ESTUDO DA EFICIÊNCIA DA AÇÃO DE α-amilase BACTERIANA COMERCIAL PARA HIDRÓLISE DE AMIDO EM MALTODEXTRINA Marcelio Vilhena Silva 1, Elizama Aguiar-Oliveira 2, Eliana Setsuko Kamimura 3*, Rafael Resende Maldonado 1,4 1 Faculdade Municipal Professor Franco Montoro, R. dos Estudantes s.n., Mogi Guaçu, São Paulo, Brasil. 2 Universidade Federal da Bahia, campus Anísio Teixeira, Instituto Multidisciplinar em Saúde (IMS-CAT/UFBA), Departamento de Biociências, R. Rio de Contas, 58, Candeias, Vitória da Conquista, Bahia, Brasil. 3 Universidade de São Paulo, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA), Laboratório de Bioprocessos, Av. Duque de Caxias Norte, 235, Campus USP, Pirassununga, São Paulo, Brasil. 4 Universidade Estadual de Campinas, Colégio Técnico de Campinas (COTUCA),Departamento de Alimentos, R. Jorge Figueiredo Corrêa, 735, Parque Taquaral, Campinas, São Paulo, Brasil. e-mail para contato: ratafta@yahoo.com.br RESUMO Maltodextrina pode ser produzida pela ação hidrolítica das α-amilases sobre o amido e a otimização deste processo visa redução de custos sem perda de eficiência. Este estudo teve por objetivo avaliar a hidrólise do amido à maltodextrina por uma α-amilase comercial através de delineamentos fatoriais com as varáveis independentes: razão enzima/amido, concentração de amido, ph e temperatura. Os resultados obtidos permitiram a obtenção de uma conversão de 12,4% de dextrose equivalente após 30 min de reação com economia de 5% sobre o consumo de enzima. As melhores condições de hidrólise foram determinadas como: 190 µl de enzima por kg de amido, 20 Be de amido, ph = 6,0, 200 ppm de cálcio, 96 C e 400 rpm de agitação. 1. INTRODUÇÃO Depois da celulose, o amido é o segundo maior polissacarídeo de reserva dos vegetais e é o substrato fundamental para as amilases, pois é composto basicamente por glicoses ligadas entre si de forma linear (α-1,4) ou ramificada (α-1,6) (Agrawal et al., 2005; Sharma & Satyanarayana, 2013). Amido hidrolisado tem diversas aplicações nas indústrias de alimentos, bebidas, farmacêutica, têxtil, detergentes, etc e por estes motivos as amilases (E.C 3.2.1.0) são as enzimas mais importantes tanto para hidrólise como sacarificação de carboidratos (Amid & Manap, 2014).
Tendo como base a faixa de hidrólise (conversão) do amido à maltodextrina de 10 a 14% dextrose equivalente (DE), normalmente relacionada à maltodextrina comercial proveniente do amido de milho (Coutinho, 2007), o objetivo desse estudo foi avaliar as melhores condições de hidrólise do amido à maltodextrina pela α-amilase comercial de Bacillus Licheniformis (Termamyl 120 L, Novozymes), em escala laboratorial, por meio de delineamentos fatoriais. 2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1. Materiais A amilase empregada neste trabalho foi α-amilase bacteriana (Termamyl 120 L, Novozymes) com atividade de 120 KNUT (1 KNUT equivale a quantidade de enzima que dextriniza 5,26 g de amido seco por hora a 37 C e ph 7,1). 2.2. Hidrólise enzimática do amido Ensaios preliminares foram realizados para verificar o tempo necessário para conversão enzimática (hidrólise) do amido à maltrodextrina na faixa de 10 a 14% de DE. Para tanto, adicionou-se 500 g de solução de amido (19 Be 33,63%m/m de substância seca) e cálcio (200 ppm) ao recipiente de reação. A temperatura das amostras foi ajustada para 45 C e adicionou-se 0,1 ml da solução enzimática comercial; o ph foi ajustado, para 6,0, com adição de CaCO 3 sólido e a temperatura do sistema foi então elevada para 96 C e a agitação fixada em 400 rpm. Os tempos de reação avaliados foram de 10, 20, 30, 40, 50 e 60 minutos de hidrólise. Ao término de cada intervalo, a reação foi paralisada com adição de HCl 2,5 mol/l até os sistemas atingirem ph 4,0. De cada condição avaliada determinou-se a quantidade de maltodextrina produzida, expressa em % DE. Após realização dos ensaios preliminares, selecionou-se o tempo de 30 minutos como suficiente para atingir a concentração de maltodextrina entre 10 e 14% DE. Com esta condição foi realizado um delineamento experimental fracionário 2 4-1 (Rodrigues & Iemma, 2014) para avaliar os efeitos das variáveis independentes: razão enzima/amido (180 a 200 μl enzima / kg de solução de amido), concentração de amido (19 a 20 Be), ph (6,0 a 6,5) e temperatura de hidrólise (93 a 96 C). As condições de cada experimento do delineamento fatorial fracionário encontram-se na Tabela 1. Na sequência realizou-se um segundo delineamento experimental, do tipo central composto rotacional (DCCR) 2 2 + 4 pontos axiais + 3 pontos centrais. Para esta etapa, foram avaliadas as variáveis independentes: razão enzima/amido e ph nas faixas de 176 a 204 µl/kg e 5,7 a 6,3, respectivamente, sendo fixados temperatura e concentração de amido em 96 C e 20 Be, respectivamente. A Tabela 3 apresenta a matriz deste delineamento. Todas as hidrólises enzimáticas foram realizadas em um copo de Keller de 500 ml, acoplado em banho-maria(tipo Blattman ). As análises estatísticas foram feitas no programa Statistica 8.0. 2.3. Determinação da concentração de maltodextrina
A concentração de maltodextrina foi determinada pelo método de Fehling. Após o final da hidrólise, a solução obtida foi filtrada e 100 g do filtrado foram transferidos para balão volumétrico de 500 ml, que teve volume completado com água destilada e homogeneizado por agitador magnético. A solução diluída foi utilizada para titular 25 ml da solução padrão de Fehling contida em erlenmeyer de 250 ml e mantida sob aquecimento, até o completo desaparecimento da coloração azul e do precipitado avermelhado, com auxílio do indicador azul de metileno. A partir do volume gasto na titulação determinou-se a quantidade de dextrose equivalente (% DE) em cada amostra, conforme a relação: %DE=100%*[F/(SS.m.V)], sendo F o fator da solução de Fehling, SS a concentração de sólidos solúveis na amostra hidrolisada, m a massa da amostra hidrolisada (g) e V o volume da amostra hidrolisada e diluída utilizados na titulação (ml). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados obtidos com os ensaios preliminares indicaram uma conversão enzimática linearmente proporcional ao tempo de hidrólise (R 2 = 0,96 e inclinação de 0,18 %DE min -1 ), sob as condições avaliadas; isso sugere que tempo apresentou um efeito positivo sobre a conversão de amido em maltodextrina. Tendo sido pré-definida a concentração de maltodextrina desejada (10-14% DE), o tempo de hidrólise adequado encontra-se entre 20 e 40 minutos, assim sendo, o tempo de 30 min foi selecionado para a próxima etapa por ser o valor médio. Os efeitos das variáveis independentes razão enzima/amido, concentração de amido, ph e temperatura sobre a conversão enzimática de amido à maltodextrina utilizando α-amilase bacteriana comercial foram avaliados através de delineamento fatorial fracionário 2 4-1. A matriz do delineamento, os resultados obtidos e o efeito de cada variável estão nas Tabelas 1 e 2. Tabela 1. Delineamento fatorial fracionário 2 4-1 para conversão de amido à maltodextrina por α- amilase comercial com as variáveis independentes: razão enzima/amido, concentração de amido, ph e temperatura e a variável resposta concentração de maltodextrina, após 30 min a 400 rpm. Experimentos Enzima/Amido Amido Temperatura Maltodextrina ph (μlenz/kgamido) ( Be) ( C) (%DE) 1 180 (-1) 19 (-1) 6,0 (-1) 90 (-1) 10,0 2 200 (+1) 19 (-1) 6,0 (-1) 96 (+1) 13,0 3 180 (-1) 20 (+1) 6,0 (-1) 96 (+1) 11,8 4 200 (+1) 20 (+1) 6,0 (-1) 90 (-1) 11,0 5 180 (-1) 19 (-1) 6,5 (+1) 96 (+1) 10,5 6 200 (+1) 19 (-1) 6,5 (+1) 90 (-1) 10,0 7 180 (-1) 20 (+1) 6,5 (+1) 90 (-1) 9,5 8 200 (+1) 20 (+1) 6,5 (+1) 96 (+1) 12,2 9 190 (0) 19.5 (0) 6,25 (0) 93 (0) 12,1 10 190 (0) 19.5 (0) 6,25 (0) 93 (0) 12,3 11 190 (0) 19.5 (0) 6,25 (0) 93 (0) 12,4
Tabela 2. Efeitos das variáveis no delineamento fatorial fracionário 2 4-1 para a conversão enzimática de amido à maltodextrina após 30 minutos de reação a 400 rpm. Efeito Erro Variável t(7) Valor-p (%DE) Padrão Média 11,00 0,09 119,9 <0,001* Curvatura 2,53 0,35 7,21 < 0,001* Razão enzima/amido 1,10 0,18 5,99 0,002* Concentração de amido 0,25 0,18 1,36 0,231 ph -0,90 0,18-4,90 0,004* Temperatura 1,75 0,18 9,54 <0,001* Em relação à razão enzima/amido, o aumento na quantidade de enzima levou a um aumento na taxa de conversão; entretanto, do ponto de vista industrial não há interesse de se aumentar demasiadamente a conversão enzimática visto que a faixa de conversão desejável é de 10 e 14% DE, além disso, a diminuição da quantidade de enzima é interessante em termos de custos, sendo assim, para o próximo delineamento decidiu-se ampliar a faixa de concentração da enzima. A concentração de amido não apresentou efeito significativo na faixa estudada, por isso, decidiu-se utilizar a concentração mais elevada, uma vez que em geral, esta seria a condição mais próxima de uma situação industrial. Já o ph apresentou um efeito negativo e estatisticamente significativo, indicando que em ph 6,0 a ação da enzima foi mais eficiente; além disso, dados do fabricante indicam que a enzima utilizada apresenta ph ótimo na faixa entre 5,8 e 6,2, dessa forma, a faixa de valores de ph foi pouco alterada para o próximo delineamento. Para a temperatura, o efeito foi positivo e estatisticamente significativo, no entanto, o nível +1 encontra-se no valor máximo fornecido pelo equipamento utilizado nesse estudo, sendo assim, para o próximo delineamento, a temperatura foi fixada no nível mais alto, ou seja, 96 C. Por fim, a análise da curvatura foi estatisticamente significativa para o delineamento fracionário, o que sugere, a partir dos resultados dos pontos centrais, que um modelo de 2ª ordem deve ser adequado para explicar o processo avaliado dentro das faixas avaliadas (Rodrigues& Iemma, 2014). Com base na análise do delineamento fracionário realizou-se um delineamento completo 2 2 + 4 pontos axiais + 3 pontos centrais para avaliar os novos níveis das variáveis independentes: razão enzima/amido e ph sobre a conversão de amido à maltodextrina. As condições utilizadas em cada ensaio e os resultados obtidos estão Tabela 3 e a análise de variância (ANOVA) se encontra na Tabela 4. Os melhores resultados obtidos para a conversão enzimática de amido à maltodextrina ocorreram nos ensaios dos pontos centrais (Tab. 3), com média de (12,37 ± 0,06)%DE e no ensaio 6, com 12,8%DE. Para a ANOVA foram considerados apenas os efeitos estatisticamente significativos (p< 0,10): termos linear e quadrático para razão enzima/amido e o termo quadrático para ph. Dessa forma, o modelo codificado e reduzido que explica a conversão de amido em maltodextrina dentro das condições estudadas é representado por (DE)=12,36+0,73(R)-0,66(R 2 )-0,73(P 2 ), em que DE é a conversão de amido em maltodextrina, R é a razão enzima/amido e P o ph do meio reativo. O modelo descrito apresentou teste F de 5,37 e é estatisticamente significativo e predito com 97% de confiança (p = 0,03). No entanto, o valor de R 2 foi relativamente baixo (0,70), indicando que o modelo consegue explicar apenas 70% da variabilidade dos dados experimentais. Entretanto, o
modelo pode ser considerado adequado para explicar o estudo realizado, uma vez que as faixas utilizadas para cada variável foram bastante reduzidas, o que indica que uma pequena variação pode afastar consideravelmente a resposta obtida do valor predito pelo modelo. Os valores preditos pelo modelo e os desvios relativos com relação aos valores experimentais podem ser visualizados na Tabela 3, na qual se verifica que o maior erro relativo foi de 10% e que, nas condições do ponto central (melhores resultados), os erros relativos obtidos foram baixos. Tabela 3. Delineamento fatorial completo 2 2 + 4 pontos axiais + 3 pontos centrais para conversão enzimática de amido à maltodextrina utilizando α-amilase comercial, sendo as variáveis independentes a razão enzima/amido e o ph e a variável resposta a concentração de maltodextrina As hidrólises foram conduzidas a 96 C e 400 rpm por 30 minutos, concentração de amido e de cálcio de 20 Be e 200 ppm, respectivamente. Os dados foram analisados com o software Statistica 8.0 (StatSoft) e os valores preditos pelo modelo de segunda ordem também são apresentados. Experimentos Enzima/Amido (μlenz/kgamido) ph Maltodextrina Observada (%DE) Maltodextrina Predita (%DE) Desvio padrão (%) 1 180 (-1) 5,8 (-1) 11,0 10,2 7,8 2 200 (+1) 5,8 (-1) 11,7 11,7 0,0 3 180 (-1) 6,2 (+1) 11,0 10,2 7,8 4 200 (+1) 6,2 (+1) 10,8 11,7-7,7 5 176 (-1,41) 6,0 (0) 9,0 10,0-10,0 6 204 (+1,41) 6,0 (0) 12,8 12,1 5,8 7 190 (0) 5,7 (-1,41) 11,0 10,9 0,9 8 190 (0) 6,3 (+1,41) 10,5 10,9-3,7 9 190 (0) 6,0 (0) 12,4 12,4 0,0 10 190 (0) 6,0 (0) 12,3 12,4-0,8 11 190 (0) 6,0 (0) 12,4 12,4 0,0 Tabela 4. Análise de variância (ANOVA) para a conversão enzimática de amido à maltodextrina utilizando α-amilase comercial. Os dados foram obtidos com o software Statistica 8.0 (StatSoft). Variável Soma dos Quadrados Grau de Liberdade Soma dos Quadrados Médios Teste F Valor-p Média 8,540 3 2,85 5,37 0,03 Curvatura 3,707 7 0,53 Razão enzima/amido 3,700 5 0,74 Concentração de amido 0,007 2 0,0035 ph 12,247 10 Sendo o modelo estatisticamente significativo e preditivo, foi possível realizar a análise de superfície de resposta (dados não apresentados), da qual foi possível observar que a melhor região para conversão do amido em maltodextrina, nas condições avaliadas, é com a razão enzima/amido entre 190 e 200 µl/kg (níveis 0 e +1) e ph entre 5,9 e 6,1 (níveis -0,5 e 0,5). A região de ph obtida
encontra-se dentro da faixa ótima indicada pelo fabricante (5,8 a 6,2) e a razão enzima/amido de 190 µl/kg representa redução de 5% em relação a quantidade recomendada pelo fabricante. Comparativamente, a hidrólise enzimática avaliada nesse trabalho foi mais eficiente do que a realizada por Božić et al. (2011) que obtiveram 37% de hidrólise após 4 h (ph 6,5 e 65 C) sobre amido de milho com α-amilase de B. lincheniformes ATCC 9945a, apesar do resultado 3 vezes maior, o tempo de hidrólise obtido por esses pesquisadores foi 8 vezes maior, levando a uma menor produtividade. Em outro estudo (Apar e Özbek, 2004), sob as condições de ph 6,0, 60 C, 300 rpm e 30 min a α-amilase comercial de Bacillus sp. (Sigma ) apresentou um grau de hidrólise de 47% em reator, uma conversão quase duas vezes maior que o resultado desse trabalho; esses autores utilizaram 1,4 g de enzima/l, mas a atividade enzimática não foi mencionada. 4. CONCLUSÃO Neste estudo foi possível obter uma condição ótima para a conversão de amido para maltodextrina utilizando a enzima comercial α-amilase considerando a faixa de conversão desejável para a aplicação industrial de 10 a 14% DE. As melhores condições obtidas foram: temperatura (96 C), concentração de amido (20 Be), razão enzima/amido (entre 190 a 200 µl/kg) e ph (entre 5,9 e 6,1) que resultaram em conversão média de 12,36% (DE), com condições de reação de 200 ppm de cálcio, agitação de 400 rpm e tempo de reação de 30 minutos. 5. REFERÊNCIAS Agrawal, M., Pradeep, S., Chandraraj, K., Gummadi, S.N. 2005. Hydrolysis of starch by amylase from Bacillus sp. KCA102: a statistical approach. Process Biochemistry, 40, 2499 2507. Amid, M., Manap, M.Y.A. 2014. Purification and characterisation of a novel amylase enzyme from red pitaya (Hylocereuspolyrhizus) peel. Food Chemistry, 165 412 418. Apar, D.K., Özbek, B. 2004.α-Amylase inactivation during corn starch hydrolysis process. Process Biochemistry, 39 1877 1892. Božić, N., Ruiz, J., López-Santín, J.,Vujčić, Z. 2011.Production and properties of the highly efficient raw starch digesting α-amylase from a Bacillus licheniformis ATCC 9945a. Biochemical Engineering Journal, 53(2), 203-209. Coutinho, A.P.C. 2007.Produção e caracterização de maltodextrinas a partir de amidos de mandioca e batata doce. Tese de Doutorado, Faculdade de Agronomia, Universidade Estadual Paulista (UNESP) campusbotucatú, Botucatú, São Paulo. Rodrigues, M.I., Iemma, A.F. 2014. Experimental Design and Process Optimization; CRC Press, Boca Raton, USA. Sharma, A., Satyanarayana, T. 2013. Microbial acid-stable α-amylases: Characteristics, genetic engineering and applications. Process Biochemistry, 48, 201 211.