PLATELIA CMV IgG 1 placa 96 72810 DETECÇÃO QUANTITATIVA DE ANTICORPOS IgG PARA CITOMEGALOVÍRUS EM SORO OU PLASMA HUMANO POR ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO 881140 2013/11 1. APLICAÇÃO O ensaio Platelia CMV IgG é um ensaio imunoenzimático ELISA indirecto para a detecção quantitativa de anticorpos IgG para citomegalovírus em soro ou plasma humano. 2. VALOR CLÍNICO O citomegalovírus (CMV) humano é um vírus que se encontra espalhado por todas as áreas geográficas do mundo e pode atingir qualquer grupo socioeconómico. O CMV pertence à família dos herpesvírus e transmite-se através dos fluidos biológicos durante contactos interpessoais muito próximos (urina, saliva, leite materno, sangue, lágrimas, esperma e secreções vaginais). Após ter ocorrido uma infecção, o CMV pode permanecer latente durante vários anos no corpo dos pacientes contaminados, podendo então reactivar-se e causar infecções recorrentes com transmissão potencial a outros indivíduos. A infecção primária é adquirida por diferentes formas de transmissão e em períodos diferentes da vida (infecções congénitas, infecções pós-natais). Após a fase de latência, a infecção secundária pode ocorrer através de uma nova infecção por um vírus exterior ou por reactivação do vírus latente. 50 a 85% da população é infectada antes de alcançar a idade adulta, mas a maioria das infecções permanece assintomática, com apenas 2% dos pacientes a apresentarem sintomas atípicos, como febre, astenia, dor muscular ou nas articulações. No entanto, a infecção provocada pelo CMV pode tornar-se grave quando afecta mulheres grávidas, recém-nascidos ou hospedeiros com problemas imunitários. Durante a gravidez, 1 a 3% das mulheres são infectadas com o CMV e a transmissão para o feto através da placenta observa-se em 40 a 50% das pacientes. 95% das infecções do feto não são sintomáticas, mas em 5% as complicações são extremamente graves: hepatosplenomegalia, microcefalia, hidrocefalia, prematuridade, retardamento psicomotor e morte do feto. Em 10% das infecções assintomáticas, os recém-nascidos apresentarão complicações retardadas como surdez ou cegueira parcial ou total. Em pacientes com problemas imunitários (com SIDA, receptores de transplantes de órgãos, com doenças linfoproliferativas ou cancro), as complicações graves relacionam-se com uma infecção disseminada e/ou visceral: esplenomegalia, coriorretinite, hepatite, pneumonia, miocardite, encefalite. Nestes pacientes, a infecção pode ser fatal. Algumas semanas após a infecção pelo CMV, a resposta imunitária conduz ao aparecimento de anticorpos IgM específicos, ao que se segue, alguns dias depois, o aparecimento de anticorpos IgG específicos. O diagnóstico serológico de infecção pelo CMV fica demonstrado através de uma seroconversão ou um aumento significativo da titulação de anticorpos IgG. A detecção de anticorpos IgG anti-cmv específicos é útil para o diagnóstico de uma infecção primária e para determinar o estado imunitário dos pacientes. 3. PRINCÍPIO O ensaio Platelia CMV IgG é um teste quantitativo para a detecção de anticorpos IgG para a citomegalovírus em soro ou plasma humano utilizando um método imunoenzimático ELISA indirecto. Os antigénios inactivos da CMV são utilizados para revestir a microplaca. Um anticorpo policlonal marcado com peroxidase, o qual é específico para cadeias gama humanas (anti-igg), é utilizado como conjugado. O teste utiliza as seguintes etapas: 1
Etapa 1 As amostras dos pacientes e calibradores são diluídos 1/21 e depois distribuídos pelos poços da microplaca. Durante esta incubação de uma hora a 37 C, os anticorpos IgG para a CMV presentes na amostra unem-se ao antigénio CMV revestido nos poços da microplaca. Após a incubação, os anticorpos não específicos e outras proteínas séricas não ligadas são removidos por lavagem. Etapa 2 O conjugado (anticorpo policlonal marcado com peroxidase específico para cadeias gama humanas) é adicionado aos poços da microplaca. Durante esta incubação de uma hora a 37 C, o anticorpo monoclonal marcado une-se ao soro IgG capturado pelo antigénio CMV. O conjugado não ligado é removido por lavagens no fim da incubação. Etapa 3 A presença de imunocomplexos (antigénio CMV, anticorpos IgG para CMV, conjugado anti-igg) é demonstrada pela adição em cada poço de uma solução de desenvolvimento enzimática. Etapa 4 Após a incubação a temperatura ambiente (entre +18 C e +30 C), a reacção enzimática é parada pela adição de uma solução 1N de ácido sulfúrico. A leitura da densidade óptica obtida com um espectrofotómetro a 450/620 nm é proporcional à quantidade de anticorpos IgG para a CMV presente na amostra. 4. INFORMAÇÃO DO PRODUTO As quantidades fornecidas de reagentes foram calculadas para permitir 96 testes. Todos os reagentes são exclusivamente para utilização em diagnóstico in vitro. Etiquetagem Natureza dos reagentes Apresentação R1 Microplate Microplaca (pronta para utilização) 12 tiras com 8 poços quebráveis, revestidos com antigénio CMV inactivo R2 Concentrated Washing Solution (20x) Solução de lavagem concentrada (20x) Tampão TRIS-NaCl (ph 7,4), 2% Tween 20 Conservante: 0,04% ProClin 300 R3 Calibrator 0 Calibrador 0 Soro humano negativo para anticorpos IgG para CMV e negativo para antigénio HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti-hcv Conservante: 0,15% ProClin 300 R4a Calibrator 0.4 Calibrador 0.4 UA/mL Soro humano reactivo para anticorpos IgG para CMV e negativo para antigénio HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti-hcv Conservante: 0,15% ProClin 300 R4b Calibrator 1 Calibrador 1 UA/mL Soro humano reactivo para anticorpos IgG para CMV e negativo para antigénio HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti-hcv Conservante: 0,15% ProClin 300 R4c Calibrator 4 Calibrador 4 UA/mL Soro humano reactivo para anticorpos IgG para CMV e negativo para antigénio HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti-hcv Conservante: 0,15% ProClin 300 1 1 x 70 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 2
R4d Calibrator 10 Calibrador 10 UA/mL Soro humano reactivo para anticorpos IgG para CMV e negativo para antigénio HBs, anti-hiv1, anti- HIV2 e anti-hcv Conservante: 0,15% ProClin 300 R6 Conjugate (51x) Conjugado (51x) Anticorpo policlonal de cabra para cadeias gama humanas conjugado com peroxidase de rábano Conservante: 0,16% ProClin 300 R7 Diluent Diluente para amostras e conjugados (prontos para utilização) Tris-NaCl (ph 7,7), albumina bovina, glicerol, 0,1% Tween 20 e fenol vermelho Conservante: 0,15% ProClin 300 R9 Chromogen TMB Cromogénio (pronto para utilização) 3,3,5,5 tetrametilbenzidina (< 0,1%), H 2 O 2 (<1%) R10 Stopping Solution Solução de paragem (pronta para utilização) Solução de ácido sulfúrico 1N 1 x 0,75 ml 1 x 0,7 ml 1 x 80 ml 1 x 28 ml 1 x 28 ml Consulte as indicações da caixa para obter informações sobre as condições de armazenamento e data de validade. 5. ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES A fiabilidade dos resultados depende da implementação correcta das boas práticas de laboratório indicadas a seguir: Não utilize reagentes cujo prazo de validade tenha expirado. Não misture nem associe dentro de um dado ensaio analítico reagentes provenientes de diferentes lotes. OBSERVAÇÃO: Para a solução de lavagem (R2, identificação da etiqueta: 20x cor verde), Cromogénio (R9, identificação da etiqueta: TMB cor turquesa) e solução de paragem (R10, identificação da etiqueta: 1N cor vermelha), é possível utilizar outros lotes para além dos incluídos no kit, desde que estes reagentes sejam estritamente equivalentes e o mesmo lote seja utilizado dentro do mesmo ensaio analítico de teste. OBSERVAÇÃO: Para além disso, a solução de lavagem (R2, identificação do rótulo : cor verde 20x) pode ser misturada com as outras 2 soluções de lavagem incluídas nos kits de reagentes Bio-Rad (R2, identificações dos rótulo: cor azul 10x ou cor laranja 10x) quando adequadamente reconstituídas, desde que apenas uma mistura seja utilizada num determinado ensaio. Antes da utilização, espere 30 minutos para que os reagentes atinjam a temperatura ambiente (+18 C a +30 C). Proceda cuidadosamente à reconstituição ou diluição dos reagentes evitando possíveis contaminações. Não realize o teste na presença de vapores reactivos (vapores ácidos, alcalinos ou aldeídicos) ou poeira que possa alterar a actividade enzimática do conjugado. Utilize material de vidro bem lavado e enxaguado com água desionizada ou, de preferência, material descartável. A lavagem da microplaca é um passo crucial no procedimento: siga o número recomendado de ciclos de lavagem e certifique-se de que os poços enchem completamente sendo, em seguida, completamente esvaziados. As lavagens incorrectas podem levar a resultados imprecisos. Não deixe a microplaca secar entre o fim da operação de lavagem e a distribuição dos reagentes. Nunca utilize o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução de desenvolvimento. A reacção enzimática é muito sensível à presença do metal ou de iões metálicos. Consequentemente, não permita que nenhum elemento metálico entre em contacto com as várias soluções que contenham o conjugado ou o cromogénio. 3
A solução de cromogénio (R9) deve ser incolor. A presença de uma cor azul indica que o reagente não pode ser utilizado, devendo este ser substituído. Utilize uma nova ponta de pipeta para cada amostra. Verifique as pipetas e outros equipamentos para o funcionamento preciso e correcto. Instruções relativas à saúde e segurança O material de origem humana utilizado na preparação dos reagentes foi testado e considerado não reactivo para o antigénio de superfície da hepatite B (HBs Ag), anticorpos para o vírus da hepatite C (anti-hcv) e para os vírus da imunodeficiência humana (anti-hiv1 e anti-hiv2). Porque nenhum método pode garantir em absoluto a ausência de agentes infecciosos, manuseie os reagentes de origem humana e as amostras de pacientes como possíveis transmissores de doenças infecciosas. Qualquer material, incluindo soluções de lavagem, que entre em contacto directo com amostras ou reagentes contendo materiais de origem humana deve ser considerado como possível transmissor de doenças infecciosas. Utilize luvas descartáveis ao manusear as amostras e os reagentes. Não pipete com a boca. Evite derrames de amostras ou de soluções que contenham amostras. Os derrames devem ser lavados com lixívia diluída a 10%. No caso de derrame de um ácido, este deve ser primeiro neutralizado com bicarbonato de sódio e depois lavado com lixívia diluída a 10% e seco com papel absorvente. O material utilizado na limpeza deve ser eliminado num recipiente de resíduos contaminados. As amostras dos pacientes, os reagentes contendo material de origem humana, assim como os materiais e produtos contaminados devem ser eliminados após descontaminação apenas: - por imersão em lixívia a uma concentração final de 5% de hipoclorito de sódio durante 30 minutos; - ou por autoclavagem a 121 C durante 2 horas no mínimo. ATENÇÃO: Não introduza soluções contendo hipoclorito de sódio na autoclave Evite qualquer contacto dos reagentes, mesmo dos considerados não perigosos, com a pele e as mucosas. Os resíduos químicos e biológicos devem ser manuseados e eliminados de acordo com as boas práticas de laboratório. Todos os reagentes incluídos no kit são exclusivamente para utilização em diagnóstico in vitro. Para obter recomendações relativas a perigos e precauções relacionadas com alguns componentes químicos neste kit de teste, consulte as ilustrações indicadas nos rótulos e as informações fornecidas no final das instruções de utilização. A Ficha de Dados de Segurança encontra-se disponível em www.bio-rad.com. 6. RECOLHA DO ESPÉCIME, PREPARAÇÃO E ARMAZENAMENTO 1. O soro e o plasma (EDTA, heparina ou citrato) são os tipos de amostra recomendados. 2. Observe as seguintes recomendações para o manuseamento, processamento e armazenamento das amostras de sangue: Recolha todas as amostras de sangue com precaução de rotina durante a venipunctura. No soro, permita que as amostras coagulem completamente antes da centrifugação. Mantenha sempre os tubos fechados. Após a centrifugação, separe o soro ou plasma do coágulo ou glóbulos vermelhos num tubo de armazenamento bem fechado. Os espécimes podem ser armazenados entre 2 C e 8 C se o teste for realizado dentro de 7 dias. Se o teste não for concluído ou enviado para transporte dentro de 7 dias, congele as amostras a pelo menos -20 C. Não utilize amostras que tenham sido descongeladas mais do que cinco vezes. Os espécimes previamente congelados devem ser eficazmente homogeneizados (vórtice) após descongelação, antes de serem testados. 4
3. As amostras contendo 90 g/l de albumina ou 100 mg/l de bilirrubina não conjugada, as amostras lipémicas contendo o equivalente a 36 g/l de trioleína (triglicerídeo) e as amostras hemolisadas contendo até 10 g/l de hemoglobina não afectam os resultados. 4. As amostras não devem ser aquecidas. 7. PROCEDIMENTO DO ENSAIO 7.1 Materiais necessários não fornecidos Agitador de vórtice. Leitor de microplacas equipado com filtros de 450 nm e 620 nm (*). Incubadora de microplaca termostaticamente definida para 37±1 C (*). Lavador de microplacas automático, semi-automático ou manual (*). Água destilada ou desionizada esterilizada. Luvas descartáveis. Viseira ou óculos de protecção. Papel absorvente. Pipetas ou multipipetas automáticas ou semi-automáticas, ajustáveis ou predefinidas para medir e distribuir 10 µl a 1000 µl e 1 ml, 2 ml e 10 ml. Provetas graduadas com capacidade de 25 ml, 50 ml, 100 ml e 1000 ml. Hipoclorito de sódio (lixívia) e bicarbonato de sódio. Recipiente para resíduos de risco biológico. Tubos descartáveis. (*) Consulte o nosso departamento técnico para obter informações detalhadas relativamente ao equipamento recomendado. 7.2 Reconstituição dos reagentes R1: Mantenha os reagentes durante 30 minutos a temperatura ambiente (entre +18 C e +30 C) antes de abrir o saco. Retire o tabuleiro de transporte, devolva imediatamente as tiras não utilizadas no saco e verifique a presença de dissecante. Torne a selar cuidadosamente o saco e armazene-o a uma temperatura entre +2 C e 8 C. R2: Dilua 1/20 de solução de lavagem R2 em água destilada: por exemplo 50 ml de R2 e 950 ml de água destilada para obter a solução de lavagem pronta para utilização. Se lavar manualmente, prepare 350 ml de solução de lavagem diluída para uma placa de 12 tiras. R3, R4a, R4b, R4c, R4d: Dilua 1/21 em diluente (R7) (exemplo: 15 µl de R3 + 300 µl de R7). R6+R7: O conjugado (R6) encontra-se concentrado a 51x e deve ser homogeneizado antes de ser utilizado. Dilua 1/51 em diluente (R7). Para uma placa, dilua 0,5 ml de conjugado (R6) em 25 ml de diluente (R7). Divida estes volumes por 10 para obter o volume necessário para uma tira. 7.3 Armazenamento e validade dos reagentes abertos e/ou reconstituídos O kit deve ser armazenado a uma temperatura entre +2 C e +8 C. Quando o kit é armazenado entre +2 C e +8 C antes de ser aberto, cada componente pode ser utilizado até à data de validade indicada na etiqueta externa do kit. R1: Uma vez aberto o kit, as tiras permanecem estáveis durante 8 semanas se forem armazenadas entre +2 C e +8 C no mesmo saco cuidadosamente fechado (verifique a presença de dissecante). R2: Uma vez diluída, a solução de lavagem pode ser guardada durante 2 semanas a uma temperatura entre +2 C e +30 C. A solução de lavagem concentrada armazenada a uma temperatura entre +2 C e +30 C, na ausência de contaminação, é estável até à data de validade indicada na etiqueta. 5
R3, R4a, R4b, R4c, R4d, R6, R7: Uma vez abertos e sem qualquer contaminação, os reagentes armazenados a uma temperatura entre +2 C e +8 C são estáveis durante 8 semanas. R6+R7: Uma vez diluída, a solução de acção conjugada é estável durante 8 horas a temperatura ambiente (entre +18 C e +30 C) ou durante 24 horas a uma temperatura entre +2 C e +8 C. R9: Uma vez aberto e sem qualquer contaminação, o reagente armazenado a uma temperatura entre +2 C e +8 C é estável durante 8 semanas. R10: Uma vez aberto e sem qualquer contaminação, o reagente armazenado a uma temperatura entre +2 C e +8 C é estável até à data de validade indicada na etiqueta. 7.4 Procedimento Siga rigorosamente o procedimento de ensaio e as boas práticas de laboratório. Antes da utilização, dê tempo suficiente para que os reagentes atinjam a temperatura ambiente (entre +18 C e +30 C). O uso de poços quebráveis requer uma atenção especial durante o respectivo manuseamento. Utilize os controlos negativo, de corte e positivo em cada ensaio analítico para validar os resultados do ensaio. 1. Estabeleça cuidadosamente o plano de distribuição e identificação para os calibradores e amostras dos pacientes. 2. Prepare a solução de lavagem diluída (R2) [consulte a secção 7.2]. 3. Retire o tabuleiro de transporte e as tiras (R1) dos respectivos invólucros [consulte a secção 7.2]. 4. Dilua os calibradores R3, R4a, R4b, R4c, R4d e as amostras dos pacientes (S1, S2 ) em diluente (R7) para obter uma diluição 1/21: 15 µl de amostra e 300 µl de diluente (R7) [consulte a secção 7.2]. Agite as amostras diluídas no vórtice. 5. Seguindo rigorosamente a sequência indicada abaixo, distribua 200µl de calibradores e amostras de pacientes diluídas em cada poço: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A R3 S5 S13 B R4 S6 C R4 S7 D R5 S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 6. Cubra a microplaca com um selante de placa adesivo e prima firmemente a placa para assegurar uma selagem perfeita. Incube imediatamente a microplaca num banho de água controlado por termóstato ou numa incubadora seca durante 1 hora 5 minutos a 37 C 1 C. 7. No fim da primeira incubação, prepare a solução de acção conjugada (R6+R7) [consulte a secção 7.2]. 8. No final da primeira incubação, remova o selante de placa adesivo. Aspire o conteúdo de todos os poços para um recipiente de resíduos de risco biológico (contendo hipoclorito de sódio). Lave a microplaca 4 vezes com 350 µl de solução de lavagem (R2). Inverta a microplaca e passe cuidadosamente o papel absorvente para remover o líquido restante. 9. Distribua imediatamente 200 µl de solução de acção conjugada (R6+R7) em todos os poços. A solução deve ser agitada suavemente antes de ser utilizada. 10. Cubra a microplaca com um selante de placa adesivo e prima firmemente a placa para assegurar uma selagem perfeita. Incube imediatamente a microplaca num banho de água controlado por termóstato ou numa incubadora seca durante 1 hora 5 minutes a 37 C 1 C. 11. No final da segunda incubação, remova o selante de placa adesivo. Aspire o conteúdo de todos os poços para um recipiente de resíduos de risco biológico (contendo hipoclorito de sódio). Lave a microplaca 4 vezes com 350 µl de solução de lavagem (R2). Inverta a microplaca e passe cuidadosamente o papel absorvente para remover o líquido restante. 6
12. Num local escuro, distribua rapidamente em cada poço 200 µl de solução de cromogénio (R9). Deixe a reacção ocorrer no escuro, durante 30 minutos ± 5 minutos a uma temperatura ambiente (entre +18 C e +30 C). Não utilize selante de placa adesivo durante esta incubação. 13. Pare a reacção enzimática adicionando 100 µl de solução de paragem (R10) em cada poço. Utilize a mesma sequência e proporção de distribuição da solução de desenvolvimento. 14. Seque cuidadosamente o fundo da placa. Leia a densidade óptica a 450/620 nm, utilizando um leitor de placa, nos 30 minutos após ter parado a reacção. As tiras devem sempre ser guardadas longe da luz antes da leitura. 15. Antes de relatar os resultados, verifique a consonância entre a leitura e o plano de distribuição da placa e amostras. 8 CÁLCULO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 8.1 Construção da curva padrão Não existe qualquer preparação padrão a nível internacional para medição de anticorpos IgG anti- CMV. O ensaio Platelia CMV IgG está padronizado relativamente à Preparação Padrão Internacional Proposta pela OMS em 1995. A presença e concentração de anticorpos IgG para o CMV numa amostra serão determinadas por comparação de densidade óptica (DO) dessa amostra relativamente à concentração em unidades arbitrárias por milímetro (UA/ml) dos calibradores da curva padrão. Desenhe a curva padrão [DO = função (UA/ml)] colocando as leituras de DO dos calibradores R3, R4a, R4b, R4c e R4d no eixo vertical (Y) e, em seguida, as respectivas concentrações em UA/ml no eixo horizontal (X). Para cada amostra testada, calcule a titulação de anticorpos IgG anti-cmv determinando, a partir da curva padrão desenhada, a concentração correspondente à DO medida. 8.2 Controlo de qualidade Inclua todos os calibradores para cada microplaca e para cada ensaio analítico e analise os resultados obtidos. Para a validação do ensaio, devem ser reunidos os seguintes critérios: Valores da densidade óptica: DO R4a 0,150 DO R4b 0,300 DO R4d > DO R4c Razões da densidade óptica: DO R4a / DO R3 3,50 DO R4b / DO R4a 1,50 DO R4c / DO R4b 1,50 Se estes critérios de controlo de qualidade não forem reunidos, deve repetir-se o ensaio analítico do teste. 7
8.3 Interpretação dos resultados Titulação de anticorpos anti-cmv (Unidades Arbitrárias/ml) Titulação < 0,25 UA/ml Resultado Negativo 0,25 UA/ml Titulação < 0,5 UA/ml Ambíguo Titulação 0,5 UA/ml Positivo Interpretação Um resultado negativo ou ambíguo indica a ausência de imunidade adquirida, mas não pode excluir uma infecção recente. Se houver suspeitas de contaminação de um paciente, deverá ser analisada uma segunda amostra cerca de duas semanas depois. Um resultado positivo é, geralmente, indicador de uma infecção passada. No entanto, não poderá ser excluída a hipótese de infecção recente, em especial se estiverem presentes anticorpos IgM anti- CMV. Se existirem suspeitas de infecção recente, podem ser úteis outros testes serológicos, como a medição da avidez de anticorpos IgG, para confirmar o diagnóstico. Acima de concentrações de 4 UA/ml, pode observar-se uma maior variação de titulações. As amostras que revelam concentrações acima do calibrador mais alto da curva padrão podem ser diluídas em Diluente R7 para se obter um resultado que esteja dentro do intervalo de linearidade do ensaio. Nesse caso, a concentração final obtém-se multiplicando o resultado medido pela taxa de diluição. 8.4 Guia de detecção e resolução de problemas As reacções não validadas ou impossíveis de repetir são frequentemente causadas por: Lavagens inadequadas da microplaca. Contaminação de amostras negativas com soro ou plasma com uma grande dose de anticorpos. Contaminação da solução de desenvolvimento com agentes oxidantes químicos (lixívia, iões metálicos...). Contaminação da solução de paragem. 9 DESEMPENHOS Foram avaliados os desempenhos do Platelia CMV IgG em 2 locais num total de 1096 amostras de mulheres grávidas e dadores de sangue. 9.1 Prevalência A prevalência de anticorpos IgG anti-cmv utilizando o Platelia CMV IgG foi calculada num painel de 300 amostras de mulheres grávidas da região de Paris (França). 145 amostras revelaram um resultado positivo para os anticorpos IgG anti-cmv. A prevalência, medida através do ensaio Platelia IgG CMV, foi estabelecida a 48,3% (145/300). 9.2 Especificidade Foi calculada a especificidade num painel de 490 amostras provenientes de 2 locais de França e divididas da seguinte forma: 61 soros de dadores de sangue 429 soros de mulheres grávidas 8
Os resultados foram comparados com os obtidos utilizando um ensaio EIA comercializado e considerado como referência. População testada / local Local 1 Número de soros Negativo Ambíguo Positivo Especificidade Grávidas 81 81 0 0 Dadores de sangue 61 61 0 0 Local 2 Grávidas 348 348 0 0 Total 490 490 0 0 [IC 95%] = intervalo de confiança de 95%. 100,0% (81/81) [96,3%-100,0%] 100,0% (61/61) [95,2%-100,0%] 100,0% (348/348) [99,1%-100,0%] 100,0% (490/490) [99,4%-100,0%] 9.3 Sensibilidade Foi calculada a sensibilidade num painel de 606 amostras provenientes de 2 locais de França e divididas da seguinte forma: 136 soros de dadores de sangue 470 soros de mulheres grávidas Os resultados foram comparados com os obtidos utilizando um ensaio EIA comercializado e considerado como referência. População testada / local Local 1 Número de soros Negativo Ambíguo * Positivo Sensibilidade Grávidas 123 0 2 121 Dadores de sangue 136 3 1 132 Local 2 Grávidas 347 0 4 343 Total 606 3 7 596 * Para cálculo da sensibilidade, os resultados ambíguos foram considerados como negativos. [IC 95%] = intervalo de confiança de 95%. 98,4% (121/123) [94,2%-99,8%] 97,1% (132/136) [92,6%-99,2%] 98,8% (343/347) [97,1%-99,7%] 98,4% (596/606) [97,0%-99,2%] 9.4 Reactividade cruzada Para detecção de anticorpos IgG anti-cmv, foi testado com o ensaio Platelia CMV IgG e um ensaio EIA comercializado um painel de 103 amostras, incluindo 77 amostras positivas à toxoplasmose, rubéola, EBV, HSV, VZV, papeira, sarampo e VIH e 26 amostras positivas ao factor reumatóide, autoanticorpos e anticorpos heterófilos. De entre estas amostras, 37 eram negativas e concordantes com o kit de EIA usado como comparação, confirmando-se assim a ausência de potenciais reacções cruzadas. 9.5 Precisão Precisão dentro do ensaio analítico (repetibilidade): De forma a avaliar a repetibilidade intra-ensaio, foram testadas uma amostra negativa e três amostras positivas 30 vezes durante a mesma ensaio analítico. Foi determinada a concentração (UA/ml) para cada amostra positiva. Os resultados para a amostra negativa foram expressos como uma razão. A razão e a média de concentrações, o desvio padrão (DP) e o coeficiente de variação (% CV) para cada um dos quatro espécimes são apresentados no quadro seguinte: 9
Precisão dentro do ensaio analítico (repetibilidade) N=30 negativa Razão (DO Spl. / DO R4a) positiva baixa positiva Concentração (UA/ml) positiva alta Média 0,11 1,87 3,53 4,78 DP 0,01 0,10 0,18 0,30 %CV 6,6 % 5,1 % 5,1 % 6,3 % Precisão entre ensaio analíticos (reproducibilidade): De forma a avaliar a reproducibilidade inter-ensaio, cada um dos quatro espécimes (uma amostra negativa e três positivas) foi testado em duplicado em duas ensaio analíticos por dia durante um período de 20 dias. Foi determinada a concentração (UA/ml) para cada amostra positiva. Os resultados para a amostra negativa foram expressos como uma razão. A razão e a média de concentrações, o desvio padrão (DP) e o coeficiente de variação (% CV) para cada um dos quatro espécimes são apresentados no quadro seguinte: Precisão entre ensaio analíticos (reproducibilidade) N=80 negativa Razão (DO Spl. / DO R4a) positiva baixa positiva Concentração (UA/ml) positiva alta Média 0,10 1,44 3,10 4,22 DP 0,02 0,19 0,40 0,76 %CV 16,0 % 13,4 % 13,0 % 18,0 % 9.6 Linearidade O intervalo de linearidade do ensaio Platelia CMV IgG foi definido entre 0 e 4 UA/ml após terem sido efectuados estudos de diluição em 5 espécimes positivos. 10 LIMITAÇÕES DO PROCEDIMENTO O diagnóstico da infecção citomegalovírus só pode ser estabelecido com base numa combinação de dados clínicos e biológicos. O resultado de um único teste de detecção de anticorpos IgG anti-cmv não constitui uma prova suficiente para o diagnóstico da infecção por citomegalovírus. 11 CONTROLO DE QUALIDADE DO FABRICANTE Todos os reagentes fabricados são preparados de acordo com o nosso sistema de qualidade, desde a recepção da matéria-prima até à comercialização do produto final. Cada lote é submetido a testes de controlo de qualidade e só é introduzido no mercado quando estiver em conformidade com os critérios de aceitação predefinidos. Os registos de produção e de controlo de cada lote são mantidos no seio da Bio-Rad. 10
12 REFERÊNCIAS 1. Alford C.A., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J. 1990. Congenital and perinatal cytomegalovirus infection. Rev. Infect. Dis. 12: S745-S753. 2. Demmler G.J. 1991. Summary of a workshop on surveillance for congenital cytomegalovirus disease. Rev. Infect. Dis. 13: 315-329. 3. Fowler K.B., Stagno S., Pass R.F., Britt W.J., Boll T.J., Alford C.A. 1990. The outcome of congenital and cytomegalovirus in relation to maternal antibody status. N. Engl. J. Med. 326: 663-667. 4. Gaytant M.A., Rours I.G., Steegers E.A., Galama J.M., Semmekrot B.A. 2003. Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the literature. Europ. J. Pediatr. 162: 248-253. 5. Grangeot-Keros L., Mayaux M.J., Lebon P., and al. 1997. Value of cytomegalovirus (CMV) IgG avidity index for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. J. Infect. Dis. 175: 944-946. 6. Lazzarotto T., Guerra B., Spezzacatena P., Varani S., Gabrielli L., Pradelli P., Rumpianesi F., Banzi C., Bovicelli L., Landini M.P. 1998. Prenatal diagnosis of congenital cytomegalovirus infection. J. Clin. Microbiol. 36: 3540-3544. 7. Macé M., Sissoef L., Rudent A., Grangeot-Keros L. 2004. A serological testing algorithm for the diagnosis of primary CMV infection in pregnant women. Prenat. Diagn. 28: 861-863. 8. Munro S.C., Hall B., Whybin L.R., Leader L., Robertson P., Maine G.T., Rawlinson W.D. 2005. Diagnosis of and screening for cytomegalovirus infection in pregnant women. J. Clin. Microbiol. 43: 4713-4718. 9. Revello M.L., Gerna G. 2002. Diagnosis and management of human cytomegalovirus infection in the mother, fetus and newborn infant. Clin. Microbiol. Rev. 15: 680-715. 10 Stagno S., Pass R.F., Dworsky M.E., and al. 1982. Congenital cytomegalovirus infection: the relative importance of primary and recurrent maternal infections. N. Engl. J. Med. 306: 945-949. 11
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