MARCELA IRIS GABBAY. Data da aprovação: Belém: 29/03/2012. Banca Examinadora

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ NÚCLEO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E DESENVOLVIMENTO RURAL EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECUÁRIA AMAZÔNIA ORIENTAL UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA PROGRAMA DE PÓS - GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL MARCELA IRIS GABBAY AVALIAÇÃO DA SUPLEMENTAÇÃO ALIMENTAR COM BACTÉRIA PROBIÓTICA NO CRESCIMENTO E SANIDADE DE Arapaima gigas EM SISTEMA DE RECIRCULAÇÃO DE ÁGUA. BELÉM 2012

2 MARCELA IRIS GABBAY AVALIAÇÃO DA SUPLEMENTAÇÃO ALIMENTAR COM BACTÉRIA PROBIÓTICA NO CRESCIMENTO E SANIDADE DE Arapaima gigas EM SISTEMA DE RECIRCULAÇÃO DE ÁGUA. Dissertação apresentado para obtenção do grau de mestre em Ciência Animal. Programa de Pós- Graduação em Ciência Animal, Núcleo de Ciências Agrárias e Desenvolvimento Rural, Universidade Federal do Pará. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Amazônia Oriental. Universidade Federal Rural da Amazônia. Área de concentração: Ecologia Aquática e Aquicultura. Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Yudi Fujimoto BELÉM 2012

3 MARCELA IRIS GABBAY AVALIAÇÃO DA SUPLEMENTAÇÃO ALIMENTAR COM BACTÉRIA PROBIÓTICA NO CRESCIMENTO E SANIDADE DE Arapaima gigas EM SISTEMA DE RECIRCULAÇÃO DE ÁGUA. Dissertação apresentado para obtenção do grau de mestre em Ciência Animal. Programa de Pós- Graduação em Ciência Animal, Núcleo de Ciências Agrárias e Desenvolvimento Rural, Universidade Federal do Pará. Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária- Amazônia Oriental. Universidade Federal Rural da Amazônia. Área de concentração: Ecologia Aquática e Aquicultura. Data da aprovação: Belém: 29/03/2012 Banca Examinadora Prof. Dr. Rodrigo Yudi Fuijimoto (Orientador) Embrapa, Tabuleiros Costeiros, Aracajú Prof. Dr. Raimundo Aderson Lobão de Souza Universidade Federal Rural de Amazônia (UFRA) Prof. Dr. Carlos Alberto Martins Cordeiro Universidade Federal do Pará (UFPA - Bragança)

4 AGRADECIMENTOS Ao professor Rodrigo Yudi Fujimoto, meu exemplo profissional, agradeço pela orientação, oportunidade, amizade, ensinamentos e confiança na execução deste projeto, assim como sua ajuda incansável na minha vida acadêmica. Aos colaboradores da UFSC, em especial ao professor Mauricio Laterça pela oportunidade da realização do treinamento no laboratório de camarões marinhos. E a paciência dos supervisores Adolfo Jatobá, Bruno Correa e José Mourino, pelas minhas inconstantes atrapalhadas de informações. Ao professor Carlos Cordeiro pelas apostilas, livros fornecidos e incentivos ao termino desse trabalho. E ao espaço cedido para o preparo do bolinho de pirarucu realizado pelos alunos Jhon Gomes e Alan Brito. Aos meus colegas de laboratório Higo Abe, Joel, Fabricio Ramos, Jhon Gomes,Josiane, Henrique Malta, Adjalbas Marinho, Adones,Valéria e Natalino pela ajuda nas intermináveis coletas microbiológicas, biometrias e incansáveis coletas sanguíneas. Em especial Joel e Mariane pela carinho para com meus alevinos de pirarucu. E aos voluntários Renan, Fabiano e Carolina Aviz. A minha família: em especial minha mãe/tia Eglantina Bastos, tio José Ribeiro, irmãos William e Robson pelo apoio, carinho, compreensão e por me incentivarem a continuar estudando e progredindo. Amo vocês! Ao meu fiel e confidente amigo/irmão Carlos Nedson pelo companheirismo, apoio, conselhos, sincera amizade, paciência nos melhores e piores momentos desta caminhada. As amigas Roberta e Ivonete pelas noites de diversão. Ao Sr. João Menandro Abdon Afair, proprietário da piscicultura canta Galo pela doação dos alevinos. A Capes pela concessão da bolsa A Universidade Federal do Pará campus de Bragança, em nome da professora Iracilda Sampaio pelos contatos fornecidos e ajuda no transporte dos alevinos. Aos vigilantes pelas companhias aos fins de semana e madrugadas. A todos aqueles que direta e indiretamente ajudaram na realização deste sonho.

5 RESUMO As bactérias acido lácticas tem se destacado por desempenhar efeitos benéficos ao hospedeiro, entre eles destacam-se a ativação no sistema imunológico, desempenho zootécnico e eficiência alimentar. O objetivo deste trabalho foi selecionar e a avaliar bactérias potencialmente probiótica no crescimento e sanidade de Arapaima gigas. A primeira etapa foi o isolamento e seleção de bactérias com potencial probiótico a partir de 10 juvenis de A. gigas sendo submetidas a testes in vitro de inibição de patógenos bacterianos conhecidos para aquicultura, e a segunda etapa consistiu em testes in vivo avaliando a colonização do trato intestinal pela cepa bacteriana e sua relação com a hematologia. A cepa com melhor halo de inibição foi identificada com o kit API50 CH como Lactobacillus paracasei (99.9%). Para avaliação in vivo, os animais foram alimentados durante 120 dias com dieta contendo somente leite estéril (T1), dieta controle sem bactéria (T2), dieta com 10 5 L. paracasei (T3) e dieta com 10 6 L. paracasei(t4). Após este período os peixes foram submetidos três tratamentos: injeção intraperitoneal com Aeromonas hydrophila, injeção de solução salina e peixes não injetados. Ao final de 24 horas de desafio foi observado elevada mortalidade dos peixes pertencentes ao grupo T3, T4 em relação ao T1. Os resultados nos permite concluir que a cepa utilizada nos testes in vivo não influenciou o desempenho zootécnico, além de ser ineficaz na proteção contra a infecção por Aeromonas. Palavras - chave: Probiótico. Patógenos. Lactobacillus paracasei.

6 ABSTRACT The lactic acid bacteria has become known for playing host to the beneficial effects, among them stand out from the activation of the immune system, animal performance and feed efficiency. The objective of this work was to select potentially probiotic bacteria and to assess the growth and health of Arapaima gigas. The first step was the isolation and selection of potential probiotic bacteria from 10 juvenile A. gigas being subjected to in vitro inhibition of bacterial pathogens known to aquaculture, and the second step consisted of evaluating the in vivo intestinal tract colonization by the bacterial strain and its relation to hematology. The best strain with inhibition zone was identified with the CH API50 kit as Lactobacillus paracasei (99.9%). For in vivo evaluation, the animals were fed for 120 days with a diet containing only sterile milk (T1), diet control without bacteria (T2), diet with 10 5 L. paracasei (T3) and diet with 10 6 L. paracasei (T4). After this period the fish underwent three treatments: intraperitoneal injection with Aeromonas hydrophila, injection of saline and noninjected fish. Within 24 hours of challenge high mortality was observed fish belonging to the group T3, T4, with respect to T1. The results allow us to conclude that the strain used in in vivo tests did not influence the growth performance, and be ineffective in protecting against infection by Aeromonas. Key words: Probiotic. Pathogens. Lactobacillus paracasei.

7 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO OBJETIVOS GERAL ESPECÍFICOS REVISÃO BIBLIOGRÁFICA CULTIVO DE PIRARUCU BACTÉRIAS ACIDO LÁCTICA ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO PARA PIRARUCU INTRODUÇÃO MATERIAIS E MÉTODOS RESULTADO E DISCUSSÃO CONCLUSÃO BIBLIOGRAFIA CITADA DESEMPENHO ZOOTÉCNICO DE Arapaima gigas SUPLEMENTADOS COM Lactobacillus paracasei E DESAFIADOS COM Aeromonas hydrophila INTRODUÇÃO MATERIAIS E MÉTODOS RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO BIBLIOGRAFIA CITADA CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS... 45

8 7 1 INTRODUÇÃO O pescado é uma importante fonte de nutrientes de alto valor biológico e baixos níveis calóricos que tem demandado crescimento do mercado mundial. Para suprir as exigências crescentes do mercado consumidor por proteína de alta qualidade tem sido estimulado o crescimento da Aquicultura. Esse crescimento tem intensificado os sistemas de criação, expondo continuamente os peixes a alterações na qualidade de água e á intensivas praticas de manejo - manuseio excessivo, transporte e adensamento (CHAGAS et al. 2009). Estas situações quando não monitoradas e controladas permitem a invasão de agentes patogênicos, devido à maior concentração de animais por unidade de espaço se comparado com o ambiente natural, devido ao desequilíbrio da tríade patógeno - hospedeiro - ambiente (TORANZO et al. 2004). A invasão de agentes patogênicos (bactérias, vírus, parasitas) são responsáveis por grandes perdas no sistema de criação intensiva, por se proliferarem de forma rápida (TORANZO et al. 2004). Com intuito de minimizar essas perdas são utilizados antibióticos, porém, o uso comumente desses produtos no controle de doenças tem provocado o desenvolvimento de bactérias resistentes e acúmulo de resíduos nos tecidos de peixes comercializados (MORIARTY, 1999; BALCAZAR et al. 2006). Alternativamente, a utilização de bactérias ácida láticas (BAL) como probiótico para melhorar as funções biológicas de vários organismos aquáticos tais quais peixes e camarões tem se mostrado como ferramenta promissora (SALINAS et al. 2005; BUGLIONE et al. 2008; WANG; LI; LIN, 2008). As BAL estão presentes no intestino da maioria dos animais desempenhando efeito sobre o sistema imunológico, que através de diferentes mecanismos enviam sinais que ativam para células epiteliais e células imunológicas alterando a composição da mucosa intestinal (PERDIGÓN; FULLER; RAYA, 2001). Embora, seja uma importante ferramenta o isolamento e identificação de BAL como probióticas de espécies nativas (especialmente na região amazônica) é incipiente. A falta de desenvolvimento tecnológico para espécies nativas, tanto de seu manejo nutricional, reprodutivo e sanitário; quanto os altos custos das rações são fatores identificados que atravancam também a Aquicultura na região Amazônica (FARIA, 2008). No entanto, esse quadro pode ser revertido, pois a região apresenta significativas vantagens, como grande diversidade de espécies aquícolas, temperatura elevada, disponibilidade hídrica e oferta de matérias - primas.

9 8 Dentre as principais espécies nativas utilizadas para a Aquicultura no norte do Brasil, existe uma alta aceitação no mercado, para o tambaqui (Colossoma macropomum), curimatá (Prochilodus nigricans), matrinxã (Brycon amazonicus) e o pirarucu (Arapaima gigas) (FARIA, 2008; OSTRENSKY; BOEGER; CHAMMAS, 2008; ULRICH, 1986). A aplicação de tecnologia apropriada de cultivo de pirarucu em ambientes controlados se apresenta como uma opção ecológica, econômica e socialmente viável (REBAZA; REBAZA; TABOADA, 2005). Embora importante esta espécie carece de informações devido a falta de conhecimento de aspectos nutricionais, da biologia reprodutiva, sanitária e da adaptabilidade em cativeiro. O presente estudo busca contribuir com novas informações tecnológicas para espécie nativa Arapaima gigas, no aspecto que melhorem o desempenho sanitário e desempenho zootécnico no cultivo através da utilização de bactérias ácido lácticas probióticas incorporadas na dieta alimentar.

10 9 2 OBJETIVOS 2.1 GERAL Avaliar bactérias com potencial probiótico sobre o aspecto sanitário de Arapaima gigas em sistema de recirculação de água 2.2 ESPECÍFICOS - Avaliar a sanidade dos pirarucus alimentados com probióticos pelas análises hematológicas e parasitológicas. - Avaliar o desempenho de pirarucus suplementados com o probiótico através de índices zootécnicos como ganho de peso, taxa de crescimento específico, conversão alimentar e fator de condição; - Avaliar a sobrevivência dos pirarucus após desafio com Aeromonas hydrophila. Esta dissertação foi dividida em dois artigos redigidos conforme normas das revistas. Os artigos serão submetidos a revista Acta amazônica.

11 10 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 CULTIVO DE PIRARUCU A espécie Arapaima gigas é amplamente distribuída na bacia Amazônica, compreendida desde a Guyana até o Peru. Sendo popularmente conhecida como pirarucu no Brasil e Paiche no Peru, é considerado o maior peixe de escamas de água doce do planeta. Há registros na literatura da captura de exemplares com dois a três metros de comprimento e mais de 200 quilos de peso total (ALFARO; BOCANEGRA; GARCIA, 1999). Entre as características peculiares que despertam o interesse no cultivo desta espécie temos: carne de coloração rósea e desprovida de espinhos, habilidade de respiração aérea suportando alta densidade, e adaptação em condições de cultivo podendo chegar até 10 kg no primeiro ano (ALFARO; BOCANEGRA; GARCIA, 1999; ONO; HALVERSON; KUBTIZA, 2004). Sua alimentação no ambiente natural caracteriza-se basicamente de pequenos peixes na proporção de 8 a 10 % de seu peso vivo quando jovem e 6% quando adulto. Tem preferência por Callictidae e Loricariidae (acari-bodó e os cascudos), no entanto, aceitam muito bem alimentação com tilápias e outros itens como moluscos e crustáceos (ALFARO; BOCANEGRA; GARCIA, 1999; IMBIRIBA, 2001; FILHO, 2003; BORGHETTI; SILVA, 2008). A criação comercial de pirarucu exige cuidado intensivo e só é viável com uso de ração, que dever ser de boa qualidade e alto valor proteico. No entanto, por ser carnívoro há necessidade de que os peixes sejam treinados. Cavero e Fonseca (2008) descrevem a estratégia do condicionamento alimentar para esta espécie sendo comumente praticado a de dietas iniciais a base de alimento vivo (zooplâncton e artêmias) e de transição gradual de ingredientes na ração (TGIR), usadas em peixes carnívoros para facilitar a aceitação de ração seca. Sendo recomendável usar o alimento vivo para peixes menores (até 10 cm de comprimento) e o TGIR para animais maiores (acima de 10 cm). Esses autores também recomendam o nível de proteína na ração, onde para recria (até 200g) considera que a ração utilizada deve possuir um nível mínimo de 40% de proteína bruta e deve ser ofertada a 7% da biomassa total do viveiro. Enquanto que para engorda (acima de 200g de peso e 35 cm comprimento) a ração deve conter 40% de proteína bruta com o nível mínimo em quantidade equivalente a 5% da biomassa total do tanque. O cultivo do pirarucu apresenta vantagens adicionais como não manifestar

12 11 canibalismo, ser resistente ao manuseio e apresentam excelente taxa de sobrevivência praticamente 100% (BARD; IMBIRIBA, 1986; IMBIRIBA 1991; PEREIRA- FILHO, 2003; ROUBACH, 2010). Os dados publicados em sua maioria descrevem a criação do pirarucu na forma extensiva utilizando peixes forrageiros como alimento (AGUILAR et al. 2007) e intensiva com ração extrusada. Tal qual, demonstrado por Pereira - Filho et al. (2003), no qual avaliou o desempenho do pirarucu em cultivo intensivo, utilizando 85 peixes com 133,3± 1,3g, estocados em dois viveiros de 120m 2 (com densidade 1 peixe/3m 2 ), obtendo após 12 meses de cultivo peso médio de 7,0± 1,1 Kg e comprimento total de 88,2±6,4 cm, mostrando o grande potencial desta espécie para piscicultura intensiva na Amazônia. Já o crescimento do pirarucu em tanques rede de pequeno volume (1m 3 ) na densidade 2 peixes/m 3, apresenta uma biomassa sustentável de até 29 kg. No entanto, sendo viável até período de juvenil (1kg de peso individual), pois acima desse período o crescimento pode ser comprometido tendo em vista que esta espécie cresce bastante em um curto espaço de tempo (CAVERO et al. 2003). O uso desta espécie em sistema de circulação de água é pouco relatado, a pesquisa mais recente foi realizada por Scorvo Filho et al. (2004), que demonstraram a criação de pirarucu em tanques de alvenaria de 186m 3 (com densidade de 0,96 peixes/m 3 ) em estufa e sistema fechado de circulação de água alimentados com ração extrusada, obtendo assim desempenho satisfatório em termos de crescimento em peso e em comprimento (Inicialmente 134,04±20,74 g de peso e 26,53±1,32 cm de comprimento, e ao final 7.917,20 kg± 963,55 g e 96,78±3,23 cm), conversão alimentar aparente (CA= 2,64) e sobrevivência (100%). Embora na literatura descreva o pirarucu como uma espécie resistente, diferentes tipos de parasitos foram identificados infectando-os, resultando em elevada mortalidade. Os parasitas são os maiores causadores de infecções em peixes cultivados, resultando em grandes perdas econômicas, uma vez que retardam o crescimento e ocasionam grandes mortalidades de peixes. Embora no Brasil, não se tenha uma estimativa dessas perdas é fato que se tenha a preocupação de avaliar o impacto dos parasitos em populações de peixes nativos (CAVERO; FONSECA, 2008; ARAÚJO et al. 2009; SCHALCH; DIAS; ONAKA, 2009). Para Araújo et al. (2009) todas as fases do desenvolvimento de pirarucu esta susceptível ao parasitismo, no entanto, o período de alevinagem é mais critico, uma vez que nessa fase de vida o sistema imune, em desenvolvimento, apresenta pouca capacidade de respostas as ações dos parasitas, normalmente presentes no ambiente aquático.

13 12 Este mesmo autor relata que durante o cultivo intensivo de alevinos de A. gigas (Estação de Piscicultura Experimental da Coordenação de Pesquisas em Aquacultura CPAC/INPA - Manaus) foi observado sinais de infecção nas brânquias e pele, sendo 19,7% por Dawestrema (Dactylogyridae), 23,5 % por bactérias e 1,0% por Trichodina (Protozoa). Resultando na mortalidade alevinos devido o excesso de matéria orgânica e/ou após transporte. Estudos recentes descrevem Dawestrema sp., Trichodina sp., Acantocephala, Branchiura (Argulus sp.) como parasitas mais freqüentes encontrados em juvenis de A. gigas (CAVERO; FONSECA, 2008). Capillostrongyloides arapaime sp.n foi descrito recentemente como uma nova espécie de nematóide isolado de cecos pilóricos (SANTOS; MORAVEC; VENTURIERE, 2008). Cavero et al. (2003), verificaram que pirarucus parasitados por Dawestrema sp apresentaram elevadas taxas de mortalidade principalmente quando ocorria grande adensamento de peixes. Araújo et al. (2009) estudando esta espécie concluíram que o parasitismo por Monogenoidae D. cycloancistroides e D. cicloancistrium, reduz os níveis plasmáticos de proteínas totais e cloreto, acompanhado de um aumento nos níveis de glicemia, hemoglobina, concentração de hemoglobina corpuscular (CHCM), números de leucócitos e linfócitos. Os elevados índices de parasitismo em alevinos de pirarucu tem resultado em mortalidades na região Amazônia. Estes índices quase sempre estão relacionado a ausência de manejo ictioparasitário nas pisciculturas e as praticas de manejo, sendo necessários tratamentos alternativos aos quimioterápicos para o combate de parasitas nesta espécie, para assim diminuir os prejuízos nas pisciculturas. Desta forma, o pirarucu torna-se candidato ao estudo que melhore os aspectos sanitários, de crescimento e sobrevivência dessa espécie frente a probióticos adicionados a dieta. 3.2 BACTÉRIAS ACIDO LÁCTICAS As bactérias ácido lácticas são um conjunto de bactérias gram positivas, não esporulada, em forma de cocos ou bastonetes, anaeróbias ou aerotolerantes, catalase negativa (RINGO; GATESOUPE,1999). Produzem o acido láctico como produto principal do metabolismo. São empregadas na indústria de alimentos, em produtos farmacêuticos e também como aditivos em ração animal, sendo que algumas espécies colonizam o intestino do homem e animais (SANDERS, 1993).

14 13 São comumente utilizadas em probióticos para animais terrestres, e alguns trabalhos relatam o seu uso em espécies aquáticas (AJITHA et al ;VIERA, 2006; JATOBÁ,2006; SOUZA,2007; FRANCO,2009; MOURINO,2010). Pertencem a este grupo os Lactobacillus spp., Streptococcus spp.,carnobacterium spp. e Leuconostoc spp., entre outros, podendo ser encontrados na microbiota intestinal de peixes saudáveis. Muitos estudos têm sido conduzidos com o intuito de mostrar o efeito positivo da utilização de probióticos na produção de peixes. Embora estas não sejam dominantes na microbiota intestinal de organismos aquáticos, várias tentativas têm sido relatadas no intuito de induzir uma dominância artificial destes microrganismos nestes animais (GATESOUPE, 1999). Assim Sugita et al. (2002) e Vine et al. (2004) sugerem que é essencial conhecer a origem bacteriana, sendo preferível o uso de cepas isoladas de animais saudáveis, por apresentarem maior segurança (não patogênica).elas devem ser capaz de expressar suas atividades benéficas no corpo do hospedeiro e sobreviver ao trato gastrointestinal (aos ácidos clorídrico e biliar e às enzimas pancreáticas) e ter boa adesividade às células do intestino, colonizando-o. Outro aspecto importante na seleção de cepas candidatas ao uso como probiótico são suas propriedade tecnológicas. Estas devem apresentar rápido crescimento in vitro, fácil manipulação, boas condições de produção industrial e sobreviver no produto final conservando suas funções (PANCHENIAK, 2005). Testes de antagonismos frente a patógenos também são utilizados para selecionar potenciais bactérias probióticas (VINE et al. 2004; VAZQUEZ et al. 2005). Os benefícios empregados aos probióticos adicionados a dieta são capacidade de inibir o crescimento de bactérias patogênicas através da competição de nutrientes e espaço da flora intestinal através da produção de compostos antimicrobianos/ bactericinas, como a nisina, a lactocidina, a diplococcina, a bulgaricina e a reuterina que possuem intensa atividade de inibição tanto sobre as bactérias gram positivas como as gram negativas. (FULLER, 1989; GATESSOUPE 1999; BRIZUELA; SERRANO; PERÉZ, 2001; PEREIRA, 2007). Estudos sobre o melhoramento imunológico de organismos aquáticos são descritos por Jatobá et al. (2008), obtendo no final de quatorze dias um maior número total de eritrócitos, trombócitos, leucócitos, linfócitos, neutrófilos e monócitos, em tilápia alimentadas com Lactobacillus plantarum submetidas à injeção de Enterococcus durans. Em outro estudo Piccietti et al. (2009) avaliaram o uso de Lactobaccilus delbruckii ssp. (suspensas em artêmia e rotíferos em uma concentração de 1,0 x 10 5 UFC/g -1 )

15 14 administrada a larvas e pós-larvas de Dicentrarchus labrax (robalo) sobre os efeitos no desenvolvimento e na diferenciação ao tecido linfóide associado ao intestino (GALT), constatou um maior aumento das células T e granulócitos na mucosa intestinal, comprovando que a alimentação precoce com dieta suplementada com o probiótico estimula o sistema imunológico das larvas de robalo. Robertson et al. (2000), avaliaram o uso de Carnobacterium sp. como probiótico em salmão do atlântico (Salmo salar L) e truta arco iris (Oncorhynchus mykiss), no qual foi suspensa no óleo de peixe na proporção de 5 x10 7 células/g -1 (inoculado na ração). Após 14 dias verificaram que a alimentação com probiótico permaneceu viável no trato gastrointestinal, sendo eficaz na redução quando submetido ao desafio com Aeromonas salmonicida, Vibri ordalii e Yersinia ruckeri. Além dos benefícios contra bactérias patogênicas, os estudos com probióticos tem demonstrado viabilidade no controle de parasitas metazoários, induzindo a ativação do sistema imunológico (OLIVEIRA; RIBEIRO; GOMES, 2008; GALLIANA et al. 2009). Galliana et al. (2009) avaliando o efeito dos probióticos elaborados com S. cereviseae, S. boulardii e B. cereus var. toyoi após infecção de larvas de Haemonchus contortus em ovinos, verificaram que S. cereviseae mostrou-se potencial para utilização no controle deste nematóide. Estudos sobre a utilização de probióticos no controle de parasitas intestinais (nematóides) em peixes ainda é desconhecido. Outros benefícios gerados pelos probióticos são relatados por Ghosh, Sinhá e Sahu (2007), no que observaram o efeito da suplementação do probiótico de Bacillus subtilis isolado de Cirrhinus mrigala na dieta nas concentrações (5 x 10 8 células g- 2, 5 x 10 7 células g- 2, 5 x 10 6 células g -1 e 5 x 10 5 células g -1 ) sobre o desempenho reprodutivo de quatro espécies de peixes ornamentais (Poecilia reticulata, Poecilia sphenops, Xiphophorus helleri e Xiphophorus maculatus). Os resultados mostraram que o probiótico melhorou o desempenho reprodutivo em termos de maior índice gonadossomático, fecundidade e a sobrevivência das espécies. Neste contexto, a utilização de bactérias acido lácticas na forma de tratamento pode ser importante para obtenção de peixes saudáveis e com qualidade.

16 15 4 ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE BACTÉRIAS ÁCIDO LÁCTICAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO PARA PIRARUCU. Marcela Iris GABBAY 1, Mauricio Laterça, MARTINS 2, Adolfo Bezerra JATOBÁ 3, Bruno Correa SILVA 4, José Luiz Pedreira MOURIÑO 4, Rodrigo Yudi FUJIMOTO 1. 1 Laboratório de Ictioparasitologia e Piscicultura, Universidade Federal do Pará campus de Bragança. Leandro Ribeiro s/n. 2 Laboratório AQUOS Sanidade de Organismos Aquáticos, Departamento de Aquicultura, Universidade Federal de Santa Catarina. 3 Instituto Federal Catarinense, Câmpus Araquari, Br-208, Km 27 4 Laboratório de Camarões marinhos, Universidade Federal de Santa Catarina, Servidão dos coroas s/n (fundos).barra da lagoa. 1 biomarcela@yahoo.com.br Resumo O objetivo deste trabalho foi isolar e selecionar bactérias ácido lácticas (BAL) do trato intestinal de Arapaima gigas. Foram utilizados 10 A. gigas (com 37,4 ± 1,4 cm e peso médio de 417,4 ± 59,4 g) provenientes do Projeto Pacu. Os alevinos foram aclimatados por período de 10 dias em tanques cilíndricos e sacrificados posteriormente para a retirada asséptica do trato intestinal que foi semeado em meio MRS ágar e incubados a 35 ºC por 24 horas. Estas foram enviadas ao laboratório de Camarões Marinhos para a realização do teste in vitro. Após o crescimento das colônias, realizou-se a coloração em gram para confirmar a morfologia de Lactobacillus e posteriormente a inibição frente a patógenos. A inibição foi determinada pelo o diâmetro do halo de crescimento bacteriano produzido ao redor do disco de ágar contendo (BAL). Além da inibição foi avaliado o desempenho da cepa no leite e sua viabilidade na ração. As cepas selecionadas no teste in vitro como potenciais probióticas foram identificadas como Lactobacillus paracasei ssp paracase e Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii. O crescimento da bactéria L. paracasei no leite apresentou melhor resposta em 90g. L -1 com uma concentração mínima de 3,4x10 8 UFC/mL -1. Para as demais concentrações apresentaram contagens semelhantes 30g. L -1 (1,7x10 8 UFC/mL -1 ) e 60g. L -1 (1,6 x10 8 UFC/mL -1 ). O crescimento desta na ração foi de 2,7 x10 7 UFC/ g -1. Palavras- chave: Arapaima gigas, seleção in vitro, Lactobacillus. Isolation and selection of lactic acid bacteria with potential probiotic for Arapaima gigas.

17 16 Abstract The objetive of this study to isolate and select lactic acid bactéria (LAB) of the intestinal tract of Arapaima gigas. We used 10 A. gigas (37.4± 1.4 cm and average weigtht of 417.4±59.4 g) from the project Pacu. The fry were acclimated 10 days in cylindrical tanks and sacrificed for aseptic removal of the intestinal tract that was sown in MRS agar medium and incubated at 35 C for 24 hours. These were sent to the laboratory for the marine Cameroon testing in vitro. After growth of the colonies was held in gram staining to confirm the morphology of Lactobacillus and later inhibition against pathogens. The inhibition was determined by the diameter of the halo produced bacterial growth around the disc agar containing (LAB).Addition of inhibition was evaluated the performance of the strain in the milk and viability in the ration. The strains were selected as the in vitro test been identified as potential probiotic Lactobacillus paracasei ssp paracasei, Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii. The growth of bacteria L. paracasei no milk showed better response in 90g.L -1 with a minimum concentration of 3,4 x10 8 UFC/mL -1. For the other concentrations showed similar counts 30g.L -1 (1,7 x10 8 UFC/mL -1 ) and 60g.L -1 (1,6 x10 8 UFC/mL -1 ). The growth of the was 2,7x10 7 UFC/g -1. Keywords: Arapaima gigas, in vitro selection, Lactobacillus.

18 INTRODUÇÃO A demanda crescente do mercado mundial por proteínas de alta qualidade tem estimulado o crescimento da Aquicultura. Esse crescimento ocorre através do aumento das áreas de produção e intensificação no sistema de criação expõe os peixes a diversas variações ambientais provocando um desequilíbrio da tríade patógenos-hospedeiro-ambiente que pode favorecer a invasão de patógenos (vírus, bactéria e parasitas) e o desenvolvimento de alguma enfermidade resultando em perdas na produção (Toranzo et al. 2004). Para o controle de enfermidades, vários recursos são utilizados, em especial, agentes químicos com funções antimicrobianas (antibióticos). Porém, o uso desses produtos tem resultado no desenvolvimento de cepas resistentes e acúmulo de resíduos nos tecidos dos peixes comercializados, além de ser uma fonte de poluição (Fuller, 1992; Moriarty, 1999; Balcazar et al. 2006). Uma alternativa ao uso de antibióticos é a utilização de probióticos que podem favorecer o crescimento dos animais cultivados e reduzir de agentes patogênicos, minimizando o uso de agentes químicos, como antibióticos, favorecendo de uma aquicultura sustentável (Iranto e Austin 2002). O uso de probióticos na aquicultura é recente e tem mostrado resultados promissores para peixes e larvas de crustáceos (Planas e Cunha 1999). Os benefícios descritos dos probióticos adicionados à dieta são: melhora nos índices zootécnicos como maior produtividade, aumento no ganho de peso e melhor conversão alimentar, além da redução da colonização intestinal por agentes patogênicos. Para tilápia do nilo foi observado o efeito probiótico do Lactobacillus plantarum através da inibição in vitro, capacidade da cepa alterar a microbiota intestinal, aumento no número de leucócitos totais, assim como aumento do ganho em peso, eficiência alimentar e produtividade (Jatobá et al. 2008; 2011).

19 18 Embora, seja uma ferramenta importante, a utilização de bactérias ácido lácticas isoladas de espécies nativas da Amazônia, são desconhecidos. Entre as principais espécies nativas utilizadas para a aquicultura no norte do Brasil, existe uma alta aceitação no mercado, para o tambaqui (Colossoma macropomum) e o pirarucu (Arapaima gigas) (Faria 2008; Ostrensky et al. 2008; Ulrich 1986). O pirarucu é um peixe endêmico da Amazônia apresentando características que o torna grande interesse para piscicultura como seu excelente ganho de peso (em torno de 10 kg no primeiro ano), carne desprovida de espinhos, rusticidade, alto rendimento de carcaça (em torno de 57%) e alto valor comercial da carne (Imbiriba 2001; Soares e Noronha 2007). A aplicação de tecnologia apropriada de cultivo de pirarucu em ambientes controlados se apresenta como uma opção ecológica, econômica e socialmente viável (Rebaza et al. 2005). Embora importante esta espécie careça de informações devido a falta de conhecimento de aspectos nutricionais, da biologia reprodutiva, sanitária e da adaptabilidade em cativeiro. O presente estudo teve como objetivo isolar e selecionar cepas de bactérias acido lácticas do trato intestinal de Arapaima gigas com potencial probiótico. 4.2 MATERIAIS E MÉTODOS O isolamento e seleção das bactérias ácido láctica com potencial probiótico foram realizados em duas etapas. As amostras foram coletadas no laboratório de Microbiologia da Universidade Federal do Pará (UFPA) e enviadas ao setor de microbiologia do Laboratório de Camarões Marinhos da Universidade Federal de Santa Catarina, para realização da seleção in vitro. Material biológico e isolamento Dez juvenis saudáveis de Arapaima gigas (37,4±1,4 cm de comprimento e peso médio 417,4±59,4g) provenientes do projeto Pacu (Mato grosso do sul), foram aclimatados por 10

20 19 dias em tanques cilíndricos de 310 L, no laboratório de Recurso Pesqueiros e Agronegócios do Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia (IFPA-Campus Belém). Os peixes foram lavados com álcool 70% e sacrificados por choque térmico (resfriamento em mistura de gelo e água) e eviscerados na posição ventral para extração dos fragmentos intestinais. Após a extração dos fragmentos do intestino, as amostras foram maceradas em gral de porcelana e diluídos em solução salina estéril 0,65%, sendo posteriormente semeados em meio de cultura Agar MRS (Man Rogosa Sharpe) de acordo com Jatobá et al. (2008). As amostras foram incubadas por 48 h a 35 ºC e enviadas para o laboratório de camarões marinhos. Inibição frente à patógenos A inibição do crescimento de patógeno foi efetuado por meio do método de Tagg e Mc Given (1971) adaptado por Ramirez et al. (2006).Bactérias ácido lácticas recém crescidas em meio MRS (35 ºC por 24 h) foram semeadas em placas de de ágar MRS e incubadas a 35 ºC por 48 h. Após esse período foram retirados três discos (0,8cm de diâmetro) da placa Agar com cepas BAL, sendo estes discos sobrepostos em meio de cultura Agar Triptona de soja (TSA) com duas repetições cada, recém semeados com um dos seguintes patógenos (Aeromonas hydrophila ATCC7966, Pseudomonas aeroginosa ATCC 27853, Enterococcus durans ATCC 19492, Escherichia coli D363, Staphylococcus aureus ATCC25923, Micrococcus luteus A270 e Aeromonas hydrophila CPQBA DRM, isolada por Silva et al. (2012), sendo incubadas a 30 ºC por 24 h. A inibição do crescimento patogênico foi determinada, pelo diâmetro do halo de inibição de crescimento bacteriano produzido ao redor do disco de Agar contendo as BAL.

21 20 Avaliação bacteriana no meio de cultura alternativo A bactéria com os melhores halos de inibição foi selecionada para verificar seu desempenho em diferentes concentrações de leite (desnatado Molico) para posterior aspersão na ração (Ramirez et al. 2006). As BAL recém semeadas em meio MRS (24h a 35º C) foi inoculada (1mL, representava 10% do volume final) em três concentrações (1) 30g de leite por litro de água, (2) 60g. L -1 e (3) 90g. L -1, ambas as concentrações com 20g. L -1 de açúcar, com duas repetições cada, incubadas a 35 ºC por 48 h. Após este período foi realizado diluição seriada (fator 1:10) em solução salina estéril 0,65% NaCl das bactérias semeadas em placa para contagem das unidades formadoras de colônias (UFC). Avaliação da bactéria na ração A bactéria ácido láctica (BAL) foi cultivada na concentração determinada na etapa anterior, nesta etapa a ração foi aspergida em leite (Molico). 100 ml.kg -1 de ração (Guabi - Pirá 40% de proteína bruta extrusada). Após aspersão a ração foi acondicionada em bandejas hermeticamente fechadas e incubadas em estufa a 35 C por 24 horas, para posterior secagem a 30 C por 24 horas. Um grama da amostra foi macerada em gral de porcelana com 1mL de solução salina estéril, sendo realizada cinco diluições seriadas com fator de 1:10 (Madigan; Martinko; Parker, 2004). Sendo essas diluições ( ) semeadas em meio Agar MRS e incubadas em estufa a 35 ºC por 48 h para verificação a concentração das BAL na ração, e para verificar a viabilidade destas bactérias na dieta. A identificação das cepas foi realizada por meio de provas bioquímicas com o kit API 50 CHB através de fermentação de carboidratos,

22 RESULTADOS E DISCUSSÃO Isolamento de bactérias ácido lácticas Nesta etapa foram isoladas vinte e seis cepas destas, nove não resistiram nas condições laboratoriais, treze foram descartadas pelo crescimento lento. E quatro cepas (cocos e estreptococcos positivos) foram selecionadas para o teste in vitro. Estes dados diferem ao observado por Mouriño (2010), ao qual isolou in vitro 41 cepas de bactérias de Pseudoplatystoma sp para se obter uma cepa com potencial probiótico. Inibição in vitro frente à patógenos Das sete cepas patogênicas, apenas a Staphylococcus aureus (S.A) e a Aeromonas hydrophila (AH2) não foram inibidas por nenhuma bactéria probiótica (tabela 1). Este dado difere dos descritos por Robertson et al. (2000), utilizando Carnobacterium sp. relataram inibição in vitro para A. hydrophila e mais seis patógenos (A. salmonicida, Flavobacterium psychrophilum, Photobacterium damselae subsp. piscicida, Streptococcus milleri, Vibrio anguillarum e V. ordalii). Tabela 1. Média dos halos inibição em mm. Cepas E. Coli M.L E.D P.A A.H S.A A A A A (A.H.) Aeromonas hydrophila; (P.A.) Pseudomonas aeroginosa; (E.D.) Enterococcus durans, (E.C.) Escherichia coli, (S.A.) Staphylococcus aureus, (M.L.) Micrococcus luteus. A identificação das cepas foi realizada por meio de provas bioquímicas como: Lactobacillus paracasei ssp paracasei com 99,9% de precisão (A27), um Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii com 62,7% de precisão (A30) e dois Lactobacillus delbrueckii ssp delbrueckii com 52,2% de precisão (A25, A31).Não foi encontrado registro de patogenicidade desta cepa para peixes.

23 22 É importante para o desenvolvimento de um probiótico efetivo, para qualquer sistema de produção de organismos aquáticos, a identificação de probiontes que seriam normalmente encontrados no ambiente aquático e no trato intestinal, considerando a complexidade de relações entre hospedeiro e habitat (Verschuere, et al. 2000). Nossos achados, também corroboram com os descritos por Picchietti et al. (2009) isolando do intestino de adultos de robalo europeu Dicentrarchus labrax, nos gêneros encontrados. A cepa Lactobacillus paracasei (A27), foi utilizada para o experimento de colonização do trato intestinal de pirarucu, através da suplementação na dieta, por apresentar o melhor halo de inibição. O uso de algumas espécies de Lactobacillus como probiótico, tem mostrado a capacidade de competir com uma série importante de bactérias patogênicas, como Escherichia coli e Salmonella typhimurium. Os Lactobacillus aderem-se fortemente a parede intestinal, inibindo o crescimento de bactérias indesejáveis com substancias produzidas durante a fermentação como os ácidos lático e acético (Vazquez et al. 2005). Avaliação bacteriana em meio alternativo O crescimento da bactéria Lactobacillus paracasei no leite apresentou melhor resposta em 90g. L -1 com uma concentração mínima de 3,4x10 8 UFC/mL -1. As demais concentrações apresentaram contagens semelhantes (Tabela 2). Tabela 2. Resultado das contagens das diferentes concentrações de leite desnatado. Concentração de Leite desnatado UFC Leite desnatado (30 g.l -1 ) 1,7 x10 8 Leite desnatado (60 g.l -1 ) 1,6 x10 8 Leite desnatado (90 g.l -1 ) 3,4 x10 8

24 23 Avaliação da bactéria na ração Na aquicultura, a dose de probiótico normalmente varia de UFC/g de ração (Nayak, 2010). A viabilidade da BAL na dieta esta relacionado a concentração (numero de unidade formadoras de colônia por grama de ração) na dieta, assim como o tempo que estas bactérias se mantém vivas na mesma. Na presente pesquisa evidenciou-se a contagem previa da bactéria a ácido láctica na ração suplementada com a bactéria probiótica Lactobacillus paracasei de 5,65 x10 6 UFC/ g -1. Os resultados obtidos no teste de viabilidade da ração permite a estocagem da ração após a adição da BAL por um período de mínimo de 13 dias. CONCLUSÃO O Lactobacillus paracasei ssp paracasei (A27), mostrou a capacidade de inibicão in vitro e viabilidade na dieta. AGRADECIMENTOS A CAPES pela bolsa de estudo concedida. 4.4 BIBLIOGRAFIA CITADA Balcazar, J. L. et al The role of probiotics. Veterinary Microbiology.114: Faria, M. T Programa de pesquisa em Aquicultura para a Embrapa Amazônia Oriental, Belém/ Pa, n. 342, ( Acesso em 15/08/2009. Fuller, R. A Review probiotics in man and animals. Journal of Applied Bacteriology. 66: Irianto, A. e Austin, B Probiótics in Aquaculture: Review. Journal of Fish

25 24 Diseases.25: Imbiriba, E. P Potencial de criação de pirarucu (Arapaima gigas), em cativeiro. Acta Amazônica. Manaus. 31: Jatobá, A. M. et al Utilização de bactérias acido lácticas isoladas de trato intestinal de tilápia do Nilo como probiótico. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, 43: Madigan, M. T.; Martinko, J. M.; Parker, J Microbiologia de Brock. Prentice Hall. São Paulo. 608pp. Moriarty, D. J. W Disease control in shrimp aquaculture with probiotic bacteria. Microbial Interactions in Aquaculture.Canadá, 1-7. Mouriño, J.L.P Suplementação com simbiótico para o híbrido de pintado (Pseudoplatystoma corruscans) e cachara (p. fasciatum).dissertação de doutorado, Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis.133pp. Nayaka, S.K Probiotics and immunity: A fish perspective. Fish & Shellfish Immunology. 29: Ostrensky, A.; Boeger, W. A.; Chammas, M. C In: Ostrensky, A.; Borguetti, J. R.; Soto, D. Aquicultura no Brasil: o desafio é crescer. Potencial para o desenvolvimento da Aquicultura no Brasil. Brasília pp. Picchietti, S. et al., Early treatment with Lactobacillus delbrueckii strain induces an increase in intestinal T- cells and granulocytes and modulates immune-related genes of larval Dicentrarchus labrax (L.). Fish & Shellfish Immunology. 26: Plana, M.; Cunha, I Larviculture of marine fish: problems and Perspectives. Aquaculture.177: Ramirez, C. et al Microorganismos lácticos probióticos para ser aplicadas en la de larvas de camarón y peces como substituto de antibiótico. La Alimentación Latino Americana. 264: Rebaza, M. A.; Rebaza, C. A.; Taboada, S. D Avances en el cultivo de la paiche Arapaima gigas en jaulas flotantes en el lago Imiría, In: Renno, J. F. et al. Biología de la

26 25 poblaciones de peces de la Amazónia y piscicultura, I comunicaciones del primer coloquio internacional de la rede de investigacion sobre la ictiofauna Amazónica, Perú. Soares, M.C.F.; Noronha, E.A.P Pirarucu, Arapaima gigas: Uma revisão bibliográfica visando a Aquicultura sustentavél. 1º congreso brasileiro de produção de peixes nativos de água doce. Mato Grosso do Sul. Toranzo, A. E. et al Enfermidades bacterianas y víricas de peces marinos. p In:Ranzani - Paiva; Takemoto, R. M.; Lizama M. A. P. Editora Varela Sanidade de organismos aquáticos. São Paulo. Vazquez, J.A.; Gonzalez, M.P.; Murado, M.A. Effects of lactic acid bacteria cultures on pathogenic microbiota from fish. Aquaculture, v. 245, p , Verschuere, et al Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiology And Molecular Biology Reviews, 64:

27 26 5 DESEMPENHO ZOOTÉCNICO DE Arapaima gigas SUPLEMENTADOS COM Lactobacillus paracasei E DESAFIADOS COM Aeromonas hydrophila. Marcela Iris GABBAY 1, Mauricio Laterça, MARTINS 2, Adolfo Bezerra JATOBÁ 3, Bruno Correa SILVA 4, José Luiz Pedreira MOURIÑO 4, Rodrigo Yudi FUJIMOTO 1. 1 Laboratório de Ictioparasitologia e Piscicultura, Universidade Federal do Pará campus de Bragança. Leandro Ribeiro s/n. 2 Laboratório AQUOS Sanidade de Organismos Aquáticos, Departamento de Aquicultura, Universidade Federal de Santa Catarina. 3 Instituto Federal Catarinense, Câmpus Araquari, Br-208, Km 27 4 Laboratório de Camarões marinhos, Universidade Federal de Santa Catarina, Servidão dos coroas s/n (fundos).barra da lagoa. 1 biomarcela@yahoo.com.br Resumo As bactérias ácido lácticas tem se destacado por desempenhar efeitos benéficos ao hospedeiro, entre eles destacam-se a ativação do sistema imunológico, desempenho zootécnico eficiência alimentar. Assim, o objetivo desta pesquisa foi verificar o efeito de Lactobacillus paracasei isolada do trato intestinal de juvenis de pirarucu sobre a sanidade e desempenho zootécnico de Arapaima gigas. Um total de 96 indivíduos foram submetidos a 4 tratamentos alimentar por 120 dias com dieta controle e suplementadas com probiótico. Os tratamentos consistiram em tratamento T1(ração inoculado com leite estéril), T2 (ração controle/sem bactéria), T3 e T4 ração com diferentes concentrações de L. paracasei. Foram avaliados os parâmetros hematológicos nos tempos 90 e 120 dias, foi observado aumento de glicose, hemoglobina e eritrócito. Após 120 dias de alimentação foi realizado um desafio com Aeromonas hydrophila injetada intraperitoneal. Ao final de 24 horas de desafio foi observado elevada mortalidade dos peixes pertencentes ao grupo de probiótico seguidos dos alimentados com ração com leite estéril e grupo controle (dieta sem bactéria). Os resultados nos permite concluir que a cepa L. paracasei não influenciou o desempenho zootécnico dos juvenis de pirarucu, além de ser ineficaz na proteção contra a infecção por Aeromonas. Palavras-chave: Pirarucu, sangue, sobrevivência. Abstract The lactic acid bacteria has become known for playing host to the beneficial effects, among them stand out from the activation of the immune system, growth performance feed

28 27 efficiency. The objective of this research was to investigate the effect of Lactobacillus paracasei isolated from the intestinal tract of juvenile arapaima on the health and growth performance of Arapaima gigas. A total of 96 subjects underwent four dietary treatments for 120 days with control diet and supplemented with probiotics. The treatments were T1 (feed inoculated with sterile milk), T2 (control diet / no bacteria), T3 and T4 diets containing different concentrations of L. paracasei. Hematological parameters were evaluated in 90 days and 120 days, we observed increased glucose, hemoglobin and erythrocytes. After 120 days of feeding was carried out a challenge with Aeromonas hydrophila injected intraperitoneally. Within 24 hours of challenge high mortality was observed fish belonging to the group followed by the probiotic fed with sterile milk and the control group (without bacteria diet). The results allow us to conclude that the strain L. paracasei did not influence the growth performance of juvenile bass, as well as being ineffective in protecting against infection by Aeromonas. Keywords: Pirarucu, blood, survival.

29 INTRODUÇÃO O uso de bactérias ácido lácticas como probióticos vem despertando interesse no sistema de produção brasileiro, devido a produtividade natural, que é complementada com o uso destes micro-organismos na ração (Franco, 2009). A utilização como probiótico deve-se a capacidade destas inibir o crescimento de bactérias patogênicas pela produção de compostos antibacterianos (Fuller, 1989) e de favorecer o crescimento dos animais cultivados (Irianto e Austin, 2002). Apesar de algumas cepas de bactérias láticas colonizarem o intestino de peixes, elas não são dominantes na microbiota intestinal nativa dos mesmos. Embora possa ocorrer colonização do trato digestório via alimento artificial combinado com cepas ácido láticas, o número dessas bactérias tende a diminuir bastante ou desaparecer pouco tempo depois de cessado o fornecimento do probiótico. Devido ao fato de não serem naturalmente encontradas no trato digestivo destas espécies (Ringo & Gatesoupe, 1998). Contudo, há relatos bem sucedidos do emprego de diversas bactérias ácido láticas na aquicultura (Joborn et al., 1997; Nikoskelainen et al., 2001), sendo necessários maiores estudos quanto à relação custo-benefício e viabilidade do seu uso. A utilização de cepas bacterianas isoladas de espécies nativas da Amazônia é desconhecida. Entre as espécies cultivadas destacam-se o pirarucu e o tambaqui. O pirarucu (Arapaima gigas), peixe da família Arapaimidae é nativo da bacia Amazônica (Ferraris, 2003), apresenta respiração aérea obrigatória facilitando sua criação em ambientes com baixa disponibilidade de oxigênio (Salvo-Souza &Val, 1990). Entre as características peculiares que despertam o interesse no cultivo desta espécie temos: carne de coloração rósea e desprovida de espinhos, habilidade de respiração aérea suportando alta densidade, e adaptação em condições de cultivo podendo chegar até 10 kg no primeiro ano (Alfaro; Bocanegra; Garcia, 1999; Ono; Halverson ; Kubtiza, 2004). Embora com tais peculiaridades, os criadores de pirarucu enfrentam sérios problemas com a mortalidade súbita nas alevinagens e nas engordas, devido a infestações por diferentes parasitos, muitos deles já identificados, sendo de suma importância. Porém poucos trabalhos visam a prevenção, o controle e possível tratamento dessas enfermidades (Pereira Filho; Roubach, 2010). Assim o presente estudo busca contribuir com novas informações tecnológicas para espécie nativa de A. gigas, no aspecto que melhorem o desempenho sanitário e desempenho

30 29 zootécnico no cultivo através da utilização de bactérias ácido lácticas probióticas incorporadas na dieta alimentar. 5.2 MATERIAIS E MÉTODOS O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado (DIC) no laboratório de Ictioparasitologia e Piscicultura, localizado na UFPA campus de Bragança. Foram usados 96 juvenis de pirarucu doados pela piscicultura Canta Galo (Bahia), sendo estes transportados para o laboratório em sacos com oxigênio e aclimatados por 15 dias em tanque circular com capacidade de 5000L e aeração constante. Após este período os alevinos foram distribuídos em quatro tratamentos (T1, T2, T3 e T4). Sendo o T1 administrado a ração sem probiótico, mas suplementada com leite estéril, T2 sem probiótico (controle) e os demais (T3 e T4) com diferentes concentrações da bactéria probiótica suplementadas com a ração inoculadas em leite nas seguintes concentrações 10 5,10 6 UFC/g. Os alevinos foram distribuídos em quatro tanques de 5000L em sistema de recirculação de água, na densidade de 24 peixes. Os peixes foram marcados individualmente com chip eletrônico da marca Animalltag, sendo considerados então cada indivíduo como uma repetição. Eles foram previamente acondicionados a ração Guabi Pirá 40% proteína bruta com 5% do peso vivo, durante 15 dias anteriormente aos testes. A duração do experimento foi de quatro meses. Sendo que anteriormente ao ensaio e nos tempos 30, 60, 90 e 120 dias após o inicio do experimento, os peixes foram pesados e medidos (comprimento total e padrão). Manejo de alimentação e qualidade de água Os peixes foram alimentados quatro vezes por dia (8:00, 11:00,14:00 e 18:00) na proporção recomendada por Crescêncio et al. (2005), sendo ajustada conforme a biometria mensal. Durante o experimento foram avaliados o ph (com aparelho Quimis Q-400BC/BD), oxigênio dissolvido e temperatura (com aparelho OXYGEN METER LT Lutron DO-5519), condutividade semanalmente e quinzenalmente foi monitorada a amônia total (com aparelho HANNA Range HI 93715). Dieta alimentar e inoculação com probiótico Em experimento prévio foram isolados de dez pirarucus, vinte e seis cepas de bactérias e a partir de testes in vitro foi selecionada uma cepa com potencial probiótico identificada bioquimicamente como sendo Lactobacillus paracasei (ver seleção capítulo I). A partir dessa

31 30 seleção a bactéria foi replicada em meio MRS broth e incubada a 35 ºC por 24 h, sendo posteriormente inoculada no leite para crescimento e incubada nas mesmas condições e aspergida na ração. A dieta comercial (Guabi - Pirá com 40 % de PB) foi suplementada através da aspersão de L. paracasei em leite de acordo com os tratamentos mencionado anteriormente. As dietas foram mantidas em estufa 35 ºC por 24 horas, para o crescimento bacteriano e secagem da ração e posteriormente armazenadas em refrigerador a 4 ºC durante o ensaio. A ração inoculada com o probiótico foi preparada semanalmente sendo acondicionada em sacos plásticos e conservada em refrigerador a 4 C durante o período experimental. Também foi avaliado a viabilidade das células bacterianas na ração durante o armazenamento. Para tanto, um grama da amostra foi macerada em gral de porcelana com 1mL de solução salina estéril, sendo realizada cinco diluições seriadas com fator de 1:10 (Madigan; Martinko; Parker, 2004) e semeadas em placa com meio MRS incubadas a 35 ºC por 48 horas para contagem das UFC. Desempenho zootécnico Para análises de desempenho zootécnico foram realizadas quatro biometrias (conforme mencionado acima). A partir da obtenção dos dados de peso e comprimento foram determinados os parâmetros de ganho de peso, taxa de crescimento específico e fator de condição. O ganho de peso dos peixes foi calculado pela diferença entre os resultados de peso final e inicial dos peixes de cada tratamento. Para determinação da taxa de crescimento específico foi utilizada a seguinte equação: TCE= 100 x (In peso final - ln peso inicial / dias de experimento). Para o fator de condição foi utilizado os dados de comprimento total e peso, sendo estes transformados em log neperiano e posteriormente calculado a equação da reta. De posse desses dados foram obtidos os valores de peso esperado. Em seguida foram estimados o fator de condição relativo de cada indivíduo por meio da relação: Kr= peso observado/peso esperado, recomendado por Lima-Júnior et al. (2002). Avaliação microbiológica No inicio e final do experimento, foram dissecados o trato intestinal de dois pirarucus por unidade experimental, para contagem das Unidades Formadoras de Colônias. Os tratos foram macerados e diluídos serialmente em fator de 1:10 em solução salina estéril 0,65%, as

32 31 amostras foram semeadas em meio MRS e incubadas por 48 horas a 35 ºC. Parâmetros hematológicos Nos tempo 60 e 120, dez peixes foram anestesiados com óleo de cravo e retirados de cada unidade experimental para a coleta 1 ml de sangue por punção dos vasos caudais com auxilio de seringa e agulha esterilizadas e com anticoagulante EDTA 5%. O sangue foi então realocados em eppendorf de 1ml para então proceder as seguintes analises: glicemia, hematócrito, contagem total de eritrócitos, proteínas, hemoglobina. Para tanto, uma alíquota foi utilizada para realização da analise de glicemia utilizando o aparelho de medição de glicemia PRETIGE IQ 50. O hematócrito foi avaliado pelo método de microhematócrito segundo metodologia de Goldenfarb et al. (1971), após obtenção de hematócrito, foi obtido a proteína plasmática total utilizando um refratômetro da marca Quimis. Do eppendorf 10µl de sangue foram diluídos em 1ml de solução isotônica para posterior contagem total de eritrócitos em câmara de Neubauer. Com o restante de sangue foi analisada a hemoglobina com auxilio do contador automáticos de células aparelho CELM 500 e CELM 550. Parâmetros endoparasitológicos Anteriormente ao ensaio e ao final, 10 peixes de cada tratamento foram sacrificados com benzocaina possibilitando a coleta das amostras. As amostras para analises de endoparasitas foram extraídas de cecos pilóricos e do intestino. Para tanto, os conteúdos raspados foram montados em lâminas e lamínulas e analisados microscópica com auxilio de microscópio e estereomicroscópio. Quando presentes estes seriam fixados, quantificados e identificados ao menor táxon possível de acordo com Thatcher (2006). Desafio com Aeromonas hydrophila A cepa patogênica utilizada para esta etapa foi fornecida previamente pelo Laboratório de camarões marinhos, sendo esgotada em placa de petri contendo meio de cultura TSA. Em seguida uma colônia da bactéria foi inoculada em meio de caldo BHI (Brain heart Infusion) e incubada a 30 ºC por 24 horas. Após o crescimento a cultura foi diluída em série (1:10) até a diluição 10-8, sendo semeada em TSA para contagem total de unidades formadoras de colônia (UFC) do inóculo. Para infecção experimental, o inóculo crescido em BHI a 30 ºC por 24 horas foi centrifugada por 30 minutos a 1800 g. O sobrenadante foi descartado e o pellet suspenso em

33 32 solução salina estéril 0,65%, a suspensão se manteve 1,6 x10 7 UFC/mL -1. Após 120 dias de alimentação com L. paracasei, 48 juvenis de pirarucu restantes foram utilizados para o desafio com Aeromonas. Para tanto, quatro peixes de cada unidade experimental foram distribuídos aleatoriamente em três tanques com capacidade de 5000L e submetidos a três tratamentos. Os tratamentos consistiram em peixes não injetados, injetados com solução salina estéril, e injetados com 1mL de 1,6 x10 7 UFC/mL -1 de Aeromonas para cada individuo. Ao término das injeções foram realizadas observações a cada 2 horas e avaliadas os sintomas externos e a sobrevivência dos peixes durante 36 horas. Após este período os peixes sobreviventes de cada tratamento foram sacrificados e coletados amostras do rim, coração fígado e cérebro em condições assépticas para o re - isolamento da bactéria patogênica em meio de cultura TSA. Análises estatísticas Os dados obtidos foram analisados no programa Bio Estat 5.0, realizou-se o teste de normalidade com base nos desvios e verificação dos outlier, após a obtenção dos resultados foi submetido analise de variância (um critério), e sendo o F significativo foi realizado o teste Tukey (p=0,05) para comparação de médias. Os resultados estão apresentados como media ± desvio padrão. 5.3 RESULTADOS Durante o período experimental a temperatura se manteve em 27,2±0,08 ºC, o oxigênio dissolvido da água em 6,61±0,08 mg/l, o ph em 5,35±0,05, condutividade em 514,4±0,4 e amônia total em 2,3±0,1mg, permanecendo dentro dos valores recomendados para espécie (Cavero, 2002). Nas analises parasitológicas não foram encontrados parasitas internos e externos, confirmando que os todos os peixes empregados no estudo estavam saudáveis. O número médio das unidades formadoras de colônia (UFC) de bactérias no trato intestinal dos pirarucus alimentados com probiótico inicialmente de foi de (1.27x10 4 e 6.80 x10 4 ) para peixes alimentados com probiótico 10 5 e 5.26x x10 5 contagens finais para peixes alimentados com probiótico 10 6 (Tabela 1). A UFC nas as dietas suplementadas com L. paracasei apresentaram contagem semelhantes 5,65x10 6 para T3 e 6,98x10 6 para T4.

34 33 Neste estudo não foi verificado diferença significativa no ganho de peso e fator de condição e taxa de crescimento especifico entre o controle e os tratamentos (Tabela 2). Quanto aos parâmetros hematológicos, os peixes suplementados com L. paracasei (10-6 ) apresentaram maior valores de glicose e hemoglobina no tempo 120 dias em relação ao grupo controle, enquanto que no tempo 60 dias foi observado aumento de eritrócito quando comparados com o grupo controle (Tabela 3). O desafio com Aeromonas por inoculação intraperitoneal resultou em letargia, inchaço no local da aplicação da injeção e hemorragia nas nadadeiras peitorais, enquanto que os órgãos internos (fígado e baço) apresentaram-se inchaço quando comparado com o grupo controle (Figura 1). Figura1. Alevino de pirarucu com inchaço no local da aplicação após injeção com Aeromonas (A), em destaque órgão interno de peixes injetados com Aeromonas (B) e peixes injetados com solução salina (C). Fonte: A autora, As amostras do trato intestinal semeadas em TSA dos peixes não injetados e injetados com solução salina não apresentaram crescimento de bactérias detectáveis, enquanto que os peixes desafiados apresentaram colônias com coloração castanha e formato redondo, semelhante a Aeromonas usada no desafio. Os esfregaços, corados pelo método gram, confirmaram bastonetes gram negativos. Neste estudo observou-se mortalidades elevada sendo que após 24 horas de desafio experimental observou-se maior mortalidade nos indivíduos alimentados anteriormente com