Estudo de Fragmentação EI - fragmentação de alta energia (carga e radical) ESI fragmentação direcionado pela carga
CID: Baixa tensão de Cone Cone de extração 5V Cone de amostra 3V Hexapolo
CID: Baixa tensão de Cone Cone de extração 5V Cone de amostra 7V Hexapolo Dissociação por colisão induzida ocorre antes da entrada no MS
In Source CID (Collision induced dissociation) Etalon 55 pg/ul, ES, FS positif, CV variables Etalon 1 22 (12.126) 1 214.36 Cianazina 3: Scan ES+ 2.81e4 6 V 13.44 131.73 11.23 89.34 125.55 Etalon 1 221 (12.162) 1 96.3 145.55 163.16 174.16 25.39 186.21 196.16 241.4 241.39 279.43 263.34 34.36 327.8 337.74 348.2 2: Scan ES+ 4.19e4 4 V 214.33 98.15 25.3 113.54 138.52 155.47 174.2 196.2 223.16 249.44 264.53 282.41291.95 33.39312.82 33.71 343.97 Etalon 1 221 (12.144) 1: Scan ES+ 1 241.39 3.82e4 2 V 97.28 18.28 13.81 151.6 171. 183.4 195.59 25.32 223.14 234.36 253.29 264.47 282.41 292.58 31.62 325.69 345.85 m/z 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34
Comparativo CID
O HO CHO OH O O OH O 48 Da OH 3 276 EI 2 1 219 247 55 77 91 191 177 65 115 17 149 131 26 234 261 163 32 327 355 384 49 424 438 463 51 5 1 15 2 25 3 35 4 45 5 1 219.1468 3.95e5 ESI+ 218.1371 413.139 233.935 136.8547 25.137 313.1768 337.945 431.1246 anafr3_cid 77 (3.436) Cm (696:775) TOF MSMS 479.3ES- 1 275.254 37.248 4.92e3 ESI- 247.2551 163.194 223.244 38.2763 15 2 25 3 35 4 45 479.2776 m/z
TANDEM MS ANALYZER COMBINATIONS - Tandem-in-Space QqQ Qq-TOF MALDI-TOF-TOF - Tandem-in-Time QIT FTICR Orbitraps
Fonte de ionização Q1 q2 Q3 Detector Modo de análise full scan varredura seleção varredura SIM (monitoramento seletivo de íons) Products ions (íons filhos) seleção CID varredura seleção CID seleção MRM (monitoramento de reações múltiplas) Precursor ions (íons precursores) varredura CID seleção Neutral loss (perda neutra) varredura CID varredura
A precursor ion is any ion selected for analysis by CAD Product ions are those fragment ions produced when the precursor ion undergoes dissociation in the collision cell during CAD A product-ion spectrum is an array of product ions produced by decomposition of a given precursor A precursor-ion spectrum is an array of precursor ions each of which is capable of generating a given product ion of a particular m/z value. A neutral-loss spectrum is an array of ions that undergoes a common loss; e.g.,expulsion of a molecule such as H2
Modos de Aquisição - Q Full scan MS mode: varredura: 5-35 Pesticide Mix Pest3 1 4.65 5.5 5.65 8.62 8.2 1: Scan ES+ TIC 5.77e6 Pesticide Mix Pest3 256 (4.719) 1 scan 4.7 229 1: Scan ES+ 2.6e6 1.62 3.82.74 12.71 5 1 15 2 25 3 35 4 45 5 55 6 65 7 75 8 Scan 251 6 55 69 87 1 121 143 163 196 214 274 288 328 349 5 75 1 125 15 175 2 225 25 275 3 325 35 m/z Pesticide Mix Pest3 432 (7.945) 1 scan 7.9 222 244 1: Scan ES+ 1.13e6 Pesticide Mix Pest3 582 (1.696) 1 6 scan 1.6 214 223 263 1: Scan ES+ 4.34e5 6 55 214 236 69 121 165 87 99 143 196 268 287 39 325 342 5 75 1 125 15 175 2 225 25 275 3 325 35 m/z 55 196 69 121 99 87 113 129143 171 287 185 39 334 349 5 75 1 125 15 175 2 225 25 275 3 325 35 m/z
Modos de Aquisição - Q Full scan MS mode Single ion recording (SIR) Q1 Q1 Fonte Detector Fonte Detector
Cromatograma de Full Scan Corrente iônica total Varredura de uma ampla faixa de massas. Identificação do composto de interesse dificultada pela co-eluição de compostos de mesma massa. Pós-processamento do cromatograma com extração de massa de interesse, no entanto, devido ao processo de varredura possui sensibilidade inferior que o monitoramento seletivo de íons.
Pós - processamento do cromatograma de full scan : Extração do íon de m/z 78 5ppm. Volatile Organic Analysis Calibration Standard. V5 1 7.67 1.43 14.1 13.35 12.64 19.61 19.27 15.98 17.98 21.99 22.87 2.7 26.2 24.87 27.58 3.38 34.5 36.6 37.85 Scan EI+ TIC 2.7e5 Area V5 1 19.27 Scan EI+ 78.11 6.7e4 Area 36.6 9.13 17.98 3.38 1. 15. 2. 25. 3. 35. Time
Modos de Aquisição - Q SIM ou SIR Monitoramento Seletivo de Íons Espectrômetro de Massas trabalha com seleção de uma pequena faixa de massas ou valor unitário de massa. Quanto menor a faixa de massas = maior a especificidade da análise. Mais específico que o Full Scan.
Espectrometria de massas sequencial Q1 q2 Q3 Fonte Detector
Espectrometria de massas sequencial Multiple reaction monitoring (MRM) Q1 q2 Q3 Fonte Detector O que interessa neste modo de varredura é o cromatograma.
Espectrometria de Massas Sequencial Q1 q2 Q3 F 1 F 2 F 3 MH + F1 MH + F 2 F 4 F 3 F 4 Ruído Sinal Íons pai Íons filhos Sinal/Ruído (UV) (MS) (LC/MS) (LC/MS/MS) (LC/LC/MS/MS) Energia de Colisão (ev)
Cromatograma de MRM Monitoramento de Reações Múltiplas Monitoramento de um par Precursor>Fragmento. Cromatograma muito simples = geralmente contendo um pico cromatográfico. Ideal para análise de compostos alvo em matrizes complexas. Mais seletivo e sensível que Full Scan. Mais seletivo que SIM ou SIR
Branco_2 1 Plasma Branco.6.52 1.28.981.2 1.64 MRM of 2 Channels ES+ 1.94 2.18 2.28 2.72 TIC 2.43e3,3,2,1 (Metronidazol) (Tinidazol) Branco_1 MRM of 2 Channels ES+ 1.24.44.7 1.4 1.1 1.64 1.92 2.18 2.5 TIC 2.26e3, 2 4 6 8 1 12 Minutes,2 Volts,1 (Amoxicilina) (Cefadroxil) 2 4 6 8 1 12 14 Scan,,,5 1, 1,5 2, 2,5 3, 3,5 4, 4,5 5, 5,5 6, 6,5 7, Minutes 1 _ T I C 3. 1 8 e 4 teste1 Sm (Mn, 2x3) 1 MRM of 2 Channels ES+ 749.7 > 591.2 9.35e3 teste1 Sm (Mn, 2x3) 1 MRM of 2 Channels ES+ 734.6 > 576.2 3.84e4 2 4 6 8 1 1 2 1 4 S c a n _ M 2 C e l s E S + E x a t i d a o - 1 1 1 R M o f h a n n 3 2 1. 9 > 2 7 5. 9 1 3. 1 e 4 E x a t i d a o - 1 _ 1 1 M R M o f 2 C h a n n e l s E S + 1 2 8 5. 8 > 1 9 4. 3 3. 3 e 4 teste1 Sm (Mn, 2x3) 1 MRM of 2 Channels ES+ TIC 4.55e4 2 4 6 8 1 1 2 1 4 S c a n 2 4 6 8 1 12 14 Scan
Espectro e cromatograma de MRM 15pg/ml std Assay9 Sm (Mn, 2x3) 1 MRM of 3 Channels AP+ 2.77 TIC 3.52e4 15pg/ml std Assay9 Sm (Mn, 2x3) 1 MRM of 3 Channels AP+ 2.79 294.1 > 64 3.55e3 Assay9 Sm (Mn, 2x3) 1 MRM of 3 Channels AP+ 2.79 288.1 > 58 2.72e4 Assay9 Sm (Mn, 2x3) 1 MRM of 3 Channels AP+ 2.65 274.1 > 182.1 1.53e4 1. 2. 3. Time MRM de 3 transições 1. 2. 3. Time OBS: Modo de varredura de Quadrupolos tandem
Otimização das condições do MS/MS. CID_ABZ-SO1 213 (3.937) Sm (Mn, 2x1.); Cm (21:226) 1 E. colisão = 35 ev 159.226 SOH Daughters of 282ES+ 5.25e6 191.128 28.1454 121.9298 13.9524 CID_ABZ-SO1 32 (5.915) Sm (Mn, 2x1.); Cm (311:322) 1 E. colisão = 25 ev 28.1454 CH 3 OH Daughters of 282ES+ 8.9e6 159.226 191.128 239.9749 CID_ABZ-SO1 38 (.72) Sm (Mn, 2x1.); Cm (37:46) 1 E. colisão = 12 ev 24.2256 C 3 H 6 Daughters of 282ES+ 9.36e6 28.1454 CID_ABZ-SO1 1 (.185) Sm (Mn, 2x1.); Cm (1:22) 1 E. colisão= 5 ev 191.128 222.185 282.82 282.82 Daughters of 282ES+ 7.81e6 24.2256 5 6 7 8 9 1 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2 21 22 23 24 25 26 27 28 29 3 31 32 33 34 35 m/z
p g p( ) 372SPECTS-18 1 (1.3) 1 285 Scan ES+ 3.65e9 287 326 288 328 372SPECTS-24 1 (1.3) Daughters of 287ES+ 156 1 3.69e7 193 222 287 15 117127 147 169 172181 221 23 27 243 259 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 m/z
422CPSPI3 1 (.52) 1 377.222 Scan ES+ 1.11e9 378.223 422CPSPI1 1 (.52) 1 234.293 Daughters of 377ES+ 6.53e7 33.192 13.163 16.263 134.293 377.96 117.146 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 46 48 5 m/z
Analise Multi resíduos
Proteoma-MS MS?
Gel MS
Sequenciamento de aminoácidos
Roepstorff and Fohlman in 1984 [1] and modified by Johnson in 1987
Sequenciamento de aminoácidos 1: TOF MSMS 544.ES+ 1 169.16 156.1 188.84(M+H) + 197.16 892.57 243.15 311.23 11.8 356.26 458.36 53.38 537.42 631.53 M/z 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 65.54 778.57 875.61 933.5 991.77 17.83 189.2
1 Ionização a Pressão Atmosférica (API). Eletrospray (ESI) H S L F K F N V P ymax 169.16 a2 156.1 y1 188.84(M+H) + 197.16 b2 892.57 y7 1 11.8 H 243.15 y2 311.23 b3 356.26 y3 458.36 b4 53.38 y4 537.42 631.53 y5 M/z 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 65.54 778.57 y6 875.61 933.5 b8 991.77 y8 17.83 PV N F K F L S H bmax 169.16 a2 189.2 156.1 y1 188.84(M+H) + 197.16 b2 892.57 y7 11.8 H 243.15 y2 311.23 b3 356.26 y3 458.36 b4 53.38 y4 537.42 631.53 y5 M/z 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 11 12 65.54 778.57 y6 875.61 933.5 b8 991.77 y8 17.83 189.2