Sessão 1: Os Princípios e as Técnicas da Biologia Molecular do Séc XXI

Menu do dia: -DNA RNA proteína - Sequenciação de genomas (Clonagem, electroforese em gel) - Transcritoma (Microarrays) - Organismos modelo - RNA interferência e mutagénese (RNAi, mutantes de Drosophila) - Immunostaining, live immaging e microscopia de fluorescência - Deteção de interactuantes de proteínas (complexos proteicos e complexos proteína-dna)

Célula Eucariótica

O núcleo e o conteúdo genético

Os genes ditam muitas das nossas caracteristicas...

Ciclo celular

Divisão celular

Replicação do DNA Polimerase de DNA Primase de DNA Polimerase de DNA Fragmento de Okasaki

DNA RNA Proteína DNA Membrana nuclear Transcrição de mrna RNA Polimerase mrna maduro - Splicing Amino ácidos Transporte para o citoplasma Tradução Cadeia de aminoácidos trna Anti-codão Codão mrna Ribossoma

Proteína só uma cadeia de aminoácidos? Amino ácidos Cadeia de aminoácidos trna Anti-codão Codão mrna Ribossoma

Cada proteína com a sua função...

Como saber a sequência de nucleótidos de uma proteína?

Método de terminação de cadeia

Método de terminação de cadeia O DNA é desnaturado e amplificado em cadeias simples. O primer liga-se à cadeia template. dntps ddntps Os primer são desenhados para uma sequencia de DNA específica conhecida Podem ser combinados numa única reacção desde que estejam marcados com cores diferentes OU Separados em 4 reacções diferentes

Electroforese em gel Fonte de energia Poços para aplicar as amostras Tina Gel de agarose ou poliacrilamida Tampão Elétrodo

Sequenciação de fragmentos de DNA Os fragmentos de DNA ampliados são separados por electroforese, cada amostra numa posição diferente

Sequenciação de fragmentos de DNA Os fragmentos de DNA ampliados são separados por electroforese, cada amostra numa posição diferente Os fragmentos de DNA ampliados são separados por electroforese em capilar em simultâneo

Informação sobre todas as proteínas de um organismo Sequenciação de genomas! Isolamento do DNA Corte do DNA com enzimas expecificas ligação do DNA com enzimas expecificas Inserção dos vectores em bactérias Isolamento de DNA Colecção de DNA s de uma biblioteca genómica

Sequenciação shotgun

Next generation sequencing

Em que esta tecnologia pode ser útil?

Transcriptoma Chip de DNA Amostra controlo Amostra da experiência mrna Transcrição reversa cdna Scan com laser Hibridação com o DNA do chip Gene X

Vamos começar a estudar a função de uma proteína

Serão as descobertas feitas em mosca relevantes para os humanos?

Perda de função

Localização celular da proteína

Localização celular da proteína Amostra Fixação Anticorpo primário não marcado Anticorpo secundário (anti-imunoglobulina) fluorecsentement Permeabilização, as membranas celulares abrem poros para a entrada dos anticorpos

Localização celular da proteína Ocular Filtro Filtro Espelho Objectiva Lâmpada de fluorescência Especime Deteção do sinal com microscopia de fluorescência

As proteínas são dinâmicas

Protein tagging para analisar a dinâmca das proteínas

Protein tagging para analisar a dinâmca das proteínas Ocular Filtro Filtro Espelho Objectiva Lâmpada de fluorescência Especime Deteção do sinal com microscopia de fluorescência

Immunostaining vs. Live immaging

As proteínas também têm amigos... Células contendo as proteínas de interesse Lisado celular Adicionr anticorpo contra uma das proteínas Adicionr beads que se ligam ao anticorpo Imunoprecipitação das proteínas de interesse Lavar e recolher as proteínas que foram imunoprecipitadas

As proteínas também têm amigos...

As proteínas também têm amigos... Separar as proteínas por electroforese num gel de poliacrilamida Gel As proteínas são transferidas do gel para a membrana Gel Electrodo e tampão Membrana Deteçaõ por luminescência. Mostra apenas as bandas (proteínas) que foram reconhecidas pelo anticorpo Adicionar anticorpo primário seguido de anticorpo secundário

As proteínas também têm amigos... Hemolinfa de Drosophila Comida normal Restrição alimentar Anticorpo para Insulina Anticorpo para uma proteína não relacionada com a experência Deteçaõ por luminescência. Mostra apenas as bandas (proteínas) que foram reconhecidas pelo anticorpo

As proteínas também têm amigos...

Os amiguinhos das proteínas Células contendo as proteínas de interesse crosslinking com DNA Lisado celular e quebra do DNA Adicionr anticorpo contra a proteína de interesse Adicionr esferas magnéticas que se ligam ao anticorpo Degradar as proteínas ligadas ao DNA

Os amiguinhos das proteínas DNA pronto para a análise ChIP-chip Hibrididar com microarray ChIP-seq Sequenciar e mapear em genoma de referência

Em conclusão

Obrigada