PLATELIA TM EBV-VCA IgG testes

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1 PLATELIA TM EBV-VCA IgG testes TESTE IMUNOENZIMÁTICO PARA A DETERMINAÇÃO QUALITATIVA DOS ANTICORPOS IgG CONTRA O VÍRUS DE EPSTEIN-BARR (VIRAL CAPSID ANTIGEN) NO SORO HUMANO

2 1 - CAMPO DE APLICAÇÃO Este dispositivo de doseamento imunológico destina-se à determinação qualitativa dos anticorpos IgG contra o Antigénio da Cápside do Vírus de Epstein-Barr (EBV-VCA) no soro humano. O teste Platelia TM EBV-VCA IgG pode ser usado em conjunto com outros testes serológicos para o vírus de Epstein- Barr (Platelia TM EBV-VCA IgM, Platelia TM EBV-EA-D IgG e Platelia TM EB-NA-1 IgG), como auxiliares no diagnóstico da mononucleose infecciosa. 2 - SIGNIFICADO CLÍNICO A detecção do vírus de Epstein-Barr foi inicialmente descrita em 1964 por Epstein, Achong e Barr usando estudos de microscopia electrónica de linfoblastos de cultura obtidos em doentes com linfoma de Burkitt. Com base na sua morfologia característica, o EBV é classificado como um membro da família dos herpesvírus. A infecção por EBV pode apresentar uma vasta gama de sintomas clínicos. Na sua maioria, as infecções primárias por EBV são transmitidas através da saliva, ocorrem durante a infância, e são sub-clínicas. Nos Estados Unidos, 50% da população possui anticorpos contra o EBV antes de atingir os 5 anos de idade; 80% na idade adulta. Também são conhecidas infecções por EBV associadas a transfusões. Em jovens adultos, a infecção por EBV pode manifestar-se clinicamente como Mononucleose Infecciosa (MI), com sintomas relativamente atípicos de faringite febril, amigdalite, linfadenopatia, mal-estar, cefaleias, mialgias, hepatomegália e esplenomegália, erupções cutâneas e leucocitose. Os estudantes de colégios e os militares são frequentemente referidos como uma população com elevada incidência de morbilidade devido a MI. Após a infecção primária por EBV, está postulado que o linfócito B pode continuar a albergar o genoma do EBV e estabelecer uma infecção latente que pode prolongar-se por toda a vida. Foi documentada a reactivação da infecção por EBV ou a potenciação da activação do EBV em doentes com imunodeficiência ou imunodeprimidos, por ex. doentes submetidos ao transplante de um órgão, indivíduos com doenças malignas, mulheres grávidas e pessoas de idade avançada. A controvérsia persiste no que se refere à implicação definitiva do EBV como agente etiológico num quadro clínico denominado infecção crónica por EBV ou mononucleose crónica. O vírus de Epstein-Barr encontra-se também associado à patogénese de dois carcinomas humanos, o linfoma de Burkitt e o carcinoma nasofaríngeo. A 88

3 documentação referente a estudos de hibridização do DNA, confirma a presença do genoma do EBV nas biópsias recolhidas de indivíduos com estes carcinomas. O linfoma de Burkitt é sobretudo observado na África Sub-Sariana, especialmente em crianças Africanas e da Nova Guiné. São frequentemente diagnosticadas infecções por malária em doentes com linfoma de Burkitt, sugerindo que esta possa ser um co-factor. O carcinoma nasofaríngeo é observado na Ásia, mais frequentemente no Sul da China e pode ter influências genéticas ou ambientais como co-factores. Linfomas das células B similares ao linfoma Africano de Burkitt foram recentemente referidos em doentes com a Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA). É sugerido que os doentes com SIDA podem apresentar uma predisposição para infecções/reactivações do EBV devido ao seu estado de imunosupressão. O teste dos anticorpos heterófilos é actualmente o método mais largamente utilizado no diagnóstico da MI. No entanto, mais de 20% dos doentes com infecção primária por EBV não apresentam uma reacção positiva no teste dos anticorpos heterófilos. Foram também referidos falsos resultados positivos em cerca de 7% dos testes, quando são utilizados os testes rápidos em placa para anticorpos heterófilos disponíveis no mercado; estes resultam principalmente de erros na técnica devido a uma referência subjectiva de aglutinação dos eritrócitos. 3 - PRINCÍPIO DO MÉTODO Os testes imunoenzimáticos (ELISA) baseiam-se na capacidade que os materiais biológicos (i.e., os antigénios) apresentam para serem adsorvidos pelas superfícies plásticas, como é o caso do poliestireno (fase sólida). O dispositivo Platelia TM EBV-VCA IgG utiliza a tecnologia ELISA, na qual a afinidade do antigénio VCA purificado permite a sua ligação às microcúpulas da microplaca. Quando os antigénios ligados à fase sólida são colocados em contacto com o soro do doente, o anticorpo específico do antigénio, se presente, irá ligar-se ao antigénio da fase sólida formando complexos antigénio-anticorpo. O excesso de anticorpos é removido por lavagem. Segue-se a adição de IgG de cabra anti-humana conjugada com peroxidase de rábano, a qual se liga aos complexos antigénio-anticorpo. O excesso de conjugado é removido por lavagem, seguindo-se a adição do Substrato, tetrametilbenzidina (TMB). Se o soro do doente contiver anticorpos específicos contra o antigénio, desenvolve-se uma cor azul. Quando se 89

4 interrompe a reacção enzimática com H 2 SO 4 1N, o conteúdo das microcúpulas torna-se amarelo. A cor, a qual é proporcional à concentração dos anticorpos no soro, pode ser lida num espectrofotómetro adequado ou no leitor de placas de microcúpulas ELISA. O dispositivo Platelia TM EBV-VCA IgG é principalmente composto pelo antigénio da cápside do vírus (VCA) para detecção de anticorpos IgG específicos para a infecção pelo EBV. Os anticorpos são detectáveis na ausência de anticorpos heterófilos. Aumentando logo no início da doença, os níveis máximos de IgG EBV-VCA são atingidos ao fim de 3-4 semanas, em seguida começam a diminuir e persistem em valores baixos durante toda a vida. A sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade do método ELISA são comparáveis às de outros testes serológicos para anticorpos, tais como imunofluorescência, fixação do complemento, hemaglutinação e radioimunoensaios. 4 - COMPONENTES DO DISPOSITIVO Todos os reagentes são exclusivamente para uso diagnóstico in vitro. Rótulo Natureza dos reagentes Apresen tação R1 Microplate Microplaca: 12 tiras (8 microcúpulas cada) revestidas com o antigénio da cápside do vírus EBV purificado (inactivado), acondicionado numa bolsa com exsicante / indicador da humidade. 1 R2 R3 R4a Concentrated Washing Solution (20x) Non reactive control Positive Control I Solução de lavagem concentrada (20x): Tampão Tris (ph 7,2 ± 0,2) com Tween 20 a 1%.Conservantes: ProClin 300 (0,1%) Controlo não reactivo (humano) para anticorpos IgG anti-ebv-vca. Negativo para o HBs Ag e para os anticorpos contra HIV-1, HIV-2 e HCV; Conservantes: azida de sódio (< 0,1%) e penicilina/estreptomicina (0,01%) Controlo positivo I (humano) para anticorpos IgG anti-ebv-vca. Negativo para o HBs Ag e para os anticorpos contra HIV-1, HIV-2 e HCV; Conservantes: azida de sódio (< 0,1%) e penicilina/estreptomicina (0,01%) 1 x 50 ml 1 x 0,4 ml 1 x 0,4 ml 90

5 Rótulo Natureza dos reagentes Apresen tação R4b Positive Controlo positivo II (humano) para anticorpos IgG 1 x 0,4 ml Control II anti-ebv-vca. Negativo para o HBs Ag e para os anticorpos contra HIV-1, HIV-2 e HCV; Conservantes: azida de sódio (< 0,1%) e penicilina/estreptomicina (0,01%) R5 Calibrator Calibrador (humano) para anticorpos IgG anti-ebv- VCA, com o factor específico do dispositivo impresso na cartonagem exterior. Negativo para o HBs Ag e para os anticorpos contra HIV-1, HIV-2 e HCV; Conservantes: azida de sódio (< 0,1%) e penicilina/estreptomicina (0,01%) 1 x 0,4 ml R6 Conjugate Conjugado: anticorpos de cabra contra a IgG humana conjugados com peroxidase de rábano. Conservantes: ProClin 300 (0,1%) e gentamicina R7 Diluent I Diluente I: tampão pronto a usar (ph 7,5 ± 0,2) Conservantes: ProClin 300 (0,1%) R9 R10 Chromogen TMB Stopping Solution Solução Substrato/Cromogénio (pronta a usar): Tetrametilbenzidina (TMB). O reagente deve manter-se fechado quando não está a ser usado; caso contrário, pode formar-se um precipitado nas microcúpulas de reacção. 5 - ADVERTÊNCIAS E PRECAUÇÕES 1 x 16 ml 1 x 30 ml 1 x 15 ml Solução de paragem (pronta a usar): Ácido 1 x 15 ml Sulfúrico 1N Folha de registo dos resultados 1 Precauções A confiança dos resultados depende da correcta implementação das seguintes Boas Práticas de Laboratório: Não usar reagentes fora do prazo de validade Não misturar reagentes de diferentes lotes no mesmo ensaio. NOTA: É possível o uso de outros lotes além dos que se encontram no dispositivo, desde que se use o mesmo lote em todo o ensaio: solução de lavagem (R2), solução Substrato / Cromogénio (R9) e solução de paragem (R10). 91

6 Estes reagentes podem ser usados com Platelia TM EBV-VCA IgM, Platelia TM EBV-EA-D IgG e Platelia TM EB-NA-1 IgG do nosso catálogo. O Diluente I (R7) pode ser usado com Platelia TM EBV-EA-D IgG e Platelia TM EB-NA-1 IgG. Contacte os nossos serviços técnicos para informações mais detalhadas. Antes de usar, é necessário esperar 30 minutos para que os reagentes estabilizem à temperatura ambiente. Reconstituir cuidadosamente os reagentes evitando qualquer contaminação. Não realizar o teste na presença de vapores reactivos (vapores de ácidos, de bases e de aldeídos) ou de pó, que possam alterar a actividade enzimática do conjugado. Utilizar material de vidro cuidadosamente lavado e enxaguado com água desionizada ou, preferencialmente, material de utilização única. Evitar que as microplacas sequem entre o final da operação de lavagem e a distribuição do reagente. A reacção enzimática é muito sensível a iões metálicos. Assim, evite qualquer contacto dos vários conjugados ou da solução substrato com elementos metálicos. A solução Substrato / Cromogénio deve ser incolor. O aparecimento de uma coloração indica que o reagente não pode ser usado e deve ser substituído. Use uma nova ponta de pipeta para cada amostra. A lavagem da microplaca é um passo crítico no processo: respeitar o número de ciclos de lavagem recomendado e assegurar-se de que todas as microcúpulas são completamente cheias e depois completamente esvaziadas. Uma lavagem incorrecta pode originar resultados incorrectos. Nunca usar o mesmo recipiente para distribuir o conjugado e a solução de desenvolvimento. Verificar as pipetas e outro equipamento para operações correctas e exactas. Não alterar o método de ensaio. INSTRUÇÕES DE SAÚDE E SEGURANÇA Todos os reagentes fornecidos destinam-se a uso diagnóstico in vitro. Usar luvas descartáveis quando manusear reagentes. Não pipetar com a boca. 92

7 Os materiais de origem humana usados na preparação dos reagentes foram testados e mostraram ser não reactivos para o antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg), para os anticorpos contra a hepatite C (HCV) e para os vírus da imunodeficiência adquirida (anti-hiv1 e anti- HIV2). Porque nenhum método pode garantir de forma absoluta a ausência de agentes infecciosos, deve manusear os reagentes de origem humana e as amostras dos doentes tendo em consideração que são passíveis de transmitir doenças infecciosas. Considerar como material infeccioso qualquer material directamente em contacto com as amostras e reagentes de origem humana, assim como as soluções de lavagem. Evitar derramar amostras ou soluções contendo amostras. O material derramado deve ser lavado com lixívia diluída a 10%. Se o líquido de contaminação é um ácido, o material derramado deve ser previamente neutralizado com bicarbonato de sódio, depois limpo com lixívia e seco com papel absorvente. O material usado na limpeza deve ser colocado num recipiente para resíduos contaminados. Amostras, reagentes de origem humana, assim como material contami - nado e produtos devem ser eliminados somente após descontaminação. - quer por imersão em lixívia na concentração final de 5% de hipoclorito de sódio durante 30 minutos. - quer por autoclavagem a 121ºC durante, no mínimo, 2 horas. A autoclavagem durante, pelo menos, uma hora a 121ºC é o melhor método para inactivação dos vírus HIV e do vírus HB. PRECAUÇÃO: NÃO INTRODUZIR SOLUÇÕES CONTENDO HIPOCLORITO DE SÓDIO NA AUTOCLAVE. As substâncias químicas devem ser manuseadas e rejeitadas de acordo com as Boas Práticas de Laboratório. Evitar qualquer contacto do tampão substrato, do cromogénio e da solução de lavagem com a pele ou mucosas (risco de toxicidade, irritação ou queimadura). Encontra-se disponível uma ficha de segurança que será entregue a pedido. 93

8 Atenção: Alguns reagentes contêm ProClin 300 < 1,5% Xi - Irritante R43: Pode causar sensibilização em contacto com a pele S28-37: Após contacto com a pele, lavar imediata e abundantemente água e sabão. Usar luvas adequadas. 6 - MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO Misturador Vortex. Leitor de microplacas equipado com filtros de 450 nm (*). Recipiente para lixo potencialmente contaminado. Hipoclorito de sódio (lixívia) e bicarbonato de sódio. Água destilada ou desionizada. Buretas. Luvas de látex descartáveis. Óculos de protecção ou óculos de segurança. Papel absorvente. Pipetas automáticas ou semi-automáticas, ajustáveis ou pré-ajustadas ou multipipetas para medir e fornecer 10, 100 ou µl. Equipamento para lavagem manual, semi-automática ou automática de microplacas (*). Tubos de ensaio de utilização única. (*) Para informações mais detalhadas consulte-nos acerca do equipamento recomendado pelo nosso departamento técnico. 7 - RECONSTITUIÇÃO E CONDIÇÕES DE CONSERVAÇÃO DOS REAGENTES O dispositivo deverá ser conservado entre +2-8ºC até à data de validade referida na embalagem (excepto em caso de instruções específicas). Antes de usar, deixar que os reagentes atinjam a temperatura ambiente (+21-25ºC). Colocar todos os reagentes no frigorífico imediatamente após a sua utilização. 1) Reagentes prontos a usar: Reagente 1 (R1): microplaca Cada tabuleiro contendo 12 tiras encontra-se numa bolsa de folha de alumínio fechada. Cortar a bolsa com uma tesoura ou um bisturi, 0,5 1 cm acima da linha de fecho. 94

9 Voltar a colocar imediatamente no saco as tiras que não foram utilizadas. Fechar novamente o saco e voltar a colocar a +2-8ºC. Após a abertura, as tiras são estáveis durante um mês. Reagente 3 (R3): controlo não reactivo Reagente 4a (R4a): controlo positivo I Reagente 4b (R4b): controlo positivo II Reagente 5 (R5): calibrador Reagente 6 (R6): conjugado Reagente 7 (R7): diluente I Reagente 9 (R9): Solução Substrato / Cromogénio Reagente 10 (R10): solução de paragem 2) Reagentes que requerem reconstituição Reagente 2 (R2): solução de lavagem concentrada 20x Diluir 50 ml da solução de lavagem 20x com água destilada e/ou desionizada para obter 1,0 l de uma solução pronta a ser usada. Misturar bem. Após diluição, conservar a +2-8ºC durante 5 dias. 8 - COLHEITA E PREPARAÇÃO DA AMOSTRA Recolher a amostra de sangue de acordo com as práticas actuais. O teste será realizado com amostras não diluídas. Separar o soro do coágulo ou dos eritrócitos logo que possível, de forma a evitar qualquer hemólise. Uma hemólise extensa pode afectar o desempenho do teste. As amostras com agregados devem ser sujeitas a centrifugação antes de serem testadas. Partículas ou agregados de fibrina em suspensão podem originar falsos resultados positivos. As amostras podem ser conservadas a +2-8ºC se a pesquisa for realizada no espaço de 5 dias, ou, podem ser congeladas a -20ºC durante vários meses. Evitar ciclos repetidos de congelação/descongelação. Se as amostras forem transportadas, devem ser acondicionadas de acordo com os regulamentos em vigor no que se refere ao transporte de agentes biológicos. NÃO USAR SORO CONTAMINADO, HIPERLIPÉMICO, HIPERHEMOLISADO ICTÉRICO OU INACTIVADO PELO CALOR. 9 - MÉTODO Seguir exactamente o método proposto. Usar o calibrador e os controlos para cada série de determinações, de forma a validar os resultados do teste. 95

10 Cumprir com as seguintes Boas Práticas de Laboratório: 1. Estabelecer cuidadosamente a distribuição das amostras e o plano de identificação. 2. Preparar a solução de lavagem diluída (R2) (consultar a secção 7). 3. Retirar o tabuleiro de transporte e as tiras (R1) da bolsa de protecção. Colocar o número desejado de tiras revestidas com o antigénio no suporte das microcúpulas. Usar 1 microcúpula para o branco do reagente, 3 microcúpulas para o Calibrador, 1 microcúpula para cada Controlo: Negativo, Positivo I e Positivo II. A B C D E F G H 1 B1 R3 R4a R4b R5 R5 R5 S1 2 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S Todas as amostras, controlos e calibrador deverão ser agitados no Vortex antes de usados. Diluir as amostras a testar, o Calibrador, os Controlos Negativo e Positivo de 1:21 (por ex. 10 µl µl) com Diluente I (R7) da amostra nos tubos de diluição ou na placa de diluição. 5. Pipete 100 µl de cada Calibrador diluído, Controlo ou amostra do doente para cada microcúpula. Pipete 100 µl de Diluente I (R7) da amostra para a primeira microcúpula para o branco do reagente. 6. Incubar a microplaca durante 20 minutos ± 2 minutos à temperatura ambiente (21-25ºC). 7. Aspirar os conteúdos de todas as microcúpulas para o recipiente dos lixos potencialmente contaminados (contendo hipoclorito de sódio). Adicionar imediatamente em cada microcúpula, um mínimo de 300 µl de solução de lavagem. Aspirar novamente. Repetir esta operação pelo menos 4 vezes (no total um mínimo de 5 lavagens). 96

11 Se necessário, secar a placa colocando-a de forma invertida em papel absorvente. Se usar uma lavagem automática, seguir o mesmo processo. 8. Distribuir 100 µl do Conjugado (R6) pronto a usar em todas as microcúpulas. 9. Incubar durante 20 minutos ± 2 minutos à temperatura ambiente (21-25ºC). 10. Esvaziar todas as microcúpulas por aspiração e lavar 5 vezes como anteriormente descrito. 11. Colocar rapidamente 100 µl de solução Substrato/Cromogénio (R9) em cada microcúpula. 12. Permitir o desenvolvimento da reacção no escuro durante 10 minutos ± 2 minutos à temperatura ambiente (21-25ºC). Não usar película adesiva durante este período de incubação. A solução Substrato/Cromogénio ficará azul nas microcúpulas contendo teores detectáveis de anticorpos IgG. 13. Adicionar 100 µl da Solução de Paragem (R10) a cada microcúpula. Misturar batendo suavemente na placa. A adição da Solução de Paragem (R10) irá dar origem a uma alteração na cor, de azul para amarelo. 14. Esperar pelo menos 5 minutos e ler. Limpar cuidadosamente a parte de baixo da placa. Usando um comprimento de onda de 450 nm, ler o branco e depois medir a densidade óptica de cada microcúpula. A placa deve ser lida no espaço de 30 minutos após a adição da solução de paragem (as tiras devem ser mantidas ao abrigo da luz antes da sua leitura). 15. Verificar todos os resultados para concordância entre a leitura, a placa, a distribuição das amostras e o plano de identificação. 10- CÁLCULOS E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS 1) Cálculo da absorvância média 1. D.O. (Densidade Óptica) média de Cut-off do Calibrador Calcular o valor da D.O. média de Cut-off do Calibrador usando três determinações do Calibrador (R5). Se qualquer dos três valores do calibrador diferir mais de 15% em relação à média, rejeitar o valor e calcular a média usando apenas os dois valores restantes. 2. Factor de Correcção Para reflectir as flutuações do dia-a-dia nas etapas do teste devido à temperatura ambiente e aos tempos; é determinado um Factor de Correcção para cada lote de dispositivos. O Factor de Correcção é impresso no frasco do Calibrador. 97

12 3. Valor de Cut-off do Calibrador O valor de Cut-off do Calibrador para cada teste é determinado através da multiplicação do Factor de Correcção pela D.O. média de Cut-off do Calibrador, determinada no ponto Valor do ISR Calcular o Immune Status Ratio para cada colheita por divisão do valor da D.O. da colheita pelo Valor de Cut-off do Calibrador determinado no ponto 3. Exemplo : D.Os. obtidas para o Calibrador (R5) = 0,380-0,400-0,420 D.O. média para o Calibrador (R5) = 0,400 Factor de correcção = 0,5 Valor de Cut-off do Calibrador = 0,5 x 0,400 = 0,5 x 0,400 = 0,200 D.O. obtida para o soro do doente = 0,600 Valor do ISR = 0,600/0,200 = 3,00 2) Validação do teste 1. Branco do Reagente (quando lido em relação ao branco de ar) deve ser < 0,150 a 450 nm : DO (RB) < 0, Controlo negativo (R3) deve ser 0,250 a 450 nm (quando lido contra o branco do reagente): DO (R3) 0, Cada Calibrador (R5) deve ser 0,250 a 450 nm (quando lido contra o branco do reagente: DO (R5) 0, Controlo positivo (R4b) deve ser 0,500 a 450 nm (quando lido contra o branco do reagente): DO (R4b) 0, Os valores do ISR (Immune Status Ratio) para os controlos negativo, positivo I e positivo II (R3, R4a, R4b) devem estar dentro dos seus respectivos intervalos impressos nos frascos. Se estes critérios não se encontrarem dentro dos respectivos intervalos, o teste deverá ser considerado inválido e deverá ser repetido. 98

13 3) Interpretação dos resultados Os valores do ISR dos doentes (Immune Status Ratio) são interpretados da seguinte forma: Valor do ISR Resultados Interpretação 0.90 Negativo Não é significativo o número de anticorpos IgG EBV- VCA detectáveis. Presume-se que estes indivíduos não estão infectados com EBV mas são susceptíveis a uma infecção primária Duvidoso As amostras devem ser novamente analisadas 1.10 Positivo Nível significativo de anticorpos IgG EBV-VCA detectáveis. Indicativo de infecção actual ou recente. Os indivíduos podem estar em risco de transmitir a infecção por EBV, mas não estão necessariamente actualmente em fase de contágio. 1. Recomenda-se a seguinte forma para comunicação dos resultados obtidos: Estes resultados foram obtidos com o teste Platelia TM EBV-VCA IgG. Os valores obtidos com diferentes métodos podem não ser comparáveis. A magnitude do valor obtido para a IgG não pode ser correlacionada com um título final. 2. São usados quatro anticorpos EBV distintos para proporcionar um quadro resumido da infecção pelo EBV; estes são a IgM EBV-VCA, a IgG EBV- VCA, a IgG EBV-EA e a IgG EB-NA. A interpretação exacta da infecção pelo EBV baseia-se nos resultados para todos estes anticorpos e, para efeitos de diagnóstico, não deve basear-se apenas no resultado de um único teste. 3. As amostras cujos resultados se mantêm duvidosos após repetição do teste, devem ser testadas usando um método alternativo, por ex., imunofluores - cência (IFA). Se os resultados continuarem duvidosos, deve ser colhida uma nova amostra. 4. As características do comportamento funcional para este produto foram estabelecidas usando um calibrador. Caso deseje para o teste uma curva dose-resposta linear, o cliente deverá estabelecer, no mínimo, dois calibradores adicionais. 99

14 5. Para avaliar amostras emparelhadas de soros em relação a uma alteração significativa no título dos anticorpos, ambas as amostras devem ser analisadas em duplicado no mesmo teste. O ISR médio de ambas (nas fases aguda e convalescente) deve ser superior a 1,00 para avaliar as amostras emparelhadas de soros em relação a um aumento significativo do título em anticorpos. 4) Prevalência Aproximadamente % da população adulta nos EU é seropositiva para a IgG EBV-VCA. Os seus títulos podem variar dependendo do método de ensaio utilizado. Os anticorpos para a IgG EBV desenvolvem-se na fase inicial da MI, atingindo-se valores máximos ao fim de 3-4 semanas após o seu início. Em seguida, o título diminuirá gradualmente até ser atingido o título que se irá manter durante toda a vida. Podem observar-se títulos elevados de anticorpos contra o EBV em doentes com carcinoma nasofaríngeo, linfoma de Burkitt, doença de Hodgkin, sarcoidose e lúpus eritematoso sistémico. 5) Limitações da sua utilização 1. Processos ou práticas que não as descritas no folheto informativo podem originar resultados questionáveis. A não repetibilidade das reacções é frequentemente causada por: - Lavagem inadequada da microplaca, - Passos de incubação com tempos incorrectos, - Contaminação das amostras negativas por soro ou plasma com um elevado título de anticorpos, - Contaminação da solução de desenvolvimento por agentes oxidantes (lixívia, iões metálicos ), - Contaminação da solução de paragem. O uso de soro contaminado, ictérico, lipémico, hemolizado ou inactivado pelo calor pode originar resultados incorrectos e deverá ser evitado. As características do desempenho não foram estabelecidas para quaisquer matrizes além do soro. 2. O médico deve fazer a interpretação dos resultados deste teste, tendo em conta outras observações clínicas e métodos de diagnóstico. 100

15 Este dispositivo foi concebido para determinar os anticorpos IgG em amostras de doentes. Resultados positivos obtidos em recém-nascidos devem ser interpretados com precaução, dado que pode ocorrer uma transferência passiva da IgG da mãe para o feto antes do nascimento. As pesquisas de IgM são geralmente indicadores mais úteis em crianças com menos de 6 meses de idade. Os valores obtidos com este teste devem ser usados apenas como auxiliar do diagnóstico. Cada médico deve interpretar os resultados obtidos com base na história clínica do doente, dados físicos e outros métodos de diagnóstico. As características do seu desempenho não foram estabelecidas para doentes com carcinoma nasofaríngeo, linfoma de Burkitt, outras linfadenopatias associadas ao EBV e outras patologias associadas ao EBV para além da mononucleose relacionada com o EBV. Os resultados do teste Platelia EBV-VCA IgG obtidos com o soro de doentes imunodeprimidos devem ser cuidadosamente interpretados. As características do seu desempenho neste doseamento não foram estabelecidas para soros pediátricos. Um aumento significativo dos níveis de anticorpos é indicativo de uma estimulação antigénica recente. A ausência de um aumento significativo nos níveis de anticorpos não exclui a possibilidade de uma infecção pelo EBV. Amostras recolhidas numa fase muito precoce da infecção podem não apresentar valores detectáveis de IgG. Nestes casos, recomenda-se um doseamento das IgM, ou a colheita de uma segunda amostra de soro dias mais tarde, para ser analisada em paralelo com a amostra inicial, com vista a determinar a seroconversão, a qual é indicativa de uma infecção primária. A presença de anticorpos IgG EBV pode não assegurar protecção em relação à doença. O ISR de uma única determinação de anticorpos numa amostra não está relacionado com a gravidade dos sintomas clínicos da MI. 101

16 11- COMPORTAMENTO FUNCIONAL 1) Sensibilidade e Especificidade Relativas com Base na Caracterização do Soro Foram aleatoriamente testadas 205 amostras de duas populações diferentes, com Platelia TM EBV-VCA IgG e com um dispositivo de IFA disponível no mercado. A população em estudo era composta por soro obtido de dadores normais em ambulatório de uma grande Universidade da Califórnia e de um departamento de Saúde na região Este dos Estados Unidos. Os resultados obtidos encontram-se resumidos no quadro seguinte: Platelia TM EBV-VCA IgG Resultados Positivo Duvidoso Negativo 1º Teste IFA disponível no mercado Positivo Negativo Foi usado um segundo teste IFA para EBV-VCA IgG disponível no mercado, a fim de resolver 2 falsos resultados positivos obtidos com o primeiro teste de IFA disponível no mercado. Um resultado duvidoso obtido com o teste Platelia TM EBV-VCA IgG foi considerado indeterminado e este resultado (total 1) não foi incluído nos cálculos para a determinação da especificidade e sensibilidade relativas: Especificidade: 100 % (11 / 11) Sensibilidade: 100% (193 / 193) 2) Repetibilidade (Precisão Intra-Ensaio) O teste Platelia TM EBV-VCA IgG foi avaliado em relação à precisão através da análise de três soros (um negativo, um fraco positivo e um positivo), 10 vezes cada, na mesma placa. Os resultados encontram-se resumidos no Quadro seguinte. Soro n X D.P. CV % Negativo Fraco positivo Positivo X = Valor médio do ISR D.P. = Desvio Padrão C.V. = Coeficiente de Variação

17 3) Reprodutibildade (Precisão Inter-Ensaio) O teste Platelia TM EBV-VCA IgG foi avaliado em relação à precisão através da análise de três soros (um negativo, um fraco positivo e um positivo), dez vezes cada, em três dias diferentes. Os resultados encontram-se resumidos no Quadro seguinte. Soro n X D.P. CV % Negativo Fraco positivo Positivo O C.V. nas amostras positivas é inferior a 10% 4) Reactividade cruzada Foram testadas 8 amostras de soro para as quais foram obtidos resultados negativos com o teste Platelia TM EBV-VCA IgG. Amostra EBV ANA CMV VZV HSV 1 HSV 2 Platelia TM EBV-VCA IgG Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo 12- BIBLIOGRAFIA Veja a versão Inglesa. 103

18 12- BIBLIOGRAPHY 1. Epstein, M.A., B.B. Achong, and Y.M. Barr Virus Particles in Cultured Lymphoblasts from Burkitt's Lymphoma. Lancet. 1: Epstein, M.A., Y.M. Barr, and B.G. Achong Studies with Burkitt's Lymphoma. Wistar Inst. Sympos. Monogr. 4: Schooley, R.T. and R. Dolin Epstein-Barr Virus (Infectious Mononucleosis). In: Principles and Practice of Infectious Diseases, 2nd Edition. Mandell, G. L., R. G. Douglas, and J. E. Bennett. (eds). John Wiley and Sons, New York. pp Sumaya, C.V Serological Testing for Epstein-Barr Virus-Developments in Interpretations. J. Inf. Dis. 151 (6): Tobi, M., and S.E. Straus Chronic Epstein-Barr Virus Disease: A Workshop Held by the National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Ann. Intern. Med. 103 (6(pt.1)): Sumaya, C.V Infectious Mononucleosis and Other EBV Infections: Diagnostic Factors. Lab Mgmt. Oct., Birx, D.L., R.R. Redfield, and G. Tosarto Defective Regulation of Epstein-Barr Virus Infection in Patients with Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) or AIDS- Related Disorders. New Eng. J. Med. 314 (14): Ablashi, D.V., et. al Firsh International Symposium on Epstein-Barr Virus and Associated Malignant Diseases. Cancer Res. 45 (8): Chang, R.S., H. Thompson, and S. Pomerantz Epstein-Barr Virus Infections in Homosexual Men with Chronic, Persistent Generalized Lymphadenopathy. J. Inf. Dis. 151 (3): Bakerman, S Enzyme Immunoassays. Lab. Mgmt. August, pp Engvall, E. and P. Perlmann Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. III. Quantitation of Specific Antibodies by Enzyme-labeled Anti-Immunoglobulins in Antigen Coated Tubes. J. Immunol. 109: Engvall, E., and P. Perlman Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, (ELISA) Quantitative Assay of Immunoglobulin G. Immunochemistry. 8: Engvall, E., and P. Perlman Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA. Peeters. H., ed. Proteins of the Biological Fluids. Proceedings of the Nineteenth Colloquium, Brugge, Oxford. Pergamon Press. pp Engvall, E., K. Jonsson, and P. Perlman Enzyme-Linked Immunosorbent Assay. II. Quantitative Assay of Protein Antigen, Immunoglobulin-G, By Means of Enzyme- Labelled Antigen and Antibody-Coated tubes. Biochem. Biophys. Acta.,

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