Biossistemas e Biorreações Prof. Maria Alice Zarur Coelho Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos Escola de Química UFRJ
Redes de Reações Bioquímicas Evolução resultou em uma complexa rede metabólica para garantir as funções adequadas das células vivas Quando o conjunto de reações da rede metabólica é agrupado em uma única reação: Modelos caixa-preta utéis para fechar os balanços de massa (carbono) entrada e saída da célula
Um olhar para dentro da célula Aumenta a complexidade do sistema conforme as reações intracelulares são consideradas Balanço constante entre a formação e o consumo de metabólitos intracelulares impõe um grande número de restrições nos fluxos através dos diferentes ramos da rede metabólica Mesmo que a complexidade aumente, o número de graus de liberdade do sistema não necessariamente aumenta!
Conceitos Básicos Uso dos fluxos de entrada e saída de material da célula: diretamente mensurados In vivo versus In vitro: Controle enzimático é perdido nas medidas in vitro Medidas de atividade enzimática usam a concentração de substrato e de todos os metabólitos que influenciam a cinética enzimática Os fluxos in vivo podem ser calculados através dos diferentes ramos da rede balanço metabólico
Considere uma rede na qual sejam identificados: J fluxos ou v 1 v J taxas de reações N substratos M produtos metabólicos (excretados) µ - taxa específica de crescimento da biomassa Taxas mensuráveis: r 1,, r N+M+1
Restrições impostas pelos balanços de massa: a concentração de um dado metabólito é constante, i.e., a taxa líquida de produção do metabólito é zero Formalmente para todos os metabólitos intracelulares, os fluxos que chegam a um dado metabólito são balanceados pelos fluxos que partem deste metabólito, não havendo acúmulo líquido do mesmo.
EMP - Exemplo r 3PG = 0
Balanço Redox Resultado da oxidação do substrato a produto Reações podem envolver mais de um tipo de espécie redox (NADH ou NADPH) Compartimentalização da célula: NADH do citosol versus NADH da mitocôndria não são intercambiáveis...
Equivalentes de energia Expressos em ATP Conversão de um metabólito em outro com menor nível energético: liberação de ATP ou dissipação de calor (diferença energia livre de Gibbs)
O grau de redução é especificado pela combinação linear dos balanços elementares onde os fatores de multiplicação, na combinação linear, são os níveis redox (ou grau de redução) dos elementos. Não introduz nenhum balanço extra... Quando todos os balanços elementares são satisfeitos, o balanço redox fecha automaticamente. Exemplo: Fermentação anaeróbia de levedura estequiometria: -CH 2 O + 0.510 CH 3 O 1/2 + 0.275 CO 2 + 0.137 X + 0.077 CH 8/3 O = 0 balanço redox: -4 x 1 + (6 x 0.510 + 0 x 0.275 + 4.18 x 0.137 + 4.67 x 0.077) = -0.0078 0
Crescimento Energético Conteúdo intracelular de ATP deve ser rigorosamente controlado... balanço entre a energia livre produzida pelos processos catabólicos e o subseqüente uso na biossíntese dos constituintes celulares no anabolismo. turnover de ATP é baixo
Consumo de ATP para manutenção celular Metabolismo endógeno (Hebert, 1959) resulta no decréscimo da biomassa cuja degradação seria um processo de 1ª ordem: µ e = taxa específica de degradação da biomassa (-r S ) = Y XS µ + Y XS µ e degradação da massa celular parte associada ao crescimento m S coeficiente de manutenção celular (Pirt, 1965)
Processos de manutenção celular Manutenção de gradientes (H + ) e potencial elétrico através da membrana celular Ciclos fúteis: geração de calor na hidrólise de ATP frutose-6p! frutose 1,6-P! frutose-6p ATP Turnover de macromoléculas (p.ex. mrna) Altas taxas de crescimento: maior turnover de macromoléculas aumento da atividade intracelular maior perda de energia em ciclos fúteis
ATP requerido para síntese da biomassa r ATP = Y X,ATP µ -m ATP Meios complexos fornecem valores menores que em meios mínimos determinado com precisão em condições anaeróbicas
Energética de Processos Anaeróbios Nao há consumo de oxigênio Obtém ATP para crescimento ao nível da fosforilação do substrato (usa outros aceptores finais de elétrons) Muitos microrganismos anaeróbios facultativos não possuem a via da fosforilação oxidativa bactérias do ácido lático ausência de citocromo C presença de O 2 ajuda a manter baixos os níveis de NADH através da ação das NADH-oxidases que usam O 2 como aceptores de elétrons
Produtos finais do catabolismo em crescimento anaeróbico: etanol, ácido lático e acetato Outros produtos como acetoína, acetona e butanol podem ser formados em condições anaeróbicas (Clostridium acetobutylicum) Microrganismos heterofermentativos! formam mais de um produto para balancear co-fatores NADH e NADPH (exceto para crescimento em meio rico) Rede metabólica mais complexa
Produção de ácido lático correlacionada com a produção de ATP (1 mol de ATP por mol de ác. lático produzido): Célulademonstra habilidadeemse ajustar ao ambientehostil, reduzindoo consumode ATP nosprocessosde manutençãocelular µ> 0.3 h -1 Y X,ATP = 15 mmoles ATP (g p.s.) -1 m ATP = 18 mmoles ATP (g p.s. h) -1 Meio rico, i.e. célula usa ATP para reações de polimerização µ < 0.3 h -1 Y X,ATP = 50 mmoles ATP (g p.s.) -1 m ATP = 7 mmoles ATP (g p.s. h) -1 Exaustão de um ou mais componentes do meio - uso de ATP para crescimento é maior
Energética de Processos Aeróbios Obtém mais energia pela completa oxidação do substrato ATP é formado na fosforilação oxidativa Processo de crescimento celular começa com a formação de precursores metabólicos (1); blocos de construção são sintetizados (2) a partir destes precursores; e depois polimerizados em macromoléculas (3) (1) CO 2 e NADH são obtidos como co-produtos (2) NADPH e ATP são requeridos (3) requer ATP
Síntese de Biomassa: biomassa + Y xc CO 2 + Y X,NADH NADH (1+Y XC ) CH 2 O Y X,ATP ATP Y X,NADPH NADPH = 0
Redes Metabólicas Simples (i) Crescimento anaeróbio de S. cerevisiae Etanol = principal produto metabólico Glicerol = formado como resultado do balanço redox (balancear nível de NADH) di-hidroxiacetona fosfato NAD glicerol 3P NADH glicerol
Glicose (s) v 1 v 2 Biomassa (x) v 4 P v 5 Acetaldeído (a) v 3 Glicerol (g) Etanol (p) V 1 : -1.12 CH 2 O + CH 1.74 O 0.6 N 0.12 + 0.12 CO 2 + 0.15 NADH 2.42 ATP = 0 V 2 : -1.5 CH 2 O + CH 2 O 0.5 + 0.5 CO 2 + 0.5 NADH + 0.5 ATP = 0 V 3 : - CH 2 O 0.5 + CH 3 O 0.5 0.5 NADH = 0 V 4 : - CH 2 O + CH 8/3 O 0.333 NADH 0.333 ATP = 0 V 5 = V 2 V 3
Análise de fluxos em grandes redes metabólicas Identificação da estrutura da rede metabólica (topologia) Quantificação dos fluxos através dos ramos da rede Ensaios enzimáticos para confirmar presença de enzimas específicas e determinar as exigências em co-fatores; Substratos marcados (glicose 13 C)
Emprego de taxas mensuráveis Abordagem similar aos modelos de redes metabólicas simplificadas, e.g. " EMP " Ciclo TCA " Via do glioxilato " Carboxilação do piruvato " Formação de macromaléculas (proteínas, carboidratos e lipídios)
16 compostos 8 metabólitos intracelulares Taxas de formação e consumo mensuráveis para: glicose, amonia, CO 2, citrato, isocitrato, proteína, carboidratos e lipídios Pseudo estado estacionário para os metabólitos intracelulares: glicose 6P, piruvato, acetil-coa, 2- oxoglutarato, succinato, malato, oxaloacetato e glioxilato. Citrato e isocitrato constantemente produzidos
Com 15 fluxos e 8 equações de balanço = 7 graus de liberdade 7 taxas de reação a serem especificadas, a saber: 1. Consumo de glicose 2. Produção de CO 2 3. Produção de acido cítrico 4. Produção de isocitrato 5. Síntese de proteína 6. Síntese de carboidrato Impor uma restrição colocando uma das taxas da rede igual a zero (Aiba e Matsuoka, 1979) Modelo 1: via do glioxilato inativa; v 11 = 0 Modelo 2: piruvato carboxilase inativa; v 4 = 0 Modelo 3: ciclo TCA incompleto; v 8 = 0 Medidas in vitro das atividades das enzimas piruvato carboxilase, citrato sintase, isocitrato desidrogenase e isocitrato liase Via do glioxilato é inativa ou opera com uma taxa reduzida em C.lipolytica sob condições de produção de ácido cítrico
Emprego de substratos marcados O enriquecimento dos metabólitos intermediários de uma via depende da atividade desta via.
Biossíntese de lisina
Fluxo relativo aumenta com o aumento da concentração de amônia e ao mesmo tempo eleva a secreção de lisina! super-produção