Universidade Estadual de Maringá - UEM Disciplina: Biologia Molecular 6855 T1 e T2 Ciências Biológicas DNA forense Profa. Dra. Maria Aparecida Fernandez
TIPAGEM MOLECULAR Somos parecidos no entanto com enormes diferenças Variações em proteínas Maioria das diferenças no DNA, em regiões não codificadoras
O GENOMA HUMANO Genoma Humano: 46 cromossomos = 3,5 x 10 9 pb; cromossomo 21 = 33.546.361 pb; 127 genes conhecidos, 98 genes previstos e 59 pseudogenes; 5% genes, 95% seqüências sem função conhecida; > 2.500 microssatélites identificados.
Possíveis fontes de DNA: sangue periférico células da mucosa oral células do bulbo capilar células descamadas da pele ossos resíduos de esperma etc
ANALISANDO AS DIFERENÇAS NO DNA Causas: Mudança em um par de bases: mutações de ponto, transições ou transversões, entre outros eventos; Regiões de repetição in tandem no DNA: VNTR (número de repetições variáveis in tandem) STR (pequenas repetições in tandem)
Técnicas Básicas para Tipagem Molecular: RFPL utiliza enzimas de restrição e southern blotting, mudanças nos sítios de restrição alterariam o perfil de bandas no gel analisado PCR reação em cadeia da polimerase, permite a tipagem eficiente de minissatélites a partir de uma célula
Alteração na sequência de DNA e enzimas de restrição: TTTAAA AAATTT TTCAAA AAGTTT Observado pela alteração no tamanho do fragmento de DNA Detectado pela hibridação com uma sonda específica após o método de Southern blotting
RFPL
RFPL
PCR
Loci Múltiplos Alec Jeffreys et al, 1985 descobriram duas seqüências de DNA comuns a milhares de VNTRs Inúmeras seqüências de minissatélites encontram-se distribuídas nos 23 pares de cromossomos humanos Apresentam entre si semelhanças suficientes para serem detectadas simultaneamente em vários loci por uma única sonda
Tipagem Molecular M F P NAp
Investigação de Paternidade Através do DNA Aplicações Código de Barras
Investigação de Paternidade Através do DNA Mãe Pai Filho
Tipagem Molecular Locus Simples Sondas que detectam um único VNTR 1 ou 2 bandas por indivíduo, dependendo se homo ou heterozigoto Utiliza-se uma mistura de sondas para locus único (vários VNTRs presentes)
Tipagem Molecular Quantas pessoa podem apresentar o mesmo perfil??? Realiza-se um cálculo de freqüência com diferentes sondas Por exemplo: Sonda A 10% da população, Sonda B 5% da população, Então: (0,1) x (0,05) = 0,005 ou 0,5% de achar o mesmo perfil em 2 pessoas diferentes 1 pessoa em 200 CODIS Combined DNA Identification System - FBI Baseado em 13 regiões de STR, as chances de 2 indivíduos apresentarem o mesmo perfil são muito pequenas
Tipagem Molecular
APLICAÇÕES DA TIPAGEM DE DNA Medicina Forense: Em 30% dos casos de tipagem molecular realizadas demonstraram que o suspeito não poderia ter deixado as amostras que estavam sendo utilizadas para incriminá-lo Utilizada para excluir suspeitos
Aplicações Aplicações Biológicas: Biologia da conservação; Biologia evolutiva; Biologia comportamental; Taxonomia; Exemplos: 1) Entender de que maneira o parentesco afeta o comportamento de chimpanzés; 2) Tipagem de DNA de uma árvore levou a uma condenação de assassinato 3) Caso dos sapatos deixados na cena do crime
DIVISÃO DE DNA ANIMAL Avestruzes: sexagem, identificação de parentesco, patógenos; Bovinos: parentesco; Eqüinos: parentesco e marcadores moleculares.
DNA MITOCONDRIAL NA TIPAGEM MOLECULAR Mitocôndria humana apresenta um genoma circular de ~17.000pb Cada célula apresenta inúmeras mitocôndrias Herança materna Alta taxa de mutação
DNA MITOCONDRIAL Famílias argentinas para achar parentes desaparecidos após a ditadura militar - Dra. Amry-Claire King, 1990; Identificação da família real da Rússia, assassinada pelos soldados bolcheviques em 1918 e enterradas em sepulturas anônimas; Forças armadas dos Estados Unidos têm um programa de identificação prévia para identificação de soldados mortos em conflitos militares.