ISSN: 1677-3118 Nº. 01/2012 Artigo A PROTOCOLO ACESSÍVEL PARA AULA PRÁTICA SOBRE FATORES FÍSICOS E QUÍMICOS QUE AFETAM A INTEGRIDADE DAS BIOMEMBRANAS Thiago Barros Galvão; Diana Aline Nôga Morais Ferreira; Leonardo Emmanuel Fernandes de Carvalho; Natânia Carol Cavalcante Rezende; Eduardo Luiz Voigt* Departamento de Biologia Celular e Genética, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Caixa Postal 1501, CEP 59072-970, Natal Rio Grande do Norte. Telefone: 84 3211-9209 Fax: 84 3215-3424. elvoigt@cb.ufrn.br *Autor para correspondência Resumo: O presente trabalho tem como objetivo a reformulação de um protocolo usado em aula prática para demonstrar os fatores que afetam a integridade das biomembranas. Cubos de beterraba foram usados como modelo experimental, pois os danos causados nas membranas podem ser visualizados pelo extravasamento de betacianinas, pigmentos hidrossolúveis presentes nos vacúolos. Os testes foram realizados em baterias experimentais analisando-se o efeito de fatores físicos e produtos químicos presentes no cotidiano do aluno. Para testar a temperatura, os cubos foram colocados em tubos de ensaio submetidos à condição de calor, frio e do efeito combinado de ambos, em diferentes tempos de exposição. Quando produtos químicos foram testados, os cubos foram tratados com solventes orgânicos (álcool e acetona comercial) ou substâncias polares e anfipáticas (desinfetante à base de detergente, detergente comercial, água oxigenada e água sanitária). Os resultados obtidos foram discutidos quanto à capacidade dos fatores físicos e químicos causarem danos às membranas. A reformulação deste protocolo com o uso de reagentes simples, baratos e encontrados na vida cotidiana do aluno, foi capaz de representar com clareza o efeito produzido pelos fatores testados, viabilizando a realização desta aula prática em espaços didáticos com condições limitadas. Palavras-chave: Prática de laboratório Membranas biológicas Permeabilidade. Abstract: The aim of the current work is to review a protocol used in practical classes to demonstrate some factors that affect biomembrane integrity. Sugar-beet fragments were utilized as the experimental model as membrane damage could be visualized by leakage of betacyanins, hydrophilic pigments accumulated in the cell vacuoles. The tests were carried out as discrete experiments utilizing physical agents and chemical products present in the student daily routine. To test the effect of temperature, sugar-beet fragments were submitted to heat, cold or both at different times of exposition. When chemical products were tested, sugar-beet fragments were exposed to organic solvents (common alcohol and acetone) or polar and amphipathic substances (disinfectant, detergent, hydrogen peroxide, and sodium hypochlorite). The obtained results were discussed in terms of the capacity of the physical and chemical factors to cause membrane damage. The review of this protocol using reagents that are present in the student daily routine were able to demonstrate clearly the effect of the different tested factors, allowing the utilization of this practical class under limited conditions. Keywords: Practical classes Biological membranes Permeability.
A2 I. INTRODUÇÃO O ensino de Biologia Celular e Molecular é uma tarefa desafiadora, pois essa disciplina trata de estruturas e processos microscópicos, sendo assim fundamentada em conceitos abstratos. Além disso, esta área do conhecimento tem apresentado muitos avanços recentes, estando sujeita a mudanças decorrentes do surgimento de novos conceitos [1]. Para alcançar a apreensão destes conceitos de maneira clara e eficiente, o professor necessita atualizar continuamente seus conhecimentos teórico-práticos, bem como fazer uso de instrumentos didáticos adequados [2]. Algumas estratégias são largamente empregadas em sala de aula por demonstrar rendimento e praticidade. Figuras esquemáticas, gráficos, vídeos explicativos e modelos tridimensionais, são alguns dos recursos utilizados para demonstrar estruturas e processos da maneira como eles ocorrem in vivo. No entanto, as aulas práticas se destacam como instrumentos didáticos promissores, porque tornam o conteúdo mais atrativo, envolvente e concreto [3]. As aulas práticas propiciam uma oportunidade para a vivência de todas as etapas do método científico, nas quais a observação e a compreensão de fenômenos levam o aluno ao registro sistematizado de dados e à formulação de hipóteses [4, 5, 6]. A manipulação de técnicas utilizadas em laboratório permite que o docente exercite habilidades e competências, como a cooperação com os colegas, a organização na bancada e a manipulação de equipamentos, imprescindíveis na formação acadêmica [7]. Além de permitirem a interação do aluno com os conceitos vistos em teoria, as aulas práticas realizam papel importante no aprendizado, ao fazer com que o professor estimule no aluno o caráter investigativo e a busca pelo conhecimento científico como uma conquista pessoal [8]. Apesar disso, a maioria das escolas apresenta escassez de material biológico, reagentes e equipamentos, devido ao custo elevado ou acesso restrito [5]. Como consequência, esta atividade acaba sendo banida da maioria das instituições públicas de ensino como escolas de nível fundamental e médio, assim como de faculdades e centros universitários [1]. Neste trabalho, um protocolo utilizado em aula prática para demonstrar os fatores que afetam a integridade das biomembranas foi reformulado com o intuito de tornar esta atividade mais acessível e demonstrar como produtos utilizados no cotidiano podem ser amplamente aplicados [6]. A escolha deste protocolo está relacionada à natureza abstrata do conteúdo, além das metodologias utilizadas para o estudo das membranas geralmente requererem equipamentos sofisticados e custos elevados, sendo necessárias iniciativas para viabilizar à realização destas demonstrações. Como modelo experimental, foram utilizados cubos de beterraba. Além de ser acessível e adequado aos propósitos da aula prática, este material possibilita ao aluno a observação de agentes que causam lesões nas membranas pelo extravasamento do pigmento hidrossolúvel betacianina, armazenado nos vacúolos. Neste sentido, o objetivo deste trabalho é reformular um protocolo de aula prática com o intuito de demonstrar a ação de agentes físicos e químicos sobre as membranas biológicas, utilizando produtos presentes na vida cotidiana do aluno. A reformulação deste protocolo não apenas viabiliza a realização de aulas práticas em condições mais limitadas, mas pode servir de modelo para a readequação de outros protocolos. II. MATERIAIS E MÉTODOS A aula prática foi proposta em baterias experimentais, avaliando a ação de fatores físicos e químicos sobre a permeabilidade das biomembranas. No primeiro momento, foi avaliado o efeito da temperatura, submetendo os cubos de beterraba ao calor e ao frio de forma isolada ou combinada. Posteriormente, foram utilizados produtos químicos
A3 rotineiramente usados como produtos de limpeza. Estas substâncias foram separadas pela sua natureza química em solventes orgânicos, substâncias polares e anfipáticas. II.I EFEITO DA TEMPERATURA Materiais Para determinar o efeito da temperatura foram utilizados os seguintes materiais: Beterraba Estilete Pinça Fogareiro Placa de Petri Tubos de ensaio Pipetas graduadas Água destilada Métodos Organize uma bateria de tubos de ensaio numerados de acordo com a tabela 1 e transfira os volumes com o auxílio de pipetas. Tabela 1. Preparação da prática para avaliação do efeito da temperatura. Tubo Volume (5 ml) Tratamento 1 Água destilada 25 º C (controle) 2 Água destilada 100º C - 20 s (calor) 3 Água destilada -18º C - 15 min (frio) 4 Água destilada -18º C -15 min + 100 º C - 20 s (calor + frio) Corte quatro cubos de beterraba e os lave em água corrente até a água ficar incolor; Coloque um cubo no tubo 1 e outro no tubo 2, mantendo em repouso por 15 min; Coloque dois cubos sobre uma placa de Petri levando ao congelador (-18 ºC) por 15 min. Logo depois, transfira os cubos para os tubos 3 e 4; Exponha ao calor em banho fervente (100 ºC) os tubos 2 e 4, durante 20 s e resfrie à temperatura ambiente; Observe e compare o extravasamento do pigmento. II.II EFEITO DE SOLVENTES ORGÂNICOS Materiais Para testar o efeito dos solventes orgânicos, foram utilizados os seguintes materiais e reagentes: Beterraba Estilete Pinça Tubos de ensaio Pipetas graduadas Filme de PVC Água destilada
A4 Acetona comercial (removedor de esmalte) Álcool comercial a 96º GL Métodos Organize uma bateria de tubos de ensaio numerados de acordo com a tabela 2 e transfira os volumes com o auxílio de pipetas. Tabela 2. Preparação da prática para avaliação do efeito dos solventes. Tubo Volume (5 gotas) Tubo Volume (5 ml) 1A Água destilada 1B Água destilada 2A Acetona comercial 2B Água destilada 3A Álcool comercial 3B Água destilada Corte três cubos de beterraba e os lave em água corrente até a água ficar incolor; Coloque um cubo em cada um dos tubos 1A, 2A, 3A, vede com filme PVC e incube à temperatura ambiente por 5 min; Em seguida, transfira os cubos para os tubos 1B, 2B e 3B; Observe e compare o extravasamento do pigmento. II.III EFEITO DE SUBSTÂNCIAS POLARES E ANFIPÁTICAS Materiais Para verificar o efeito de substâncias polares e anfipáticas, foram utilizados os seguintes materiais e reagentes: Beterraba Estilete Pinça Tubos de ensaio Pipetas graduadas Água destilada Desinfetante comercial 20% (v/v) Detergente comercial 10% (v/v) Água oxigenada comercial 10 volumes Água sanitária comercial 1:4 (v/v) Métodos Organize uma bateria de tubos de ensaio numerados de acordo com a tabela 3 e transfira os volumes com o auxílio de pipetas. Tabela 3. Preparação da prática para avaliação do efeito de substâncias polares e anfipáticas. Tubo Volume (5 ml) Tubo Volume (5 ml) 1C Água destilada 1D Água destilada 2C Desinfetante comercial 20% 2D 3C Detergente comercial 10% 3D Água destilada 4C Água oxigenada comercial 4D Água destilada 5C Água sanitária comercial 5D Água destilada
A5 Corte cinco cubos de beterraba e os lave em água corrente até a água ficar incolor; Coloque um cubo em cada um dos tubos 1C, 2C, 3C, 4C e 5C, incubando à temperatura ambiente por 5 min; Em seguida, transfira os cubos para os tubos 1D, 2D, 3D, 4D e 5D; Observe e compare o extravasamento do pigmento. III. RESULTADOS E DISCUSSÃO No presente trabalho, pretende-se demonstrar que protocolos de aulas práticas relativamente elaborados podem ser reformulados de modo a viabilizar a sua utilização em condições limitadas de reagentes e equipamentos. Neste sentido, são propostos métodos acessíveis para ilustrar os efeitos de fatores físicos e químicos sobre as biomembranas. O protocolo original sobre fatores que afetam a permeabilidade das membranas tem sido empregado em aulas práticas de Fisiologia Vegetal. Com a reformulação, este protocolo pode ser empregado na ilustração de fenômenos relacionados a outras disciplinas, como a Biologia Celular e a Bioquímica. Além disso, a execução desta prática permite o ensino do método científico e o desenvolvimento de diversas habilidades de manipulação e interpretação. O efeito dos diferentes agentes químicos e físicos sobre as membranas é estimado a partir do extravasamento de betacianinas, que são pigmentos hidrossolúveis contidos nos vacúolos das células de beterraba [13]. Para que haja o extravasamento das betacianinas, é necessário romper a membrana plasmática e a vacuolar das células de beterraba, caracterizando danos de membranas [14]. III.II EFEITO DA TEMPERATURA O efeito da temperatura sobre as membranas biológicas pode ser testado de forma simples, utilizando equipamentos comuns e facilmente disponíveis, como lamparina e geladeira. A exposição dos fragmentos de beterraba ao calor (100 C) causou danos de membrana progressivos, à medida que aumentava o tempo de exposição (10, 15 e 20 s). Os danos causados pelo calor são consequências da desorganização das biomoléculas que as compõem [14]. Desta forma, o calor promove o aumento na mobilidade dos lipídeos de membrana, assim como a desnaturação das proteínas associadas, permitindo assim, o extravasamento das betacianinas para o meio externo [9,11,12]. O aumento do tempo de exposição ao frio (10, 15 e 20 min) também ocasionou danos progressivos nas membranas, indicados pelo aumento do extravasamento das betacianinas. O frio é capaz de promover a formação de cristais de gelo no meio intracelular, os quais podem causar rupturas nas membranas durante o descongelamento [10,13]. O efeito combinado de baixa e alta temperatura acarreta o aumento dos danos de membrana e intensifica o extravasamento de betacianinas (Figura 1). A combinação de frio (-18 C) e calor (100 C) por tempos de 20 min e 20 s, respectivamente, foi suficiente para causar mais danos do que os tratamentos aplicados isoladamente. Além disso, é notável que um menor tempo de exposição ao calor causa mais danos às membranas que um maior tempo de tratamento com frio, pois os efeitos do calor são mais drásticos [14].
A6 Figura 1: Efeito de fatores físicos sobre a integridade de biomembranas em tecidos de beterraba. (a) Controle (temperatura ambiente); (b) Calor (100 C); (c) Frio (-18 C); (d) Calor e frio. III.II EFEITO DE SOLVENTES ORGÂNICOS Assim como os fatores físicos, solventes orgânicos causam o extravasamento das betacianinas para o meio externo, por meio de danos na membrana plasmática e na membrana vacuolar [13-14]. Para avaliar o efeito destes solventes, foram selecionadas duas substâncias, álcool e acetona comerciais, ambas facilmente encontradas em drogarias. Dentre os agentes químicos, estes foram os que mais afetaram a integridade das membranas, provocando maiores danos (Figura 2). A acetona e o álcool são solventes que apresentam caráter hidrofóbico e agem solubilizando as caudas de ácidos graxos dos lipídeos e desnaturando as proteínas associadas, pois são capazes de interferir nas interações hidrofóbicas que dão estabilidade a estes componentes nas membranas [11-12]. Por apresentar caráter mais hidrofóbico do que o álcool, a acetona teve maior efeito sobre as membranas, aumentando assim os danos observados (Figura 2). Figura 2: Efeito de solventes orgânicos apolares sobre a integridade de biomembranas em tecidos de beterraba. (a) Controle (água destilada); (b) Acetona comercial; (c) Álcool comercial 70% (v/v).
A7 III.III EFEITO DE SUBSTÂNCIAS ANFIPÁTICAS E POLARES O efeito de substâncias anfipáticas e polares pode ser facilmente demonstrado utilizando substâncias encontradas em supermercados e farmácias, como desinfetante comercial à base de detergente, detergente comum, água oxigenada e água sanitária comercial. São denominadas anfipáticas as substâncias que possuem uma porção hidrofílica (com afinidade pela água) e uma porção hidrofóbica (sem afinidade pela água) [12]. A porção hidrofóbica do detergente se intercala entre os lipídeos de membrana e causa a formação de micelas, o que destrói a integridade da membrana. Além disso, a porção hidrofóbica dos detergentes é capaz de se ligar com as regiões hidrofóbicas das proteínas de membrana, formando complexos detergente-proteína [9]. Já a porção hidrofílica, que no caso do detergente e do desinfetante é iônica, causa desnaturação de diversas proteínas de membrana, o que também afeta a integridade das membranas [9]. Como o efeito do detergente e do desinfetante é similar (Figura 3), pode-se atribuir o maior extravasamento de betacianinas provocado pelo desinfetante ao fato de esse possuir em sua composição tensoativos não iônicos, além do princípio ativo (compostos quaternários de amônio), que também atua na desorganização das membranas. Em comparação com os demais tratamentos, as substâncias exclusivamente polares, como o peróxido de hidrogênio e o hipoclorito de sódio, aparentemente causaram os menores danos às membranas (Figura 3). Tendo em vista que estes compostos são agentes oxidantes capazes de danificar tanto as proteínas quanto os lipídios de membrana [12], seria esperado que provocassem elevado extravasamento. No entanto, a coloração menos intensa do meio de reação não necessariamente indica menor extensão de danos às membranas. Considerando que as betacianinas podem ser degradadas na presença de agentes oxidantes [15], a interpretação do dano causado às membranas com base na coloração do meio de reação deve ser cautelosa. Figura 3: Efeito de substâncias anfipáticas e polares sobre a integridade de biomembranas em tecidos de beterraba. (a) Controle (água destilada); (b) Desinfetante comercial à base de detergente 20% (v/v); (c) Detergente comercial 10% (v/v); (d) Água oxigenada comercial (10 volumes); (e) Água sanitária comercial 1:4 (v/v).
A8 III.IV APLICAÇÕES DIDÁTICO-PEDAGÓGICAS. O desenvolvimento desta atividade prática permite que o aluno desenvolva habilidades, como o manuseio de equipamentos e utensílios, e competências, como capacidade de organização, trabalho em grupo e capacidade de desenvolver o pensamento lógico, observando um fenômeno e formulando algumas hipóteses. Além disso, por ser uma atividade em laboratório, proporciona o exercício de uma postura profissional, a qual é exigida pelo ambiente de trabalho. Durante a aula prática é necessário direcionar a atividade dos alunos, afim de aumentar a fixação de conceitos importantes, por meio de questões pertinentes que incitem a curiosidade. Desta forma, sugerimos questões que podem ser utilizadas pelo professor ao final ou durante a aula prática. Neste sentido, é interessante que as questões abranjam desde os conceitos mais básicos até possíveis aplicações do conhecimento apreendido. São elas: 1. Por que a exposição a temperaturas elevadas (100º C) causa danos às membranas mais rapidamente do que a exposição a temperaturas mais baixas (-18º C)? 2. Que relação pode ser observada entre a hidrofobicidade do composto e sua capacidade de causar danos às membranas? 3. O que são substâncias anfipáticas e de que forma elas podem atuar sobre as membranas? 4. Como os diferentes desinfetantes (álcool, desinfetante comercial, água sanitária e água oxigenada) demonstrados atuam para eliminar microorganismos? 5. De que forma os agentes oxidantes podem lesar os tecidos? Considerando que muitas células eucarióticas produzem alguns destes agentes durante o metabolismo, por que não sofrem lesões constantes? As questões iniciais (1 a 3) visam fixar alguns conceitos e mecanismos importantes contemplados na atividade, como a capacidade do calor de desorganizar membranas; a relação entre hidrofobicidade do composto e sua capacidade de solubilizar os lipídeos de membrana; e o conceito de substâncias anfipáticas. Já as questões seguintes (4 e 5) visam levar o aluno a estabelecer relações, como a capacidade das substâncias causarem danos à membrana com sua propriedade antimicrobiana. IV. CONCLUSÃO Concluímos que a reformulação do protocolo sobre fatores que afetam a integridade das biomembranas com o uso de reagentes simples, baratos e encontrados na vida cotidiana do aluno, foi capaz de representar com clareza o efeito produzido fatores químicos e físicos testados. Além disso, a reformulação deste protocolo ampliou os tipos de materiais que podem ser utilizados e as áreas do conhecimento nas quais pode ser aplicado, viabilizando a realização desta prática em espaços didáticos com condições limitadas. V. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] T.C. Orlando, A.R. Lima, A.M. Silva, C.N. Fuzissaki, C.L. Ramos, D. Machado, F.F. Fernandes, J.C.C. Lorenzi, M.A. Lima, S. Gardim, V.C. Barbosa, T.A. Tréz (2009) Planejamento, montagem e aplicação de modelos didáticos para abordagem de Biologia celular e molecular no ensino médio por graduandos de ciências biológicas, Revista Brasileira de Ensino de Bioquímica e Biologia Molecular. 1, 1-17. [2] A.F. Campos, C.A.C. Marcelino Jr., R.M.N. Barbosa, A.R. Tavares (2004) Determinação de cloreto de sódio em atriplex: uma atividade experimental para os cursos de ciências biológica. Revista Brasileira de Ensino de Bioquímica e Biologia Molecular. 1, 1677-2318.
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