Caracterização Química e Avaliação de Toxicidade de Extratos Aquosos de Subprodutos de Castanheiro. Paula Alexandra Pinto

Caracterização Química e Avaliação de Toxicidade de Extratos Aquosos de Subprodutos de Castanheiro. Paula Alexandra Pinto

SUB-PRODUTOS EM AGRO-INDÚSTRIAS Subprodutos castanha Caracterização compostos fenólicos Actividade Antioxidante Toxicidade Actividade Antimicrobiana Biorremediaçao FT Orto difenóis HPLC** ABTS DPPH FRAP Germinação Atividade Microbiana (Vibrio fischerii) Microcrustáceos (Daphnia magna) Organismos Vertebrados (Zebrafish) Leveduras Bactérias Toxicidade Compostos fenólicos Que fracções existem? Que bioactividades podem ser majoradas? Quais podem ser extraídas de forma economicamente viavel? Como são afectados os parâmetros em estudo? É possível a dimuição teor fenólico total com tratamento biológico? **-Análise HPLC-DAD só pode ser feita para um dos fungostrametes versicolor 2

1. Bioremediação : variação no teor fenólico, actividade antioxidante e perfil cromatográfico Objectivos Gerais: Caracterização de extatos aquosos dos subprodutos Indirectamente Teor de compostos fenólicos (FT) Actividade Antioxidante Perfil cromatográfico PRÉ FERMENTAÇÃO LÍQUIDA PÓS Avaliação da capacidade dos fungos em usar os compostos fenólicos como fonte de carbono

Análises Preliminares aos Subprodutos A- Conteúdo Fenóis Totais em diferentes tipos de extração (Ouriços) Estudo do efeito das variáveis: tempo: 75min; 3h; 3 dias temperatura: 45º+/-5ªC; tamb (22º +/-5ºC) tipo de agitação (magneto; shaker) solvente : água: metanol (100% e 50%) 0.2g/10 ml solvente B- Conteúdo Orto-difenóis (complexação com molibdato de sódio) e Teor Actividade Antioxidante %AA dos Ouriços (O) e Inflorescências (F) Análise comparativa C- Análise de Toxicidade : Índice de Germinação (IG) +Índice de Toxicidade Fenólica (ITF) (Zucconi et al. (1981); Komilis et al. (2005). (Ouriços) Agrião Lepidium sativum Alface Lactuca sativa

Total phenolic content (mg gallic acid eq./g dry weight)) A- Conteúdo Fenóis Totais em diferentes tipos de extração (Ouriços) Resultados Uma vez... que os resultados dos extratos aquosos se revelaram semelhantes aos metanólicos 70 60 50 40 TF Foram Usados os extratos aquosos na Biorremediaçao 30 20 10 Mimetizam a possível lixiviação In situ 0 H2O+3h mag 45º H2O+3d shaker25º H2O+75 min mag 45º Extraction M50+3h mag 45º M5O+3d shaker25º M5O+75 min mag 45º

B- Conteúdo Orto-difenóis e Teor Actividade Antioxidante %AA dos Ouriços e Inflorescências Resultados %AA Ambos extratos aquosos apresentaram elevada atividade antioxidante e muito semelhante entre si. 100 80 60 40 20 %AA Orto-difenóis O teor de O-2-Fenóis das inflorescências é superior ao dos ouriços 0 O 160,000 140,000 120,000 100,000 80,000 60,000 40,000 20,000 0,000 O F O-2-F O-2-F= Orto-diphenols (mg eq Gallic ac. /g DM) F

C- Análise de Toxicidade : Índice de Germinação (IG) Índice de Toxicidade Fenólica (ITF) Resultados Agrião: IG (%) ITF extrato puro reduziu IG -> 41 %: IG maior Controlo devido ao aumento médio das raízes Agrião Extrato puro Extrato dil50% Controlo 41 1.29 114-0.29 100 0.00 Alface: revelou-se mais sensível Extrato puro 18 % IG Alface Extrato puro Extrato dil50% Controlo 18 1.78 80 0.43 100 0.00 ITF=(100-IG)/[fenóis totais] FT=46mg EAG/g DM

1. Bioremediação e variação no teor fenólico, antioxidante e perfil cromatográfico Metodologia: Para o tratamento 2 fungos filamentosos (Trametes versicolor+ isolado ainda não identificado-lem) meio de crescimento líquido (meio Eggert) sem glucose teor extrato ouriço 10% (v/v) tempo: 7;14;21; 28 dias Análises: fenóis totais (FT) Folin-Ciocalteau atividade antioxidante (AA%) redução radical ABTS + perfil cromatográfico HPLC_DAD

Total phenolic content (mg gallic acid eq./g dry weight Resultados Fenóis Totais Ambos fungos: teor FT (relativa/ Controlo- D0) 78.1% T. versicolor 45 40 35 30 25 77.7% isolado Lem 20 15 10 5 0 Control D7-T D7-L D14-T D14-L D21-T D21-L D28-T D28-L Days

AA % (relating D0) Resultados AA % Geral: variação negativa na %AA No entanto: oscilações positivas: D14 e D21 isolado Lem 4 3 2 1 0-1 -2 D7-T D7-Lem D14-T D14Lem D21-T D21-Lem D28-T D28-Lem -3 oxidações pelas polifenol oxidases que resultam em polimerizações????????? -4-5 -6 Days

0,0 2,0 4,1 6,1 8,1 10,2 12,2 14,2 16,3 18,3 20,3 22,4 24,4 26,4 28,5 30,5 32,5 34,6 36,6 38,6 40,7 42,7 44,7 46,8 48,8 50,8 52,9 54,9 56,9 59,0 61,0 63,0 65,1 67,1 69,1 71,2 73,2 mau 0,0 2,0 4,0 5,9 7,9 9,9 11,9 13,8 15,8 17,8 19,8 21,7 23,7 25,7 27,7 29,6 31,6 33,6 35,6 37,5 39,5 41,5 43,5 45,4 47,4 49,4 51,4 53,3 55,3 57,3 59,3 61,2 63,2 65,2 67,2 69,1 71,1 73,1 mau Resultados Perfil Cromatográfico ** Actuação fungo 200 150 D0-D28-325 D0-325 D28-325 Antes D0 Após D28 100 50 0-50 Time (min) Remoçao GERAL maioria dos Compostos 700 600 D0-D28-280 500 400 D28-280 D0-280 300 200 100 **-Análise HPLC-DAD só pode ser feita para um dos fungos 0-100 Time (min)

Resultados Variações no perfil cromatográfico para λ=280nm 280nm RT (min) Compound D0 (mau) D28 (mau) 4.325 C1 22.0 0.0 4.825 Gallic acid 330.0 62.3 8.108 3,4-dihydroxybenzoic acid 21.8 0.0 9.783 C3 9.8 0.0 8.167 C4 0.0 8.4 14.275 C5 13.8 16.0 16.883 C8 11.8 0.0 7 dos 10 dos compostos mais significativos do cromatograma sofreram decréscimo durante o ensaio 19.050 C10 13.3 0.0 24.342 Epicatechin? 0.0 13.5 33.058 Ellagic acid 68.3 28.0

Removal (%) Resultados 120 100 % da Remoçao Compostos 80 60 40 20 Média de remoção dos compostos originais ronda os 0 91% Compounds

Conclusões -Extratos aquosos (ouriços) revelaram-se semelhantes aos metanólicos em termos de FT diferença aprox. de 10-20 mg eq Ac gálico /g MS A análise comparativa de extratos aquosos de ouriços e inflorescências apresentaram elevada atividade antioxidante e muito semelhante entre si A análise de toxicidade do extrato aquoso ouriço (50 %) no agrião indica a posibilidade de haver algum tipo de indução no crescimento das raízes. O uso dos fungos Trametes versicolor e isolado Lem revelaram potencial na biorremediação Os fungos conseguiram usar o extrato aquoso 10% (v/v) de ouriço como única fonte de carbono

Trabalhos futuros -Caracterização aprofundada frações resultantes dos ensaios Perceber Metabolismo dos fungos Otimizar frações fenólicas resultantes da actividade fúngica com interesse compostos bioativos, Biorremediação. Otimizar potencial antioxidante e antimicrobiano.

Obrigada pela Vossa Atenção

Barbosa, 2016

IG %= (nºsemgermamostra/nºsemgermcontrol)* (médiacompraízamostra/médiacompraíz Controlo)

120,000 100,000 80,000 60,000 O F 40,000 20,000 0,000 FT