Ensaios imunes Profª Heide Baida
Introdução A produção de anticorpos, parte fundamental da resposta imune adaptativa e que compõem o que chamamos de resposta imune humoral, é o tipo de resposta específica e direcionada. O antígeno que estimulou sua produção pode ser de origem viral, bacteriana, fúngica, tumoral, etc... Os anticorpos, assim como alguns antígenos, circulam pelos líquidos corpóreos e podem ser dosados e analisados de forma qualitativa e quantitativa; Os teste imunes simulam in vitro os processos imunes in vivo, fornecendo assim dados sobre o estado clínico do paciente e sobre a infecção que está sendo pesquisada.
Ensaios imunes não marcados
Introdução São ensaios onde a ligação Antígeno/Anticorpo (Ag/Ac) é visualizada sem o auxílio de marcadores; A ligação Ag/Ac é detectada macroscopicamente podendo, em alguns casos, ser auxiliada pelo microscópio óptico; As principais técnicas imunes não marcadas são: 1. Imunoprecipitação 2. Aglutinação 3. Ensaios líticos (fixação de complemento)
Imunoprecipitação Preferencialmente, o antígeno deve conter vários epítopos e consequentemente ocorre a dosagem policlonal dos anticorpos; A concentração de antígenos e anticorpos deve ser bem definida, para que não ocorra o fenômeno conhecido com Pró zona ; Define se a concentração ideal através da análise de várias diluições, até que seja encontrada a Zona de Equivalência
Zona de equivalência e Efeito Pró zona Pró zona
Imunoprecipitação Para melhor visualização dos imunocomplexos (ligações Ag/Ac), os testes são realizados em meio gelificado, que proporcionam e formação de uma linha de precipitado, visível a olho nú. Técnica de IMUNODIFUSÃO: utiliza se gel de agarose onde as moléculas (tanto antígenos como anticorpos) difundem se e encontram se, formando então os complexo Ag/Ac, que possuem alto peso molecular e ficam imobilizados no gel. Formou se então o imunoprecipitado, que é visível. A técnica pode ser executada como:
Conceito de Difusão DIFUSÃO: o soluto é transportado devido ao movimento aleatório das moléculas que o compõem, onde o choque aleatório e a agitação térmica entre elas promove o movimento e a passagem do meio mais concentrado para o meio menos concentrado. DIFUSÃO PASSIVA: é um processo físico a favor de um gradiente de concentração.
Difusão MOLÉCULAS SOLVENTE
Imunoprecipitação 1. IMUNODIFUSÃO SIMPLES: Ocorre a imobilização de um dos componentes (anticorpo ou antígeno) no meio gel. Após a gelificação, adiciona se ou outro componente e aguarda se (por cerca de 1 semana) a formação da linha de precipitação na zona de equivalência.
Imunoprecipitação 2. IMUNODIFUSÃO SIMPLES RADIAL: Ocorre a imobilização de um dos componentes (anticorpo ou antígeno) no meio gel. A mistura é então adicionada a uma lâmina. Após a gelificação, orifícios são abertos no gel e adiciona se o segundo componente aos orifícios. Ocorrerá e difusão simultânea através do gel e consequentemente a formação da linha de precipitação na zona de equivalência.
Imunodifusão Simples Radial
Imunoprecipitação 3. IMUNODIFUSÃO DUPLA RADIAL: Neste método não há incorporação dos componentes ao gel. Ambos difundem se pelo gel através de orifícios, formando as linhas de precipitação nas zonas de equivalência.
Imunodifusão Dupla Radial
Imunoprecipitação 4. IMUNOELETROFORESE: 4.1. ELETROFORESE: Consiste na migração de moléculas com diferentes potenciais elétricos e pesos moleculares em um meio condutor, submetidas a um campo elétrico. Utiliza se, via de regra, gel de ágar e poliacrilamida.
Imunoprecipitação 4. IMUNOELETROFORESE: 4.2. IMUNODIFUSÃO RADIAL: Após a migração das moléculas por eletroforese, anticorpos específicos para as moléculas estudadas são adicionadas a uma canaleta, de onde irão se difundir e se ligar aos antígenos (no caso, as moléculas a serem estudadas), evidenciando cada uma das moléculas, separadamente.
Imunoeletroforese
Imunoprecipitação Variações da Imunoeletroforese: Imunofixação: utiliza se esta técnica para a pesquisa de classes e subclasses de anticorpos dirigidos a um determinado antígeno, separado previamente por eletroforese. Eletroimunodifusão: ambos (antígeno e anticorpo) migram mediante a aplicação de um campo elétrico.
Imunoprecipitação Automação nos ensaios de Imunoprecipitação: Nefelometria: A medição é feita através da dispersão de luz, provocada pela presença dos complexos Ag/Ac; Turbidimetria: a detecção é feita através de absorbância.
Aglutinação Nesta técnica, antígeno ou anticorpo são adsorvidas a partículas ou células (tais como as hemácias), estes componentes fazendo parte da FASE SÓLIDA da reação; A aglutinação ocorre por ligações simultâneas dos anticorpos e antígenos, tornando se visível a olho nú podendo, em alguns casos, ter o auxílio do microscópio óptico; O teste pode ser realizado em tubo, placas contendo orifícios, lâminas de vidro (como as Placas de Kline); A técnica pode ser executada de várias formas:
Aglutinação 1. AGLUTINAÇÃO DIRETA: nesta técnica, o antígeno é parte integrante da célula que teoricamente está servindo de fase sólida da reação. Um clássico exemplo da aglutinação direta é a TIPAGEM SANGUÍNEA, também conhecida como HEMAGLUTINAÇÃO.
Aglutinação Direta Tipagem Sanguínea TIPO A TIPO B TIPO AB TIPO O Sangue do paciente ANTICORPOS Anti B ANTICORPOS Anti A AUSÊNCIA DE ANTICORPOS ANTICORPOS Anti Ae ANTICORPOS Anti B Resultados do Teste de Hemaglutinação AGLUTINAÇÃO com soro Anti A Ausência de aglutinação com soro Anti B AGLUTINAÇÃO com soro Anti B Ausência de aglutinação com soro Anti A AGLUTINAÇÃO com soro Anti A AGLUTINAÇÃO com soro Anti B Ausência de aglutinação com soro Anti A Ausência de aglutinação com soro Anti B
Aglutinação Direta Tipagem Sanguínea
Aglutinação Direta Tipagem Sanguínea RESULTADO NEGATIVO RESULTADO POSITIVO
Aglutinação 2. AGLUTINAÇÃO INDIRETA: nesta técnica, o antígeno ou anticorpo é adsorvido a uma partícula ou célula que não interfere na reação Ag/Ac. As partículas mais utilizadas são as de látex e as células mais utilizadas são as hemácias formolizadas de aves e carneiro.
Aglutinação Indireta A. PESQUISA DE ANTICORPOS B. PESQUISA DE ANTÍGENOS
Aglutinação Indireta RESULTADO QUANTITATIVO
Aglutinação 3. INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO DIRETA: alguns antígenos virais possuem a capacidade de se ligar às hemácias de seus hospedeiros. São chamados de HEMAGLUTININAS. Quando o indivíduo possui anticorpos específicos para o vírus pesquisado, este se ligará ao mesmo (na primeira etapa do teste) impedindo que esta hemaglutinina se ligue às hemácias (na segunda etapa do teste).
Inibição da Aglutinação Direta
Aglutinação 4. INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO INDIRETA: Utilizada na pesquisa de antígenos, onde o anticorpo específico se liga ao antígeno presente na amostra pesquisada, evitando e aglutinação.
Inibição da Aglutinação Indireta
Aglutinação 5. FLOCULAÇÃO: Ocorre a formação de imunocomplexos em meio líquido, observado à olho nú ou com auxílio de mcroscópio óptico. O exemplo clássico é a reação de VDRL (Veneral Disease Research Laboratories), utilizado no diagnóstico e também no acompanhamento evolutivo do tratamento da Sífilis.
Floculação
Ensaios Líticos O princípio consiste em detectar antígenos ou anticorpos, tendo como resultado final a HEMÓLISE (destruição das hemácias); Utiliza se as proteínas do Sistema Complemento para promover a hemólise, pois são proteínas que se ativam na presença de anticorpos (IgG ou IgM), culminando no final do processo na formação do "Complexo de Ataque à Membrana", que fura a membrana celular (no caso, as hemácias) e provoca sua lise; Este tipo de ensaio imune recebe o nome de "Reação de Fixação do Complemento" RFC
Reação de Fixação do Complemento Pesquisa de ANTICORPOS: amostra é colocada junto com o antígeno e as proteínas do sistema complemento. Finalmente é adicionado o sistema indicador (hemácias revestidas com anticorpos anti hemácias). NA AMOSTRA QUE CONTÉM ANTICORPOS NÃO OCORRE HEMÓLISE AMOSTRA ANTÍGENO + PROTEÍNAS DO COMPLEMENTO AMOSTRA COM ANTICORPOS AMOSTRA COM ANTICORPOS + SISTEMA INDICADOR
Reação de Fixação do Complemento AMOSTRA ANTÍGENO + PROTEÍNAS DO COMPLEMENTO AMOSTRA SEM ANTICORPOS AMOSTRA SEM ANTICORPOS + SISTEMA INDICADOR AMOSTRA NEGATIVA COM HEMÓLISE
Figuras extraídas: Biologia Molecular da Célula Alberts Imunobiologia Janeway Imunologia Kuby Imunoensaios Vaz Google Obrigada!