.REDVET - Revista electrónica de Veterinaria - ISSN 1695-7504 Características seminais de garanhões Pôneis da raça Brasileira Miguel Alejandro Silva Rua 1* ; Celia Raquel Quirino 1** ; Aylton Bartholazzi Junior 1 ; Paula Nascimento Santoro 1 ; Wilder Hernando Ortiz Vega 1 ; Luis Fonseca Matos 1 1 Laboratório de Reprodução e Melhoramento Genético Animal (Universidade Estadual do Norte Fluminense/UENF); ** Pesquisadora CNPq. Av. Alberto Lamego, 2000, Campos dos Goytacazes, Rio de Janeiro, Brasil. *Autor correspondente: miguelvet-rua@hotmail.com; crqster@gmail.com Resumo A qualidade do sêmen do garanhão é um dos fatores determinantes para se obter sucesso em programas reprodutivos já que na espécie equina é comum a existência de animais com problemas ligados à reprodução. Sendo assim, torna-se indispensável o exame andrológico de rotina para seleção de garanhões que serão utilizados na estação reprodutiva. O objetivo do presente estudo foi avaliar as características físicas do sêmen de garanhões pôneis da raça Brasileira. Foi coletado sêmen de garanhões adultos pôneis da raça Brasileira nos meses de dezembro, março, abril, maio, agosto e setembro. Os animais foram criados no Norte do Estado do Rio de Janeiro e foram avaliadas as características de ph seminal, volume seminal, concentração espermática e número total de espermatozoides. Com auxílio da análise computadorizada foram avaliadas a motilidade total, motilidade progressiva e as demais características da cinética espermática, em relação à idade dos animais e ao mês de coleta. Foi realizada a análise de variância e foram calculadas as correlações das características. Em geral as características não variaram entre animais de diferentes idades e nos diferentes meses de coleta. Houve ligeira variação da concentração espermática, e de algumas características da cinética espermática. Com isso, sugere-se que os garanhões possam ser utilizados na reprodução no decorrer do ano, sem que haja prejuízo das características ligadas ao potencial fertilidade do sêmen que apresentou boa qualidade. Palavras-chave: sêmen, equino, reprodução. 1
1. Introdução A equideocultura mundial exerce um importante papel como fonte geradora de renda e empregos. No Brasil, criação de equinos ocupa posição de destaque pelo grande número de animais e pela qualidade dos mesmos, com isso o país tem exportado material genético para vários outros países (Alvarenga, 2002). No Brasil, a criação de animais como os mini Pôneis, principalmente os pôneis da Raça Brasileira, tem sido popularizada, com boa aceitação do mercado. O surgimento dessas raças de mini cavalos, ocorreu devido à seleção realizada pelo homem durante muitos anos. Os Pôneis da raça Brasileira são destinados à iniciação de crianças em equitação e em programas de terapia, além de apresentar bom temperamento, serem dóceis e terem proporções corporais equilibradas. A média de altura é de 86.0 ± 0.6 cm (Quirino et al., 2012). A aplicação de biotécnicas reprodutivas utilizando o sêmen tem possibilitado maior aproveitamento de animais de grande potencial zootécnico. O reprodutor deve apresentar boa fertilidade tanto in vitro quanto in vivo, no entanto a qualidade do sêmen pode variar de um indivíduo para outro, com o manejo reprodutivo e com a idade e estação reprodutiva. Por isso, para avaliar o potencial de fertilidade dos garanhões é fundamental a análise do sêmen e das células espermáticas (Fernandes e Pimentel, 2002). No parênquima testicular, são produzidos bilhões de espermatozoides diariamente, e essa quantidade pode variar entre animais e entre coletas do mesmo animal, assim como pelo volume do parênquima testicular, da estação, com o ambiente ou por algum processo patológico (Heringer et al., 2004; Robalo Silva et al., 2007). Sieme et al. (2004) Recomendam a utilização de métodos apropriados de coleta de sêmen, com intervalo e frequência adequada. Os mesmo autores relataram que, em programas de inseminação artificial, o sêmen do garanhão coletado em dias alternados não apresentou diferenças sobre a qualidade do sêmen. Os equinos em geral, mostram reprodução estacional, possuindo uma capacidade reprodutiva máxima nos dias longos (primavera e principalmente no verão). A atividade reprodutiva durante o ano é regulada pelo eixo hipotalâmico hipofisário gonadal, sincronizado através do estímulo ambiental chamado fotoperíodo. Estes estímulos regulam a atividade gonadal (Gorman e Zucker, 1995). O objetivo do presente estudo foi avaliar as características físicas do sêmen de garanhões pôneis da raça Brasileira em relação à idade dos animais ao mês de coleta do sêmen. 2
2. Material e Métodos Foram realizadas 54 avaliações em garanhões adultos (5 a 13 anos) Pôneis da raça Brasileira situados no Norte do Estado do Rio de Janeiro, Brasil (Latitude 21 o 45 15, Longitude 41 o 19 28, Altitude 13 metros). Nessa região, o clima é quente e seco entre abril a outubro e chuvoso desde novembro a março. A temperatura média é de 25º C com mínima de 20º e máxima de 35º C. Os animais foram mantidos em baias individuais e recebendo ração comercial peletizada Equitec com 12% de proteína bruta, 15% de fibras e 20 g/kg de gordura e feno duas vezes ao dia. Água e sal mineral foram fornecidos ad libitum durante todo o período em que decorreu o estudo. Todos os animais mantiveram boa condição corporal durante o estudo, que foi realizado nos meses de dezembro de 2012, março, abril, maio, agosto e setembro de 2013. Antes do período experimental, os garanhões foram submetidos a exame clínico dos testículos e exame andrológico e foi constatado que todos mostraram características seminais e comportamento sexual normal e uma boa adaptação à técnica de coleta de sêmen com utilização de vagina artificial da marca Botupharma. Para a coleta de sêmen foi utilizada uma égua em estro natural como manequim para estimular o garanhão a realizar a monta. A vagina artificial (Botufarma ) foi preparada previamente, sendo preenchida com água à temperatura de aproximadamente 45º C e com um volume ajustado para cada animal. Um filtro de nylon foi acoplado no copo coletor para separar a porção gelatinosa de sêmen a qual foi descartada. Foram realizadas 6 coletas de sêmen de cada animal, com intervalo de 30 dias. Imediatamente após a coleta do sêmen, foi feita uma análise subjetiva do sêmen in natura. Foram avaliadas as seguintes características: motilidade (Motil %) e Vigor avaliado com uso de um microscópio óptico com aumento de 100X; volume (ml) medido em tubo graduado e o ph medido com fita medidora de ph. Nas análises de laboratório, uma amostra do sêmen foi diluída na proporção de 1:200 em solução de formol citrato para fazer a estimativa de concentração espermática (Conc) com contagens de células espermáticas em câmara de Neubauer. Para se obter o resultado do número total de espermatozoides (NTSTZ), multiplicou-se a concentração espermática pelo volume espermático de cada animal. 3
Foi realizada a análise computadorizada do sêmen (CASA) utilizando o software Hamilton Thorn Research (HTM-CEROS ), onde foram avaliados os parâmetros de motilidade e cinemática espermática. As variáveis de motilidade espermática analisadas foram: Motilidade total (MTT %); Motilidade progressiva (MP %); Velocidade média do trajeto (VAP µm/s); Velocidade progressiva (em linha reta) (VSL µm/s); Velocidade curvilínea (VCL µm/s); Amplitude do deslocamento lateral da cabeça (ALH µm); Frequência de batimentos (BCF Hz); Retidão (STR %) e Linearidade (LIN %). Foi feita a análise de variância das características físicas do sêmen para verificar efeito de mês de coleta (PROC MIXED, SAS). As médias foram comparadas utilizando o teste Student-Newman- Kelis (SNK) a 5% de probabilidade. O modelo utilizado foi Y ij = μ + Id i + M j + E ij ; em que: Y ij = variável dependente; μ =média geral, associada à variável dependente; Id i = efeito da i ésima idade; M j = efeito da j esimo mês de coleta; e ij = resíduo aleatório associado a cada observação. Para obter as correlações simples, foi usado o procedimento CORR do software SAS (2009). 3. Resultados e Discussão Não houve influência da idade nas características de ph, Vol e NTSTZ (p > 0,05), entretanto houve influência da idade na concentração espermática (p < 0,05). A média geral de ph foi de 7,8 ± 0,5. Valor semelhante ao relatado por Rua et al. (2013). Os valores observados para ph do sêmen dos garanhões do presente estudo, apresentaram-se mais elevados em comparação com a média geral observada em estudos com garanhões de maior porte (7,3 ± 0,1) como o citado por Ribas (2007). No entanto, foi observada média geral próxima à média de ph observada por Veronesi et al. (2010) que foi de 7,7 ± 0,1 ao estudar garanhões na Itália. A média de ph encontrada no presente estudo, apresenta-se ligeiramente acima da média relatada e sugerida como normalidade para garanhões pelo Colégio Brasileiro de Reprodução animal (CBRA, 2013), que varia de 6,8 a 7,6. Segundo Junior (1997) valores de ph mais altos sugerem a presença de infecções do trato reprodutivo. No entanto, apesar de ter sido observada uma maior média, sugere-se que seja normal encontrar esses valores de ph em pôneis da raça Brasileira, uma vez que os garanhões encontravam-se saudáveis e sem históricos de problemas reprodutivos relacionados com a fertilidade. 4
A média geral de volume seminal dos pôneis do presente estudo foi de 10,9 ± 5,6 ml. Maia et al. (2012) ao estudarem as características seminais de Pôneis criados no Norte do Brasil, relatou valor de volume seminal de 12,8 ± 5,7 ml. Rua et al. (2013) relataram média de 10.1 ± 5.1 ml. Entretanto, Neves et al. (2006) relataram valores de volume seminal de 25.3 e 14.0 ml no primeiro e segundo ejaculado de garanhões pôneis criados no Sul do Brasil. Sugerindo-se que regiões diferentes com climas diferentes possam ter influenciado no volume seminal. A média geral de concentração espermática foi de 432,7 ± 224,6 x 10 6 sptz/ml, sendo superior em comparação com 295 ± 107 x 10 6 sptz/ml observada por Maia et al. (2012). Segundo Sieme et al. (2004) a divergência observada na concentração espermática entre estudos, depende do intervalo ente coletas. Com isso, sugere-se que essa diferença tenha ocorrido devido ao fato de no presente estudo as coletas tiveram intervalo de 30 dias, enquanto no estudo realizado por Maia et al. (2012) as coletas tiveram intervalo de 7 dias, havendo maior esgotamento das reservas epididimária dos garanhões. Neves (2014) observaram média de concentração espermática de 201 x 10 6, sendo realizadas duas coletas com intervalo de uma hora. Lucena et al. (2014) ao avaliarem o sêmen de garanhões pôneis a cada sete dias, observaram concentração espermática de 268 x 10 6. Segundo McKinnon et al. (2011) as características de concentração espermática e NTSTZ sofrem bastante variações influenciadas pelo ambiente em coletas feitas no mesmo animal em diferentes momentos. A média geral do número total de espermatozoides (NSTZ) por ejaculado observado no presente estudo foi de 4,5 ± 3,7 x 10 9 sptz/ejaculado. Rua et al. (2013) relataram 3.3 ± 2.4 x 10 9 para NTSTZ de pôneis da raça Brasileira. Neves (2014) observaram média de 4.9 ± 2.4 x 10 9 sptz/ejaculado. Deichsel et al. (2008) ao estudar as características seminais de pôneis de Shetland observaram uma média para NSTZ de 3,2 ± 0,4 x 10 9. Na tabela 1 apresentam-se as médias das características físicas do sêmen de pôneis da raça Brasileira criados no Norte do Estado do Rio de Janeiro de acordo com a idade dos garanhões. Tabela 1. Médias das características físicas do sêmen: ph, volume (Vol), concentração espermática (Conc) e número total de espermatozoides (NTSTZ) em relação à idade dos garanhões pôneis da raça Brasileira do estado do Rio de Janeiro, Brasil. Idade (anos) CF 5 7 8 9 11 13 ph 7,7 ± 0,3 a 8,0 ± 0,1 a 7,7 ± 0,6 a 7,8 ± 0,4 a 7,8 ± 0,6 a 7,7 ± 0,5 a Vol (ml) 12,2 ± 3,2 a 12,6 ± 4,6 a 8,6 ± 5,0 a 8,4 ± 2,8 a 13,7 ± 8,6 a 11,2 ± 6,4 a Conc (x 10 6 ) 436,7 ± 198,6 ab 239,0 ± 65,9 b 424,9 ± 216,3 ab 488,3 ± 269,1 ab 637,4 ± 190,7 a 356,2 ± 224,9 ab NTSTZ (x 10 9 ) 5,4 ± 3,3 a 3,0 ± 1,5 a 3,3 ± 2,1 a 4,1 ± 3,2 a 8,2 ± 7,0 a 3,4 ± 2,1 a Letras iguais na mesma linha não apresentam diferença estatística entre as médias de idade (p > 0.05). 5
Considerando-se que 5 aos 13 anos de idade os animais são adultos, já era de se esperar que as médias de ph, volume espermático e NSTZ não variaram em relação à idade. No entanto, houve diferença entre as médias de concentração espermática, em que a menor média observada foi em animais de 7 anos de idade e a maior média observada foi nos garanhões de 11 anos de idade. Verificou-se que não há aumento do número de espermatozoides à medida que aumenta a idade dos animais. McKinnon et al. (2011) relataram que à medida que aumenta a idade dos garanhões, mesmo que já tenham atingindo a fase adulta, ha um contínuo aumento do número de células do parênquima testicular, em consequência aumento na produção espermática diária. No entanto, em pôneis da raça Brasileira adultos, como observado no presente trabalho, houve apenas variações individuais entre os garanhões, independente da idade dos animais. Na tabela 2 se apresentam as médias das características físicas do sêmen de acordo com mês de coleta dos animais. Tabela 2. Médias das características físicas do sêmen como ph, volume (Vol), concentração espermática (Conc) e número total de espermatozoides (NTSTZ) em relação aos meses de coleta de sêmen dos garanhões pôneis da raça Brasileira Meses de coleta CF Dezembro Março Abril Maio Agosto Setembro ph 7,8 ± 0,4 a 8,0 ± 0,6 a 7,9 ± 0,6 a 7,7 ± 0,5 a 7,6 ± 0,3 a 7,7 ± 0,5 a Volume 12,2 ± 6,8 a 9,6 ± 5,4 a 10,5 ± 5,4 a 16,2 ± 6,6 a 8,9 ± 3,9 a 9,7 ± 5,9 a Concent 388,1 ± 251,2 ab 572,5 ± 247,8 a 273,1 ± 112,1 b 383,1 ± 153,9 ab 500,2 ± 237,8 ab 398,2 ± 121,1 ab NTSTZ 6,5 ± 6,7 a 4,8 ± 2,7 a 2,6 ± 1,3 a 3,9 ± 3,3 a 4,6 ± 3,5 a 4,5 ± 2,8 a Letras iguais na mesma linha não apresentam diferença estatística entre as médias (p > 0.05). As características de ph do sêmen e volume seminal não variaram de acordo com os meses em que foram realizadas as coletas. No entanto, foram observadas diferenças na concentração espermática em que foi maior no mês de março e menor no mês de abril. McKinnon et al (2011) relataram que durante a estação reprodutiva há um aumento do número de células de Leyding e do tamanho dos túbulos seminíferos, consequentemente haverá aumento do parênquima testicular e estímulo da produção de espermatozoides. No presente trabalho, foram observadas variações em que as maiores médias foram nos meses da estação reprodutiva (dezembro, março e abril). Sendo assim, sugere-se que o intervalo de um mês ente as coletas tenha influenciado nos resultados, pois segundo Sieme et al. (2004) a frequência na realização das coletas de sêmen é importante para manter a qualidade do sêmen de garanhões. Apesar de terem sido observadas variações na concentração espermática, o NSTZ não varou em relação aos meses de coleta. 6
Na tabela 3 apresentam-se as características cinéticas espermáticas do sêmen de garanhões pôneis da raça Brasileira. Tabela 3. Médias das características de cinética espermática. motilidade total (MTT), motilidade progressiva (MP), velocidade do trajeto (VAP), velocidade progressiva (VSL), velocidade curvilínea (VCL), amplitude lateral da cabeça (ALH), frequência de batimentos (BCF), retidão (STR) e linearidade (LIN), do sêmen de garanhões Pôneis da raça Brasileira de acordo com a idade dos animais do estado do Rio de Janeiro, Brasil. Cinética Idade (anos) espermática 5 7 8 9 11 13 MTT 84,2 ± 7,7 a 89,2 ± 2,8 a 81,2 ± 11,6 a 92,0 ± 1,8 a 92,8 ± 2,1 a 80,4 ± 10,9 a MP 50,8 ± 4,9 a 52,4 ± 10,5 a 50,3 ± 14,4 a 65,7 ± 10,4 a 60,9 ± 3,8 a 54,3 ± 12,6 a VAP 80,1 ± 7,1 a 82,7 ± 9,5 a 79,6 ± 16,7 a 94,6 ± 13,5 a 97,2 ± 13,9 a 81,8 ± 14,2 a VSL 62,8 ± 6,9 a 61,3 ± 8,9 a 62,2 ± 13,5 a 74,6 ± 13,1 a 74,1 ± 10,3 a 64,9 ± 12,1 a VCL 142,5 ± 13,1 b 151,8 ± 12,3 b 142,2 ± 27,6 b 164,1 ± 20,3 ab 179,1 ± 18,1 a 139,5 ± 19,5 b ALH 6,7 ± 0,2 b 6,7 ± 0,7 b 6,5 ± 0,8 b 6,9 ± 0,8 b 7,9 ± 0,5 a 6,1 ± 0,5 b BCF 26,6 ± 3,5 a 26,2 ± 2,0 a 26,9 ± 3,1 a 26,5 ± 5,5 a 25,8 ± 2,7 a 26,3 ± 3,0 a STR 78,0 ± 4,0 a 76,0 ± 3,4 a 76,5 ± 4,0 a 79,3 ± 4,9 a 75,5 ± 2,0 a 79,0 ± 2,7 a LIN 44,5 ± 2,8 ab 43,8 ± 4,5 ab 43,3 ± 3,8 ab 46,8 ± 3,5 a 42,0 ± 1,7 b 47,5 ± 3,2 a Letras iguais na mesma linha não apresentam diferença estatística entre as médias (p<0.05). As médias de motilidade total (MTT) e motilidade progressiva (MP) não variaram com a idade dos animais. As médias de MTT foram ligeiramente superiores em comparação com as médias observadas por Maia et al. (2012) em pôneis do Brasil. Deichsel et al. (2008) em pôneis da raça Shetland, encontraram motilidade total de 64 ± 6,7 % e para motilidade progressiva de 38,6 ± 5,5 % sendo estes valores consideravelmente menores em comparação com as médias observadas no presente estudo. As características de VAP, VSL, BCF e STR também não variaram em relação à idade dos garanhões. As características VCL, ALH e LIN apresentaram pequenas diferenças entre as idades dos garanhões, no entanto não foi suficiente para alterar a qualidade espermática, considerando que esses resultados se encontram dentro da normalidade. Os valores de cinética espermática observados no sêmen de pôneis da raça Brasileira do presente trabalho apresentam-se próximos aos valores observados em outros estudos com análise computadorizada do sêmen de garanhões de raças de porte maior (Nascimento, 2006; Silva, 2010). Na tabela 4 estão apresentadas as médias das características de cinética espermáticas dos garanhões pôneis da raça Brasileira em relação ao mês de coleta. 7
Tabela 4. Médias das características de cinética espermática como motilidade total (MTT), motilidade progressiva (MP), velocidade do trajeto (VAP), velocidade progressiva (VSL), velocidade curvilínea (VCL), amplitude lateral da cabeça (ALH), frequência de batimentos (BCF), retidão (STR) e linearidade (LIN), do sêmen de garanhões pôneis da raça Brasileira em relação ao mês de coleta. Cinética Meses de Coleta espermática Dezembro Março Abril Maio Agosto Setembro MTT 84,3 ± 12,4 a 85,1 ± 8,0 a 85,1 ± 8,02 a 87,1 ± 10,3 a 87,6 ± 7,6 a 81,3 ± 16,0 a MP 56,0 ± 8,2 a 52,4 ± 8,8 a 52,4 ± 8,8 a 59,1 ± 14,5 a 58,6 ± 10,6 a 48,5 ± 17,4 a VAP 97,2 ± 8,2 a 90,1 ± 11,2 a 90,1 ± 11,5 a 88,4 ± 19,5 a 83,6 ± 12,5 a 66,7 ± 10,6 b VSL 78,1 ± 1,9 a 70,6 ± 8,2 a 68,2 ± 9,0 a 69,5 ± 15,0 a 65,0 ± 11,2 a 50,9 ± 8,2 b VCL 157,1 ± 29,8 a 158,0 ± 21,4 a 158,2 ± 21,5 a 154,9 ± 30,8 a 153,4 ± 20,4 a 124,7 ± 22,1 b ALH 6,4 ± 1,8 a 6,8 ± 0,7 a 6,8 ± 0,7 a 6,7 ± 0,9 a 7,1 ± 0,7 a 6,2 ± 0,7 a BCF 23,3 ± 4,9 b 27,9 ± 1,1 a 27,9 ± 1,1 a 28,7 ± 1,9 a 25,7 ± 3,2 ab 22,6 ± 3,1 ab STR 78,7 ± 4,9 a 75,4 ± 2,4 a 75,4 ± 2,4 a 78,6 ± 3,4 a 77,9 ± 4,3 a 78,5 ± 3,9 a LIN 50,3 v 7,2 a 44,2 ± 2,5 b 44,2 ± 2,5 b 45,7 ± 3,2 b 43,1 ± 3,9 b 44,3 ± 3,1 b Letras iguais na mesma linha não apresentam diferença estatística entre as médias (p > 0.05). A avaliação da cinética espermática de garanhões é de extrema importância, pelo fato de que as variáveis denotam a capacidade de progressão celular, com isso pode-se predizer a qualidade da amostra seminal e determinar o potencial de fertilidade dos espermatozoides (Arruda, 2000). As características de MTT e MP não variaram em relação ao mês de coleta, no entanto as variáveis VAP, VSL e VCL apresentaram variação entre o mês de setembro, que apresentou a menor velocidade para as três características. As características ALH e STR também não apresentaram variações entre os meses, enquanto as características BCF e LIN variaram entre os meses de coleta. Portanto, apresentaram valores próximos aos observados em outros estudos para essas variáveis (Nascimento, 2006; Silva, 2010). 4. Conclusão Como as características físicas e cinéticas do sêmen dos garanhões apresentaram poucas variações entre a idade dos animais entre os meses de coleta, sugere-se que os garanhões possam ser utilizados na reprodução durante o ano todo, sem que haja prejuízo na fertilidade dos garanhões. 8
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