TÉCNICAS EM BIOLOGIA MOLECULAR NÍVEL I

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1 TÉCNICAS EM BIOLOGIA MOLECULAR NÍVEL I 2017 Integração entre os conceitos práticos e teóricos para um trabalho em bancada Resumo Nos primeiros módulos você verá uma breve revisão de alguns conceitos básicos da biologia molecular já vistos em detalhes nos cursos Fundamentos da Biologia Molecular I e II do NAC. Neles estão selecionados tópicos com algumas informações adicionais que são fundamentais para darmos continuidade aos cursos Técnicas em Biologia Molecular I e II.

2 INFORMAÇÕES Para mais informações clique sobre as palavras GRIFADAS OU DESTACADAS em azul. Através delas o NAC indica alguns links externos, em que você encontrará artigos científicos, informações adicionais, aulas, curiosidades, entre outros. Além disso, faça a leitura e assista as videoaulas da plataforma EAD do NAC Módulo 1 Introdução a Biologia Molecular DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR O Dogma Central da Biologia Molecular foi postulado por Francis Crick em Esse modelo mostra que uma proteína pode ser formada a partir de um fragmento de DNA (que veremos mais para frente, os denominados genes). Dessa forma, Crick mostrou com o ocorre o fluxo de informações do código genético. Segundo esse dogma, o fluxo da informação genética segue o seguinte sentido: DNA RNA PROTEÍNAS. Além disso, sabemos também que o contrário, ou seja, o fluxo da informação proteína DNA não é possível.

3 A REPLICAÇÃO - DUPLICAÇÃO A molécula de DNA passa por um processo de duplicação. Esse processo é semi-conservativo, pois a dupla fita de DNA precisa se separar para ser duplicada, mas as novas moléculas criadas conterão uma das fitas do DNA inicial, ou seja: cada DNA criado terá uma fita nova e outra antiga (do DNA original), sendo, portanto, um processo semi-conservativo (o DNA novo conserva uma das duas fitas do DNA original). A replicação do DNA se inicia com a quebra das ligações de hidrogênio que une as bases nitrogenadas do DNA. Nesse momento, outros nucleotídeos aproximam-se de cada fita-molde e inicia o pareamento entre A-T e G-C, resultando em duas novas moléculas de DNA, que são idênticas à molécula inicial. É desse modo que o DNA é duplicado (replicado). Há inúmeras enzimas que participam do processo, como a DNA polimerase (que promove a ligação dos nucleotídeos), a topoisomerase (que tem função de quebrar ligações do DNA e também restaurá-las) e a DNA ligase, que liga certos fragmentos de DNA

4 (chamados fragmentos de Okasaki) ao longo da replicação (Para mais informações veja o conceito teórico em Fundamentos da Biologia Molecular I). A TRANSCRIÇÃO A transcrição ocorre quando um RNA se forma a partir do DNA. A enzima responsável pela transcrição chama-se RNA Polimerase, que a partir de uma das fitas de DNA consegue elaborar a fita de RNA. Diferentemente do DNA (que é uma estrutura em forma de fita dupla), o RNA tem apenas uma única fita. A TRADUÇÃO (SÍNTESE DE PROTEÍNAS) Para entendermos a tradução, nós precisamos saber primeiro quais são os tipos de RNA: 1. RNA de transferência ou Trna 2. RNA mensageiro ou mrna 3. RNA ribossômico ou rrna O RNA TRANSPORTADOR É a menor molécula das três e sua função é a de carrear e combinar os aminoácidos que constituirão as novas proteínas. Eles se combinam com os aminoácidos e reconhecem as bases presentes no RNA mensageiro, que deverão ser pareadas com estes. As sequências reconhecidas pelo trna são chamadas códons, e são grupos de três

5 bases nitrogenadas. As sequências que pareiam com os códons são chamadas anticódons. Cada trinca ou códon corresponde a um aminoácido, como vimos na vídeo aula anterior. O RNA mensageiro Tem a função de transcrever a informação contida em um segmento de DNA. Seu tamanho e peso variam de acordo com o tamanho da molécula proteica final. O mrna é composto por duas extremidades: a cauda Poli A e a cauda cap. Seu percurso é sair do núcleo já portando as informações necessárias à síntese e dirigir-se ao citoplasma. By MRNA_structure_fr.svg: *MRNA_structure.svg: Daylite derivative work: Fdardel (talk) derivative work: Nossedotti (MRNA_structure_fr.svg) [Public domain], via Wikimedia Commons

6 O RNA ribossômico Este tipo corresponde a cerca de 80% dos tipos de RNA e ele se encontra unido a proteínas, formando os ribossomos. Estes últimos, quando ligados ao RNA mensageiro são chamados de polirribossomos, onde ocorrerá a síntese proteica. O processo de fabricação de proteínas ("tradução", ou "síntese de proteínas", ou então "síntese proteica") ocorre no citoplasma após a saída do mrna do núcleo, que se dirige aos rrnas. Os ribossomos do rrna terão a função de traduzir em proteínas a mensagem do DNA carreada pelo trna e transcrita pelo mrna inicialmente. Por LadyofHats Translation: Nossedotti (Anderson Brito) (File:Ribosome_mRNA_translation_en.svg) [Public domain], undefined

7 Passos da tradução: 1) Saída do mrna do núcleo portando determinado número de códons (aminoácidos) e dirigindo-se ao citoplasma; 2) Já no citoplasma, um ribossomo se liga ao mrna, num códon inicial (há um códon específico que indica o início da leitura). Logo chegam trnas portando determinados anticódons (aminoácidos), que se ligam também ao ribossomo e pareiam suas trincas de bases com o mrna; 3) Ocorre, então, a primeira ligação entre os aminoácidos presentes no trna e no mrna (é a chamada ligação peptídica). Assim que ela ocorre, o ribossomo se desloca ao longo do mrna e outro trna liga-se ao mrna. Assim segue a tradução, com o ribossomo se deslocando a medida em que chegam outros aminoácidos e até que surja um códon de parada, que indica o fim da tradução; 4) Quando o códon de parada aparece, o trna e o ribossomo se desligam do primeiro peptídeo formado, que ficará livre no citoplasma. Esse peptídeo será usado para inúmeras funções da célula e nada impede, também, que outros ribossomos surjam recomeçando a síntese de um peptídeo maior, até formar uma proteína.

8 Obs.: Costuma-se chamar peptídeo as moléculas formadas por até 100 aminoácidos e apenas quando ultrapassa esse número, é que chamam a molécula de proteína. Alguns autores, porém, podem denominar proteínas algumas moléculas com menos de 100 aminoácidos. Moreira, C. (2010), WikiCiências, 1(9):0093 Módulo 2 Noções básicas de gene No módulo 2 você verá os seguintes conceitos que são fundamentais para o entendimento das denominações que envolvem as

9 propriedades dos genes. Exons Introns Splicing Alternativo Promotores, Enhancers e Silenciadores Direções das transcrições Conservação Orientação de gene e transcrição Por convenção, a orientação do gene é determinada pela cadeia de codificação. Assim, o início de um gene é chamado de extremidade 5' e o fim de um gene é chamado de 3'. Note na figura a seguir que na mesma região existem dois genes que são transcritos em sentidos opostos: o gene WRAP53 para a direita e o gene P53 para a esquerda. O que são exons?

10 Os exons são partes do DNA que são convertidas em RNA mensageiro maduro (mrna). O processo pelo qual o DNA é usado como um modelo para criar mrna é chamado de transcrição. Este mrna então sofre um processo adicional chamado tradução em que o mrna é usado para sintetizar proteínas, através de outro tipo de molécula chamada RNA de transferência (trna). O que são introns? proteínas. Introns são partes de genes que não codificam diretamente para Onde estão encontrados introns? Introns são comumente encontrados em eucariotas multicelulares, como os seres humanos. Eles são menos comuns em eucariotas unicelulares, como leveduras, e ainda mais raras em bactérias. Como os íntrons são removidos? Os introns estão presentes na transcrição inicial do RNA, conhecida como pré-mrna. Eles precisam ser removidos para que o mrna possa direcionar a produção de proteínas. O pré-mrna, portanto, sofre um processo, conhecido como splicing, para criar mrna maduro. É necessário que os introns sejam removidos precisamente, caso contrário, pode resultar em uma proteína defeituosa.

11 Uma ótima maneira de lembrar isso é fazer uma regra de prefixo das palavras: - INtron INtervenientes (ou seja, sequência que intervém ou deve ser retirada da sequência do RNA mensageiro). - EXon - sequências EXpressas (codificam e permitem a Expressão de proteinas). Splicing de RNA O processamento de RNA ocorre em locais de emenda especiais. Estes tendem a começar com o dinucleotideo GU na extremidade 5' e AG na extremidade final 3'. O processo é realizado por pequenas ribonucleoproteínas nucleares (snrnps). Eles se ligam às extremidades 5 'e 3' do intron e fazem com que ele forme um loop. O intron é então removido da sequência e os dois exons restantes estão ligados entre si. By Qef [Public domain], via Wikimedia Commons Splicing alternativo O splicing alternativo refere-se à forma como diferentes

12 combinações de exons podem ser unidas. Essa ideia foi apresentada pela primeira vez por Walter Gilbert. Ele propôs que as diferentes permutações de exons pudessem produzir diferentes isoformas de proteínas. Essas, por sua vez, teriam diferentes atividades químicas e biológicas. Observe na imagem a seguir três proteinas diferentes sendo formadas pelo mesmo gene. National Human Genome Research Institute Curiosidades: Estudos indicam uma média de 9 exons e 8 introns por gene em seres humanos. Estudos indicam que o número de introns que os genes de um organismo contém é positivamente relacionado à sua complexidade. De 30 a 60% dos genes humanos são submetidos a splicing alternativo. Isso indica que muitas doenças genéticas estão ligadas a alterações genéticas que causam erros de splicing que por sua vez

13 causam proteínas defeituosas. Um exemplo de um gene humano que sofre de splicing alternativo é o da fibronectina. Mais de 20 diferentes isoformas de fibronectina foram descobertas. Todos estes foram produzidos a partir de diferentes combinações de exons do gene da fibronectina. Promotores Um promotor é uma região reguladora do DNA localizado geralmente na região 5' de um gene, fornecendo um ponto de controle para transcrição de genes reguladora. O promotor contém sequências de DNA específicas que são reconhecidas por proteínas conhecidas como fatores de transcrição. Estes fatores se ligam às sequências do promotor, recrutando a RNA polimerase para realizar a transcrição. Promotores procarióticos Nos procariotos, o promotor consiste em duas sequências curtas a -10 e a -35, ou seja, localizadas a 10 e 35 bases de distância do início da transcrição de um gene. A sequência em -10 é chamada de caixa Pribnow, ou o elemento -10, e geralmente consiste nos seis nucleotídeos TATAAT. A caixa Pribnow é absolutamente essencial para começar a transcrição em procariotos. A outra sequência em -35 pares de base antes do início da transcrição geralmente consiste nos seis nucleotídeos TTGACA. Sua

14 presença permite uma taxa de transcrição muito alta. Promotores eucarióticos Os promotores eucarióticos são muito diversos e são difíceis de se caracterizar. Eles geralmente se encontram antes de um gene e podem ter elementos regulatórios de várias kilobases (kilo = mil) antes do local de início da transcrição. Muitos promotores eucarióticos, contêm uma caixa TATA (sequência TATAAA), que se liga a uma proteína de ligação TATA e que por sua vez auxilia na formação do complexo transcricional da RNA polimerase. Enhancers Em alguns genes eucarióticos, existem regiões que ajudam a aumentar a taxa de transcrição. Essas regiões, chamadas deintensificadores ou enhancers, não estão necessariamente próximos de um gene. Eles podem estar localizados dentro da região de codificação, a montante (antes) ou a jusante (depois) de um gene, ou ou até mesmo estar a milhares de nucleótidos de distância. Veja um exemplo na imagem a seguir que o enhancer, constituído por pequenas sequências de DNA chamadas elementos de controle distal, interage com proteínas mediadoras e fatores de transcrição. Quando uma proteína de aderência de DNA se liga ao Enhancers, a forma do DNA muda, o que permite interações entre

15 osativadores e Fatores de transcrição. Na figura ao lado observe como o enhancer permite o dobramento da fita de DNA e agrupa a maquinaria de transcrição, acentuando a transcrição: Clique no link e veja ao estudo de alguns enhancers neste artigo da revista Nature: Transcriptional enhancers: from properties to genomewide predictions. Aqui você pode visualizar alguns enhancers e suas

16 disposições na fita de DNA. Silenciadores Os silenciadores são sequências de DNA podem ser encontrados a montante (no inicio), a jusante (no fim), ou dentro do gene de interesse. Quando os repressores se ligam a silenciadores (ver a seguir), eles atuam de forma semelhante aos potenciadores e se inclinam para evitar a interação da RNA polimerase com os promotores. Isso silencia o gene e, portanto, o gene não será expresso na célula. Repressores Na genética molecular, um repressor é uma proteína que ao se ligar a silenciadores associados a determinado gene inibe sua expressão. Um repressor de ligação ao DNA bloqueia a ligação da RNA polimerase ao promotor, evitando assim a transcrição dos genes. Um repressor ainda pode se ligar a um RNA evitando a tradução do mrna para a proteína. Esse bloqueio de expressão é chamado de repressão. Veja na figura a seguir a disposição desses elementos em um gene. Note que em ambas as regiões 5' ou 3' observamos a presença de alguns elementos como os Enhancer e silenciadores.

17 Veja abaixo uma Distribuição de algumas regiões importantes dentro ou próximas de um gene (uma perspectiva) Curiosidades Em um estudo recente utilizou um novo oligonucleótido antisense (pequena sequência de DNA que está no sentido contrário de uma transcrição) com funções sobre um silenciador. Ela por sua vez inibiu a produção uma de proteína mutante que causa uma doença conhecida como Huntington e provou ser eficaz e seguro ao tratar animais. O primeiro teste da droga em pessoas com a doença está em andamento. Os estudos estão sendo coordenados pelo cientista Blair R. Leavitt, MD, da Universidade da Colúmbia Britânica.

18 Módulo 3 Rastreando genes (plataforma Ensembl) Na videoaula a seguir veremos uma introdução a uma das plataformas de biologia molecular disponíveis na internet. Utilizaremos o banco de dados do site ensembl. Com base no que vimos nos módulos anteriores vamos rastrear alguns genes nesta plataforma e identificar algumas características apresentadas em cada um. Existem muitas plataformas online disponíveis atualmente, sendo algumas mais específicas e outras mais gerais. A plataforma ensembl é de grande utilidade quando precisamos realizar algumas tarefas básicas in silico, isto é, de forma computacional, como: a. Descobrir a sequência de um gene b. Identificar as anotações realizadas por pesquisadores em determinado gene c. Desenhar um primer d. Localizar alterações já descritas em determinado gene Assista a seguir uma prévia da plataforma na videoaula. Todas as ferramentas computacionais são abordadas no curso de Manipulação Molecular em Softwares - nível avançado Após assistir acesse o link a seguir e realize os mesmos procedimentos para alguns genes diferentes. Observe e explore todas as características de cada gene. Note que para cada um observamos regiões e características diferentes. Utilize códigos de genes que você já está familiarizado. Como opção disponibilizamos alguns códigos de

19 genes humanos para você utilizar em seus estudos caso não possua: Módulo 4 O que são primers No módulo 4 veremos um elemento, conhecido como primer, que é fundamental para algumas técnicas em biologia molecular como a PCR e o sequenciamento de DNA. Para isso a videoaula foi divida com as duas informações básicas de: a. Funções dos primers b. Primers e suas características Como vimos na videoaula, primers ou iniciadores são segmentos

20 ou oligonucleotídeos de ácidos nucléicos necessários à iniciação da replicação do DNA. Um iniciador é uma cadeia curta de RNA ou DNA (geralmente cerca de bases) que serve como ponto de partida para a síntese de DNA. É necessário para a replicação do DNA porque as enzimas que catalisam este processo, as polimerases de DNA, só podem adicionar novos nucleótidos a uma cadeia de DNA existente, que no caso, são os primers. A polimerase realiza a replicação no sentido 5' --> 3'. Muitas técnicas de laboratório in vitro utilizam primers de DNA como iniciadores de reações como sequenciamento de DNA e a reação em cadeia da polimerase -PCR). Em experimentos, muitas vezes é importante usar o primer Sense e antisense com uma temperaturas de melting (ou seja, temperatura quando o primer se liga ao DNA) próximas. Veja a seguir que os primers possuem assim como o DNA uma orientação 5' -> 3' que indica o sentido da transcrição: By Zephyris (Own work) [CC BY-SA 3.0

21 Em PCR, os iniciadores são utilizados para determinar o fragmento de DNA a ser amplificado pelo processo. A extensão de um iniciador pela polimerase leva a um aumento exponencial no segmento alvo. Vale ressaltar que os primers nem sempre são para síntese de DNA, mas podem também serem usados por polimerases virais, por exemplo, influenza, para síntese de RNA. Módulo 5 PCR convencional e PCR em tempo Real Após revermos alguns conceitos teóricos vamos abordar algumas técnicas que fazem parte da rotina laboratorial no campo da Biologia Molecular. Para isso iniciaremos através da videoaula os tópicos a seguir que se basearão na Reação em Cadeia da Polimerase -PCR: PCR convencional Fundamentos da PCR convencional Componentes da reação Fundamentos da amplificação Temperaturas ótimas Platô PCR real time

22 (tópico abordado de maneira aprofundada no curso nível 2) Fundamentos do PCR real time Exemplos de amplificação Controles negativos Aplicação do PCR real time na descoberta do sexo fetal Módulo 6 Transcrição reversa in vitro A transcrição reversa in vitro é uma reação que envolve uma ampla família de enzimas chamadas transcriptases reversas que desempenham um papel único no fluxo de informações genéticas. Desde a sua descoberta, os pesquisadores usaram essas enzimas como ferramentas fundamentais em uma ampla gama de aplicações de biologia molecular. O dogma central original da biologia molecular sustentou que o DNA foi transcrito para o RNA, que por sua vez foi traduzido em proteína. No entanto, este conceito foi desafiado na década de 1970, quando duas equipes científicas, uma liderada por Howard Temin na Universidade de Wisconsin e outra liderada por David Baltimore no MIT, identificaram de forma independente novas enzimas associadas à replicação de vírus de RNA chamados retrovírus. Essas enzimas convertem o genoma de RNA viral em uma molécula de DNA complementar (cdna), que então é capaz de se integrar no genoma do hospedeiro. Estas são polimerases de DNA dependentes de RNA e são chamadas de

23 transcriptase reversa porque, em contraste com o fluxo de DNA-RNA do dogma central, eles transcrevem modelos de RNA para moléculas de cdna. Para um melhor entendimento de como a transcrição reversa ocorre assista a vídeo aula a seguir e acesse os links desse módulo para estudos complementares. Na vídeo aula a seguir você verá os seguintes tópicos: Fundamentos da transcrição reversa Aplicações Primers oligo dt e Random primer No vídeo a seguir observe uma estrutura em 3D da transcriptase reversa e seus subdomínios: link No vídeo a seguir observe como age a enzima transcriptase reversa. É utilizado como modelo a ação do AZT que é similar a uma Timina porém quando é adicionado a reação da transcrição reversa a reação pára e a propagação do HIV pára no organismo. AZT é um dos tratamentos para portadores do vírus da AIDS porém note que se o portador possuir um vírus com a transcriptase reversa resistente ao AZT a transcrição reversa não é interrompida e a propagação do HVI continua: Link

24 Exemplo de Protocolo Veja a seguir um exemplo de protocolo padrão para realizar uma transcrição reversa. Note que o template nesse caso é o RNA ao invés de DNA como na PCR. No caso, M-MuLV RT é a transcriptase reversa usada nesse caso e os Inhibidor de RNase auxilia na não degradação do RNA ao inibir RNAses. Protocolo 1. Descongele os componentes no gelo e misture, invertendo várias vezes. 2. Misture os seguintes componentes e incube a 42 C ** durante 1 hora. COMPONENTE VOLUME Template RNA Até 1 μg * (60uM) Random primer ou oligo dt 2 μl Tampão 10X 2 μl M-MuLV RT (200 U / μl) 1 μl DNTP 10 mm 1 μl U/μl) Inhibidor de RNase (40 0,2 μl H2O livre de nucleases Para um volume total de 20 μl * 1 ng-1 μg de RNA total ** A Transcriptase reversa M-MuLV pode ser utilizada de 37 a 42 C.

25 3 - Inative a enzima a 65 C durante 20 minutos. Para aplicação de PCR após a transcrição reversa, o volume de produto de cdna não deve exceder 1/10 do volume de reação de PCR. Veja uma lista de protocolos diferentes que podem ser realizados através do link a seguir: Link VISÃO GERAL DAS APLICAÇÕES Após a descoberta da ação da Transcriptase reversa diversas aplicações começaram a ser utilizadas nos laboratórios de biologia molecular. Veja a seguir as diversas aplicações que podem ser usadas a transcrição reversa: Reação em cadeia da polimerase após a transcrição reversa (RT-PCR) Na RT-PCR, uma população de RNA é convertida em cdna por transcrição reversa (RT) e, em seguida, o cdna é amplificado pela reação em cadeia da polimerase (PCR). O passo de amplificação de cdna oferece oportunidades para estudar mais as espécies originais de RNA, mesmo quando elas são limitadas ou expressas em baixa abundância. As aplicações comuns de RT-PCR incluem a detecção de genes expressos, o exame de variantes de transcrição e a geração de modelos de cdna para clonagem e sequenciamento.

26 RT-PCR quantitativa (RT-qPCR) Uma das aplicações mais comuns da RT-PCR quantitativa (RT-qPCR) é a análise quantitativa dos níveis de mrna ao longo do tempo, através de células e tecidos, ou após um evento (por exemplo, tratamento medicamentoso). Devido a uma maior sensibilidade do que RT-PCR, RT-qPCR também é amplamente utilizado para examinar a presença de retrovírus (vírus RNA) em amostras de pesquisa. Semelhante ao fluxo de trabalho de RT-PCR, o RNA é primeiro convertido em cdna, que é amplificado pela PCR. A principal diferença, no entanto, é que os níveis de cdna amplificado são medidos por fluorescência em tempo real durante a fase exponencial da amplificação (assunto aprofundado no curso Técnicas em Biologia Molecular II). O nível de amplificação é usado como base para quantificar os alvos originais dentro da população de RNA. Clonagem de cdna e construção de biblioteca Uma das primeiras aplicações da transcriptase reversa em biologia molecular foi a construção de bibliotecas de cdna. Uma biblioteca de cdna consiste em clones de cdna que representam as sequências transcritas dentro de uma amostra específica. Portanto, uma biblioteca fornece informações sobre a expressão temporal e espacial de genes para um determinado tipo de célula, órgão ou estágio de desenvolvimento, por exemplo. Ampliação rápida de extremidades de cdna (RACE) A amplificação rápida de extremidades de cdna (RACE) é um método

27 baseado em PCR para determinar sequências desconhecidas nas extremidades 5 'e 3' de um determinado cdna. Estes métodos são comumente conhecidos como 5 'RACE e 3' RACE, respectivamente. Os objetivos experimentais da RACE incluem identificação de regiões não traduzidas de 5 'e 3', pesquisa de locais de início de transcrição, caracterização de regiões promotoras e determinação de sequências completas de cdna. Microarrays de expressão de genes Os microarrays consistem em milhares de câmaras, conhecidas como "características" ou "manchas", em bolachas de vidro ou de silício. Cada característica contém, imobilizado na sua superfície, cópias idênticas de uma seqüência de DNA de cadeia simples chamada "sonda", que representa um gene. As sondas se hibridam com alvos de cdna marcados com fluorescência e que são aplicados ao microarray, permitindo uma comparação simultânea da expressão gênica entre duas amostras. As sondas de microarray são geradas a partir de sequências conhecidas do genoma ou cdna de um organismo. Por exemplo, a PCR pode ser utilizada para fazer cópias de cada gene conhecido, cujos produtos são então desnaturados em DNA de cadeia simples e marcados em um chip como sondas. Alternativamente, os oligonucleótidos de nucleotídeos podem ser sintetizados diretamente em um chip como sondas de microarray. Seqüenciamento de RNA (RNA-Seq) O seqüenciamento de RNA, ou RNA-Seq, é comumente realizado para

28 obter informações sobre RNAs transcritos do genoma e sua regulamentação. Com o advento da sequenciação da próxima geração (NGS), o RNA-Seq tornou-se uma abordagem de alto rendimento para a análise de: Transcriptoma inteiro (todas as fitas que foram transcritas de determinado organismo. Determinação da expressão gênica. Descoberta de Variantes de junção e transcrições de fusão e detecção de genes de baixa abundância. Módulo 7 Sequenciamento de DNA O sequenciamento de DNA é o processo de leitura dos nucleótidos presentes nas moléculas de DNA ou RNA. Existem dois tipos de tecnologias de sequenciamento que são usadas atualmente: sequenciamento de Sanger e sequenciamento de próxima geração. Cada uma dessas tecnologias possui utilidades diferentes no ambiente de análise genética de hoje. Sanger é o método desenvolvido pelo bioquímico britânico Dr. Frederick Sanger na década de Este método envolve a cópia de DNA de cadeia simples com bases quimicamente alteradas chamadas didesoxinucleótidos que, quando incorporadas na extremidade 3 'da cadeia de crescimento, terminam a cadeia de forma seletiva em A, C, G ou T. As cadeias terminadas são então resolvidas por capilar Eletroforese.

29 A sequenciação de próxima geração (NGS) utiliza sequenciações massivamente paralelas para gerar milhares de megabases de informações de sequência por dia. As técnicas de próxima geração são baseadas em um princípio de "sequenciamento por síntese", onde os nucleotídeos incorporados a uma cadeia de DNA fornecem um sinal único. Na maioria das tecnologias NGS, o sinal exclusivo é uma molécula fluorescente. No entanto, com a tecnologia de sequenciação Ion Torrent de próxima geração, o sinal está na forma de uma mudança de ph, eliminando a necessidade de detecção baseada na luz. Nesse módulo vamos nos focar na metodologia de Sanger, para isso assista a video aula a seguir: A reação de sequenciamento é um método simples em que rodadas sucessivas de desnaturação, anelamento e extensão em um termociclador (assim como em um PCR) resultam em uma amplificação linear (já que não possui somente um primer por well) de produtos de extensão de DNA. Os produtos são então injetados em um capilar para separação eletroforética. Sequenciamento com nucleotídeos marcados A sequenciamento de DNA fluorescente é realizado com uma marcação diferente a cada um dos quatro ddntps. Os reagentes necessários para uma reação de sequenciamento são: DNA, primer, tampão, os quatro dntps, os quatro ddntps marcados fluorescentemente e a Polimerase. Os fragmentos marcados com fluorescência são gerados pela incorporação dos ddntp marcados com corante na sequência.

30 Todos os fragmentos terminados (aqueles que terminam com um ddntp), portanto, contêm um corante na extremidade 3'. Os fragmentos são então separados por eletroforese capilar. Eletroforese capilar Durante a eletroforese capilar, os produtos da reação de sequenciamento do ciclo são injetados eletroquimicamente em capilares cheios de polímero. A alta tensão é aplicada para que os fragmentos de DNA carregados negativamente se movam através do polímero nos capilares em direção ao eletrodo positivo. A eletroforese celular pode separar as moléculas de DNA que diferem em peso molecular por apenas um nucleotídeo. Pouco antes de alcançar o eletrodo positivo, os fragmentos de DNA marcados de forma fluorescente, separados por tamanho, se movem através do caminho de um raio laser. O raio laser faz com que os corantes dos fragmentos fluoresçam. Um dispositivo de detecção óptica em um analisador genético detecta o sinal de fluorescência. Software O software de coleta de dados do sequenciador converte o sinal de fluorescência em dados digitais e registra os dados em um arquivo de extensão *.ab1. Como cada corante emite luz em um comprimento de onda diferente quando excitado pelo laser, todas as quatro cores e, portanto, todas as quatro bases, podem ser detectadas e distinguidas em uma injeção capilar.

31 Módulo 8-15 Os módulos de 8 a 15 fazem parte das partes práticas e devem ser acompanhados nas videoaulas disponíveis na plataforma de estudo a distância do NAC. Bons estudos!