SELEÇÃO DE PROBIÓTICOS PARA Rhamdia quelen Marina de Oliveira PEREIRA¹, Paulo Eduardo RUEDIGER², Hilton AMARAL-JÚNIOR³, Bruno Corrêa da SILVA³, Adolfo JATOBÁ 4. ¹Discente colaboradora, ²Bolsista 168/2014 PIBIC/CNPq, ³Pesquisador EPAGRI, 4 Orientador IFC-Campus Araquari Introdução A aquicultura é uma atividade econômica multidisciplinar em ascensão no mundo, devido ao crescimento vertiginoso da população, ao passo que a produção de peixes oriundos da pesca está se tornando insuficiente (Fao, 2014). Com isso, torna-se necessário o investimento em pesquisas de novas espécies de interesse produtivo, visando à melhoria da qualidade do produto e aumento da sua oferta. O jundiá (Rhamdia quelen) vem se destacando entre as espécies nativas brasileiras, por possuir alta produtividade, e grande resistência a variações de temperatura e salinidade. Além disso, tem grande aceitação no mercado consumidor devido a sua carne saborosa e com poucos espinhos. Porém, pode ser acometido por várias doenças causadas por organismos oportunistas, os quais afetam sua eficiência produtiva, rentabilidade e até altos índices de mortalidade (Costa, 2003). Para o controle de enfermidades, os produtores frequentemente empregam antibióticos, porém, seu uso inadequado propicia a resistência de cepas bacterianas (Verschuere et al., 2000), desencadeando problemas maiores, tanto ao meio ambiente quanto à própria produção. No entanto, a melhor maneira de se prevenir doenças nesta atividade é através do conhecimento do ambiente em que estes animais vivem, empregando novas estratégias. Um método muito estudado atualmente é o uso de probiótico, o qual vários trabalhos comprovam sua ação profilática ao organismo dos peixes, como produção de compostos antibacterianos, (Fuller, 1989), melhoria no sistema hemato-imunológico (Jatobá et al, 2008, 2011) e aumenta produção de enzimas digestivas (Bogatyrenko et al., 2010). O objetivo desse trabalho foi isolar bactérias ácido-láticas no trato intestinal de jundiás (R. quelen), avaliar a capacidade inibitória das cepas isoladas contra bactérias patogênicas (Pseudomonas aeroginosa, Enterococcus durans, Micrococcus luteos e Aeromonas hydrophyla) in vitro, assim como a produção de proteases, lipases e amilases.
Material e Métodos O trabalho foi realizado no laboratório de Aquicultura (LAQ) do IFCatarinense Câmpus Araquari. Para isolar as bactérias ácido-láticas foram utilizados 30 juvenis saudáveis de jundiá, anestesiados em Eugenol (1%) e eutanasiados por meio da secção da medula espinhal, para coleta de amostras dos intestinos. As amostras foram maceradas com solução salina estéril 0,65% de NaCl (SSE), diluídas serialmente (fator 1:10) e semeadas em Petri com meio de cultura Agar Mann Rogosa Sharpe (MRS) modificado por Ramirez et al. (2006). As placas semeadas foram incubadas por 48h em estufa a 35 o C. Após a incubação, as colônias foram identificadas morfologicamente pelo método de coloração de Gram. As de interesse (cocos e bacilos Gram positivos) semeadas em novo meio de cultura Agar MRS para isolamento por esgotamento em placa. A avaliação da inibição in vitro seguiu-se o protocolo estabelecido por Jatobá et al. (2008), as bactérias ácido-láticas isoladas foram avaliadas através da capacidade inibitória contra Enterococcus durans, Micrococcus luteus e Aeromonas hidrophila. Para acidificação do meio de cultura, as cepas selecionadas foram semeadas em tubos contendo o meio MRS, e foi realizada uma mensuração do ph antes e após as bactérias isoladas serem incubadas na estufa a 35º por 48 horas. Para avaliação das bactérias ácido-láticas quanto à produção de proteases, lipases e amilases e atividade hemolítica, foi realizada a triagem de cepas produtoras de amilase, os cocos e bacilos Gram positivos selecionados foram semeados em meio Starch Ágar e incubadas a 32 C durante 48 h. As placas de cultura foram então banhadas com solução de Lugol 1% de iodo (corante específico para amido). Para produção extracelular de protease, as cepas isoladas foram semeadas em meio Skin Milk Agar, e incubadas a 32 C durante 15 h. O aparecimento de uma clara zona em torno da colônia após incubação indicava a presença de atividade proteolítica. Similarmente, a produção de lipase foi evidenciada semeando as cepas em meio específico meio Spirit Blue Agar por 12 h a 30 C e observando se ocorreu surgimento de uma zona clara ao redor das colônias formadas (adaptado de Diringer et al., 2010), e para a avaliação da capacidade hemolítica, as cepas isoladas foram semeadas no
meio Ágar Sangue e incubadas a 35ºC por 24 horas, onde observou-se o surgimento de uma zona amarelada evidenciando a ocorrência da hemólise. Para avaliação de meios de cultura salgado, as cepas selecionadas foram semeadas no meio de cultura MRS Ágar com 3% de sal, e após o crescimento na estufa à 35ºC por 48 horas, observou-se o crescimento das mesmas nesse meio. Resultados e discussão Para desenvolver um probiótico eficiente, é essencial que o micro-organismo utilizado venha do animal de interesse (Balcázar et al., 2006). Após os isolamentos foram selecionadas 17 cepas de bactérias ácido lácticas, selecionadas a partir do jundiá (R. quelen), nomeadas de P1 a P17. As cepas avaliadas apresentaram grande variância fenotípica observada por meio de coloração de GRAM, sendo observadas bactérias na forma de cocos, bacillus e bacilococos. A inibição in vitro contra bactérias patogênicas é uma estratégia largamente utilizada para seleção de bactérias probióticas (Jatobá et al., 2008; Vieira et al., 2013; Jatobá e Mouriño, 2015). Das 17 bactérias isoladas, duas apresentaram halo de inibição médio, contra as bactérias patogênicas, (Tabela 1) superior a 1,0 cm. Este resultado sugere que as bactérias isoladas inibem mais as bactérias avaliadas do que alguns antibióticos como eritromicina e oxitetraciclina (Jatobá et al., 2008; Vieira et al., 2013). O maior poder de acidificação foi observado na P5, P8 e P10, esta capacidade de acidificar o meio pode está relacionada com a produção de ácido-lático que é característico das bactérias deste gênero. Entretanto, não foi observada uma correlação da acidificação com a inibição in vitro. Tabela 1. Média do halo de inibição (cm) das bactérias ácido-lática isoladas contra bactérias patogênicas, e seu poder de acidificação do meio. Cepas P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 Enterococcus durans 0,8 1,0 0,7 0,7 0,8 1,3 1,2 0,9 1,1 1,2 1,1 1,4 1,5 0,0 1,2 1,7 1,2 Micrococcus luteus 0,0 0,9 1,1 1,0 1,1 0,9 0,0 0,0 0,0 0,0 1,1 0,0 1,0 1,3 0,0 0,0 0,0 Aeromonas hidrophila 0,0 1,0 0,9 0,0 1,0 1,4 1,2 1,2 1,1 0,0 0,0 0,0 1,5 0,0 0,0 0,0 0,0 Média dos halos 0,3 1,0 0,9 0,6 1,0 1,2 0,8 0,7 0,7 0,4 0,7 0,5 1,3 0,4 0,4 0,6 0,4 Redução do ph 0,4 2,0 1,8 1,4 2,9 1,9 0,9 2,3 1,3 2,3 1,6 1,7 2,0 1,9 1,8 1,8 0,1
A produção de enzimas digestivas possibilita as bactérias probióticas auxiliarem os processos digestivos, aumentando absorção dos nutrientes e consequentemente, melhorando a eficiência alimentar dos animais (Jatobá et al., 2011; Jatobá e Mouriño, 2015). A protease, lipase e amilase são enzimas importantes do processo digestivo dos peixes (Pretto et al., 2014), sendo o jundiá um peixe carnívoro a produção de protease extremamente importante, pois está auxiliara a digestão ácida das proteínas que ocorre no estômago. Como observado na tabela 2, das bactérias isoladas, sete apresentaram a capacidade de produzir as três enzimas, entretanto apenas seis (P4, P10, P14, P15, P16 e P17) poderia ser indicadas para possíveis ensaios in vivo, pois a P12 além de produzir as enzimas digestivas, faz hemólise (destruição dos glóbulos vermelhos, eritrócitos nos peixes) que impossibilita seu uso in vivo. Além da P12, todas as demais cepas com capacidade hemolítica foram descartas. Tabela 2. Análise da atividade enzimática e crescimento em ágar salgado (3% NaCl) das cepas isoladas. Cepas P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 P14 P15 P16 P17 Amilase + + + + + - - - - + - + + + + + + Protease + + - + + + - - - + + + - + + + + Lipase - - - + - - + + + + + + - + + + + Hemólise - - + - - + - - + - + + - - - - - *NaCl - + - + + + - - + - + + - - - + - *Crescimento em Ágar MRS com 3,0% de NaCl. O crescimento em meios com diferentes salinidades permite o uso destas bactérias em diferentes ambientes (marinho, estuário e dulcícola). As cepas P2, P4, P5, P6, P9, P11, P12 e P16 demonstraram este potencial (Tabela 2) se destacaram por apresentarem produção de amilase, protease, lipase e crescimento em ágar salgado, e não apresentar atividade hemolítica. Conclusão Das 17 cepas isoladas 12 apresentaram potencial probiótico, sendo as cinco hemolíticas descartadas. Sendo a P2, P5 ep13 as mais indicadas para posteriores ensaios in vivo. Referências BALCÁZAR, José Luis et al. The role of probiotics in aquaculture. Veterinary microbiology, v. 114, n. 3, p. 173-186, 2006. BOGATYRENKO, E. A.; BUZOLEVA, L. S.; CHI, Z. Potential probiotics of the Far Eastern trepang Apostychopus japonicus producing digestive enzymes. Microbiology, v. 79, n. 2, p. 173-177, 2010.
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