4, C5 e uma C6 que representa a água doce, pipetou se 4ml de cada uma e repartiu se o volume pelas 4 células de plástico dos recipientes de ensaio de cada coluna. Transferiram se cerca de 5 artémias para a primeira célula (célula de lavagem) de cada coluna e a partir daí transferiram se para cada uma das células de ensaio. Repetiu se este procedimento para as outras colunas de diferentes concentrações, começando da mais diluída para a mais concentrada, para evitar a contaminação entre as soluções de ensaio. A placa depois de completa e tapada, foi colocada numa câmara termostática a 25 C, durante 24horas, sem luminosidade. Ao fim das 24horas, fez se a contagem das artémias mortas. Foi necessário repetir se o teste com um intervalos de concentrações mais curto. Usou se um novo factor de diluição (1,35) e a concentração inicial foi de 2,25 a partir da qual foram feitas mais quatro diluições. O volume a transferir do balão C6 para o balão C1 foi arredondado para 13 ml. O volume transferido de C1 para C2, C2 para C3, C3 para C4, C4 para C5, foi arredondado para 148ml. Determinou se o valor da salinidade para cada amostra, usando a recta de calibração da relação: condutividade vs salinidade. Efectuou se novamente a incubação dos cistos das Artémias, com as mesmas condições do teste preliminar. Preparam se as placas de observação, desta vez com as novas soluções, de igual modo ao que se fez no teste preliminar.
Fig 4. Colocação das artémias na placa de observação com diferentes concentrações Ao fim das 24horas, fez se a contagem de mortes das artémias. Determinou se o CL5 24horas. Este novo ensaio foi designado por teste definitivo. 3. Resultados e Discussão No quadro 2 apresentam se os valores da condutividade e temperatura das quatro soluções de calibração: água marinha artificial, (com concentração máxima), a 1ºdiluição da água marinha, a 2º diluição da água marinha (feitas por factor de 1:1) e a água doce artificial. Quadro 2. Valores de condutividade e temperatura das soluções de calibração. Água marinha 35 1ª Diluição 3,5 2ª Diluição,35 Água doce Condutividade (ms/cm) 45,8 5,88 1,15,563 Temperatura (ºC) 22,4 22,4 22,7 22,6 Como era de esperar, a solução mais concentrada em sais é a que apresenta maior condutividade. No quadro 3 estão apresentados os valores que foram registados durante a titulação das soluções de calibração. Quadro 3. Valores de volumes de amostras, água desionizada e titulantes, concentrações de titulantes, clorosidade, cloronidade e salinidade das amostras ensaiadas no teste preliminar. Amostra Vamostra (l) Vágua desionizada (l) N titulante (AgNO3) Vtitulante (l) Cl na amostra (g/l) cloronidade ( ) salinidade ( ) Água diluição,2,282,29,145,142,257,35,1,1,282,31,32,297,536 3,5,2,2,48 1,7 1,67 3,2 35,5,15,2,117 16,6 16, 3 29,4 Com estes resultados, foi possível construir a figura 5 que mostra a relação condutividade vs salinidade. Assim o processo de encontrar a salinidade torna se mais rápido e menos trabalhoso no futuro para outras soluções. Basta ter os valores de condutividade da solução em
causa que, por substituição de valores na recta de calibração se encontra o respectivo valor de salinidade. 35 salinidade ( ) 3 25 2 15 1 5 y =,639x R 2 =,999 1 2 3 4 5 condutividade (ms/cm) Fig 5. Curva de calibração: condutividade vs salinidade Do mesmo modo construiu se a figura 6 que mostra a relação: condutividade vs concentração de cloretos. Cl- na amostra (g/l) 18 16 14 12 1 8 6 4 2 y =,365x R 2 =,999 1 2 3 4 5 condutividade (ms/cm) Fig 6. Curva de calibração: condutividade vs Cl- na amostra O quadro 4 representa a condutividade e a temperatura das soluções em que as Artémias foram colocadas no teste preliminar. Quadro 4. Valores de condutividade e temperatura das soluções do teste preliminar. Condutividade (ms/cm) Temperatura ( C) H2O marinha 35 (C1) 1ª Diluição 8,75 (C2) 2ª Diluição 2,188 (C3) 3ª Diluição,547 (C4) 4ª Diluição,137 (C5) H2O doce (C6) 45,6 13,1 3,97 1,439,768,563 21,2 21,4 21,6 21,5 2,9 22,6 Foi possível determinar o valor de salinidade com base nas condutividades de cada solução usando a figura 5 e a concentração de Cl usando a figura 6.
Quadro 5. Valores de condutividade, salinidade e concentração de Cl das soluções do teste preleminar. Amostras Condutividade (ms/cm) Salinidade ( ) Concentração de Cl C1 45,6 29,1 16,4 C2 13,1 8,31 4,69 C3 3,97 2,54 1,43 C4 1,439,92,519 C5,768,491,277 C6 (água doce),563,36,23 Os quadro de 6 a 8 mostram o resultado da mortalidade das Artémias nas soluções no ensaio preliminar, ao fim das 24horas. Quadro 6. Resultados do ensaio preliminar preparado por um técnico experiente (ensaio1) Ensaio C6 C5 C4 C3 C2 C1 A 1 8 9 1 B 1 8 5 1 C 1 1 9 2 Nº mortos 3 26 23 3 1 Nº org. testados 3 3 3 3 3 3 % de mortalidade 1 86, 7 76, 7 1 3,3 Quadro 7. Resultados do ensaio preliminar preparado por um técnico menos experiente (ensaio2a) Ensaio C6 C5 C4 C3 C2 C1 A 1 B 7 1 C 9 1 2 1 Nº mortos 26 1 3 1 Nº org. testados 3 3 3 3 3 3 % de mortalidade 86, 7 3,3 1 3,3 Quadro 8. Resultados do ensaio preliminar preparado por um técnico menos experiente e com leitura de um técnico mais experiente (ensaio2b) Ensaio C6 C5 C4 C3 C2 C1 A 1 B 1 1 1 C 1 1 5 2 1 Nº mortos 3 1 6 2 2 Nº org. testados 3 3 3 3 3 3 % de mortalidade 1 3,3 2 6, 7 6,7 Deve se ainda construir gráficos que mostrem a relação dos resultados destes quadros com o log da salinidade e o log da concentração de Cl.
Quadro 9. Valores da % de mortalidade de cada ensaio, da condutividade, do log da concentração de Cl e do log da salinidade de cada solução log %mortalidade %mortalidade %mortalidade Condutividade concentração log das artémias das artémias das artémias Amostras (ms/cm) Cl salinidade (ensaio1) (ensaio2a) (ensaio2b) C1 45,6 1,21587112 1,46446571 3,33 6,66 C2 13,1,671182566,919778155 C3 3,97,155695776,44291365 1 3,33 6,66 C4 1,439,28533937,36438348 76,67 1 2 C5,768,557733511,39137922 86,66 3,33 3,33 C6,563,692586336,44399747 1 86,66 1 %mortalidade das artémias (ensaio1) 1 8 6 4 2-1 -,5,5 1 1,5 %mortalidade das artémias (ensaio2a) 1 8 6 4 2-1 -,5,5 1 1,5 log concentração Cl- log concentração Cl- %mortalidade das artémias (ensaio2b) 12 1 8 6 4 2-1 -,5,5 1 1,5 log concentração Cl- %mortalidade das artémias (ensaio1) 1 8 6 4 2-1 -,5,5 1 1,5 2 %mortalidade das artémias (ensaio2a) 1 8 6 4 2-1 -,5,5 1 1,5 2 %mortalidade das artémias (ensaio2b) 12 1 8 6 4 2-1 -,5,5 1 1,5 2 Como se pode ver por observação dos gráficos, o ensaio 2a e 2b, tendo sido realizados pelo mesmo técnico menos experiente e tendo sido avaliada pelos dois tipos de técnico, os valores da solução C5 estão deslocados daquilo que se esperava. Uma provável explicação para este acontecimento poderá ser o facto da solução C5 ter sido a primeira a ser preparada pelo técnico menos experiente. Havia provavelmente falta de sensibilidade no manuseamento da micropipeta,
que levava assim um volume excessivo de água da solução mãe para a célula de lavagem e desta para a célula de observação. Como o resultado em percentagem for insuficiente, não indicando concretamente o valor de 5% de mortes, repetiu se o procedimento numa escala de concentração mais reduzida (ensaio definitivo), entre o intervalo onde provavelmente estaria o valor de 5% de mortalidade para as Artémias. O quadro seguinte regista os valores da condutividade e temperatura dessas novas soluções preparadas com concentrações próximas dos 5% de mortalidade para as Artémias (teste definitivo). Quadro 1. Valores de condutividade e temperatura das soluções do teste definitivo Condutividade (ms/cm) Temperatura ( C) S. Inicial 2,25 (C1) 1ª Diluição 1,665 (C2) 2ª Diluição 1,232 (C3) 3ª Diluição,912 (C4) 4ª Diluição,675 (C5) Controlo 35 (C6) 4,19 3,26 2,57 2,2 1,54 45,6 21,8 22, 22,2 21,8 22, 22,4 Determinou se de novo o valor de salinidade com base nas condutividades de cada solução usando a figura 5 e a concentração de Cl usando a figura 6 (quadro11). Quadro 11. Valores de condutividade, salinidade e concentração de Cl das soluções do teste definitivo Amostra Condutividade (ms/cm) Salinidade ( ) Cl- na amostra (g/l) C6 (controlo:h2o da artémia) 45,8 29,3 16,5 C1 4,19 2,68,965 C2 3,26 2,8,751 C3 2,57 1,64,592 C4 2,2 1,29,465 C5 1,54,984,355 Os quadros seguintes mostram o resultado da mortalidade das Artémias nas soluções do ensaio definitivo, ao fim das 24 horas de exposição. Quadro 12. Resultados do ensaio definitivo preparado por um técnico experiente (ensaio1) Ensaio C6 C5 C4 C3 C2 C1 A 7 8 7 2 1 B 9 7 6 1 C 7 5 3 2 Nº mortos 23 2 16 5 1 Nº org. testados 3 3 3 3 3 3 % de mortalidade 76,7 66, 7 53,3 16, 7 3,3 Quadro 13. Resultados do ensaio definitivo preparado por um técnico menos experiente (ensaio2a) Ensaio C6 C5 C4 C3 C2 C1 A 9 9 4 2 B 8 7 6 2 2 C 7 7 4 1 Nº mortos 24 23 14 5 2 Nº org. testados 3 29 3 3 3 3 % de mortalidade 82,8 76, 7 46, 7 16,7 6, 7
Quadro 14. Resultados do ensaio preliminar preparado por um técnico menos experiente e com leitura de um técnico mais experiente (ensaio2b) Ensaio C6 C5 C4 C3 C2 C1 A 9 9 3 2 1 B 8 7 6 2 2 C 1 9 5 1 Nº mortos 27 25 14 5 3 Nº org. testados 3 29 3 3 3 3 % de mortalidade 93,1 83,3 46,7 16,7 1 Deve se ainda construir os gráficos que mostram a relação dos resultados destas tabelas com o log da salinidade e o log da concentração de Cl. % mortalidade das artémais (ensaio 1) -,5 -,4 -,3 -,2 -,1 log concentração Cl- 9 8 7 6 5 4 3 2 1 % mortalidade as artémias (ensaio2a) -,5 -,4 -,3 -,2 -,1 log concentração Cl- 9 8 7 6 5 4 3 2 1 % mortalidade as artémias (ensaio2b) 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 -,5 -,4 -,3 -,2 -,1 log concentração Cl- % mortalidade das artémais (ensaio 1) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 -,1,1,2,3,4,5 % mortalidade das artémais (ensaio 2a) 9 8 7 6 5 4 3 2 1 -,1,1,2,3,4,5
% mortalidade das artémais (ensaio 2b) 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 -,1,1,2,3,4,5 Com a obtenção destes valores finais e para possibilitar uma leitura mais fácil dos mesmos, foram construídos dois gráficos: um relativo ao log concentração Cl vs média da % de mortalidade e o outro relativo ao log da salinidade vs média da % de mortalidade. Estes gráficos representaram a média dos resultado dos três ensaios definitivos. Eliminaram se os pontos extremos das curvas, porque não se encontram na zona de linearidade. log concentração Clmédia % mortalidade y = -283,24x - 17,569 R 2 =,9966 -,35 -,3 -,25 -,2 -,15 -,1 -,5 9 8 7 6 5 4 3 2 1 média % mortalidade 9 8 7 6 5 4 3 2 1 y = -283,24x + 17,93 R 2 =,9966,5,1,15,2,25,3,35 Calculou se a CL5 24h (concentração letal para 5% da população testada após 24 horas de exposição), que foram de,58 g Cl /l, sendo equivalente a 1,6 em salinidade. Conclusões As Artémias apresentaram sensibilidade a um ambiente com uma reduzida salinidade. Para um concentração de Cl igual a,58 g/l sendo equivalente a uma salinidade de 1,6, constatou se que metade da população das artémias morreu ou tinha dificuldades na mobilidade. Agradecimentos À Agência Nacional para a Cultura Científica e Tecnológica Ciência Viva, que possibilitou a realização do estágio no âmbito do programa Ocupação Científica nas Férias e uma aproximação à realidade científica e tecnológica. À Universidade Nova de Lisboa Faculdade de Ciências e Tecnologia Grupo de Disciplinas de Ecologia da Hidrosfera pelas condições que proporcionou para a realização do estágio. Aos orientadores de estágio Professor Nuno Lapa e Engenheiro Rui Barbosa pela simpatia, ajuda e enriquecimento de saberes.
Referências Bibliográficas Doyle, Jason E.; McMahon, Brian R., Effects of acid exposure in the brine shrimp Artemia franciscana during development in seawater, Elsevier Science Inc. 1995, Canada. Libes, Susan M., An Introduction to Marine Biogeochemistry, John Wiley & Sons Inc. 1992, South Carolina, 34. Sawyer, Clair N.; McCarty, Perry L.; Parkin, Gene F., Chemistry for Environmental Engineering, 1994, Singapore, ISBN 7 11398 7, 59 514. Geraldo Luiz Soares Pereira, http://clientes.netvisao.pt/ut2157/artemia_sp.htm, consultada em 8/7/8