Avaliação ecotoxicológica de ecossistemas aquáticos da bacia hidrográfica do rio Itaqueri (Itirapina/Brotas, SP): uma análise espacial Ana Elisa Ferrari Carvalho (ana.elisa.carvalho@usp.br), Eliana Medeiros Ferreira da Silva (eliana.silva@usp.br), Kenzo Gabriel Matsubara (kenzo.matsubara@hotmail.com), Letícia Franco Leonel (leticia.franco.leonel@usp.br), Paula Virgínia Gonçalves Monzane (pamonzane@gmail.com) & Teresa Hatsue Sasaki (tekinha_tete@yahoo.com.br). Universidade de São Paulo, Escola de Engenharia de São Carlos, Departamento de Hidráulica e Saneamento, Núcleo de Estudos em Ecossistemas Aquáticos - Av. Trabalhador Sãocarlense, 400, Centro, São Carlos, SP, Brasil *Autor para a correspondência: +55 16 8123 8694. ana.elisa.carvalho@usp.br Palavras-chave: ecotoxicologia, Daphnia similis, Pseudokirchineriella subcapitata. Título abreviado: Avaliação ecotoxicológica
ABSTRACT This study goal was evaluating the toxicity in samples of water and sediment from aquatic ecosystems (rivers and dam) which integrate Itaqueri River Bay, considering a spatial approach. To this end, samples of water and sediment were collected in May 11 th and 12 th, 2009, in 09 sampling stations, making toxicity tests with algae (Pseudokirchineriella subcapitata) and Daphnia similis, considering chronic effects (increase in the population) and acute (immobility/mortality), respectively. Additionally, measures in ph, conductivity, dissolved oxygen, temperature and nutrients were obtained, in addition to an environmental diagnosis of each sampling areas. The achieved results revealed differences in the population growth of the algae in comparison to the control (88,8 % of samples caused toxicity) as well as mortality of D. similis, indicating stress factors to the samples of water (55,5% of samples were toxic) and sediment (44,4% of samples were toxic), which varied according to the use and occupation of the surrounding area, like Eucaliptus, Pinus, sugar cane and orange plantation areas. RESUMO O presente estudo teve como objetivo avaliar a toxicidade de amostras de água e sedimento de ecossistemas aquáticos (rios e represa) que integram a bacia hidrográfica do rio Itaqueri, considerando uma abordagem espacial. Para tanto, amostras de água e sedimento foram coletadas entre 11 e 12 de maio de 2009, em 09 estações de amostragem, realizando testes de toxicidade com algas (Pseudokirchineriella subcapitata) e dafinídeos (Daphnia similis), considerando efeitos crônicos (aumento populacional) e agudos (imobilidade/mortalidade), respectivamente. Adicionalmente, medidas de ph, condutividade, oxigênio dissolvido, temperatura e nutrientes foram obtidas, além de um diagnóstico ambiental de cada área amostrada. Os resultados 1
obtidos revelaram diferenças no crescimento populacional das algas em relação ao controle (88,8% das amostras causaram toxicidade), bem como mortalidade de D. similis, indicando fatores de estresse para as amostras de água (55,5% das amostras foram tóxicas) e de sedimento (44,4% das amostras foram tóxicas), os quais variaram em função dos usos e ocupação da área de entorno, o que inclui áreas de plantio de Eucaliptus, Pinus, cana-de-açúcar e laranja. 1 INTRODUÇÃO A Ecotoxicologia é a ciência que estuda o comportamento e as transformações das substâncias químicas no meio ambiente, assim como os seus efeitos sobre os organismos que vivem nos ecossistemas aquáticos e terrestres. Os estudos ecotoxicológicos são um complemento para as análises físicas e químicas individuais, pois apresentam abordagens integradas dos efeitos de poluentes, levando em consideração a resposta da comunidade biológica. A realização dos ensaios de toxicidade pode ser em condições controladas de laboratório ou em campo. Os estudos em campo utilizam várias espécies e são mais realísticos do que aqueles que utilizam uma única espécie, pois avaliam também as interações entre os organismos da população em estudo. Os ensaios em laboratório são normalmente realizados com uma única espécie e, por isso, não levam em conta as interações com outros organismos que ocorrem no ambiente, mas tem a vantagem de ser facilmente padronizável. Como premissa básica, os organismos aquáticos utilizados em ensaios ecotoxicológicos devem pertencer a certos grupos taxonômicos representativos dos ecossistemas aquáticos. Deve também ser levada em conta a sensibilidade; é preciso que a espécie seja bastante sensível a uma diversidade de agentes químicos. Preferencialmente utilizam-se espécies facilmente disponíveis e abundantes. Outro 2
critério é a facilidade de cultivo e manipulação em laboratório. Por fim, buscam-se espécies com metodologia de testes e de cultivo já estabelecidos. Para a realização do presente trabalho, foram utilizados organismos pertencentes aos grupos taxonômicos das algas (Pseudokirchineriella subcapitata) e crustáceos (Daphnia similis). É importante a utilização de diferentes espécies de organismos nos testes, pois os processos metabólicos de cada espécie respondem diferentemente aos contaminantes, gerando respostas diferentes para cada organismo-teste utilizado. A Bacia Hidrográfica do Rio Itaqueri abrange parte dos municípios de Brotas e Itirapina, estando a Represa do Lobo (Broa) no limite de ambos. Predominam os solos arenosos, com manchas de solos mais férteis devido à presença do basalto. Como a vegetação está intimamente relacionada ao tipo de solo, o cerrado aparece como vegetação dominante, sendo substituído pela mata mesófila ou mata de planalto em locais com solos mais férteis, onde há presença de basalto, e por matas ciliares ou brejos, nas proximidades dos cursos d água, em regiões mais alagadiças, ricas em nutrientes. No entanto, grande parte desta vegetação natural já sofreu alterações antrópicas que modificaram a paisagem, como a substituição de parte desta vegetação por agricultura, a implantação de mineradora nas margens do Rio Itaqueri e a construção da Represa do Lobo (Broa), com o represamento do Rio Itaqueri. A Bacia Hidrográfica do Rio Itaqueri, todavia, encontra-se ainda consideravelmente conservada, pois grande parte de sua área pertence a unidades de conservação (Estação Ecológica, e Estação Experimental de Itirapina e Área de Proteção Ambiental APA - de Corumbataí). As coletas das amostras foram realizadas nos dias 11 e 12 de maio, no período da manhã. O dia estava ensolarado, com a presença de poucas nuvens e um vento fraco. 3
O primeiro ponto de coleta (Ponto 1) localiza-se em um trecho do Rio Itaqueri em que este é cortado por uma ponte por onde passa a rodovia SP-310. A amostra foi coletada logo a montante da ponte, onde havia grande incidência de luz e ausência de vegetação arbórea. Porém, a cerca de 30 metros a montante do ponto de coleta, havia um adensamento da vegetação arbórea. As amostras do ponto 2 foram coletadas em um trecho do rio Perdizes. O local era próximo da represa e longe de qualquer rodovia. A margem direita apresentava vegetação densa e nativa, enquanto a margem esquerda fazia parte da área de lazer de um condomínio, não apresentando vegetação. Nenhuma das margens apresentava erosão. Havia a presença de grande quantidade de macrófitas e sedimentação, formando bancos de areia. No terceiro ponto de amostragem (Ponto 3), um trecho do Ribeirão do Geraldo localizado a aproximadamente 10 metros da estrada, a água era cristalina, apesar da existência de uma suinocultura à montante. A vegetação era relativamente densa, havia grande quantidade de macrófitas e o sedimento era bem fofo. O ponto 4, localizado na junção dos rios Água Branca e Limoeiro a 10 metros da rodovia, apresentava forte cheiro de esgoto, resíduos nas margens e grande umidade. A vegetação era variada e moderadamente densa. Havia presença de macrófitas no leito do rio. No rio Água Branca, havia o lançamento do esgoto da cidade de Itirapina. As coletas do ponto 5 foram realizadas no Ribeirão do Lobo, a aproximadamente 20 metros da rodovia. O solo do local era arenoso e a matéria orgânica superficial era abundante, pois a mata ao redor era fechada e com presença de lianas. Havia a presença de nascentes nas redondezas. O ponto 6 foi localizado no Ribeirão do Lobo à jusante da represa. O ponto estava localizado a cerca de 100 metros da rodovia. A margem direita apresentava vegetação 4
rasteira, poucas árvores, com evidências de alteração antrópica. A margem esquerda apresentava vegetação densa e nativa. O local era uma área de remanso com presença de entulho. O ponto 7 era um ponto da represa próximo do rio Itaqueri (foz do rio Itaqueri). Havia muita matéria orgânica na água. De modo semelhante ao ponto 7, o ponto 8 era localizado na represa, mas próximo à foz do rio do Lobo. Esse era um ponto próximo da margem, que apresentava mata ciliar. Havia grande quantidade de macrófitas e foi observada a ausência de peixes no local. O ponto 9 era localizado na parte central da represa. Figura 1. Representação de todos os pontos no mapa. 5
2 - METODOLOGIA 2.1 Coleta e preservação das amostras 2.1.1 - Amostra de água As amostras de água foram coletadas em galões limpos e livres de contaminação. Primeiramente, o galão foi lavado com a água do próprio ponto de coleta. Foi coletada água a uns 20 ou 30 cm de profundidade. O galão foi fechado e mantido sob refrigeração. Antes da utilização da amostra para a montagem do experimento, esta foi homogeneizada. 2.1.2 - Amostra de sedimento Todos os materiais envolvidos na amostragem do sedimento destinados as análises toxicológicas estavam limpos e livres de contaminação. O recipiente foi preenchido até a boca, para que a amostra não ficasse exposta ao ar. Até a chegada no laboratório a amostra foi ser mantida sob refrigeração. 2.2 Daphnia similis 2.2.1 - Materiais e métodos Organismo-teste: Daphnia similis (neonatos de 6 24 horas) Água de cultivo e diluição: água natural reconstituída (ABNT, 2005). ph 7.0 7.6 Dureza 40 48 mg CaCO 3 Temperatura (controlada) 23 ±1 C Tabela 1. Requisitos da água de cultivo e diluição. Água: os testes de toxicidade aguda com as amostras de água foram realizados de acordo com os procedimentos descritos na norma técnica NBR 12713 (ABNT, 2004), com modificação em relação à temperatura. O princípio do método consiste expor neonatos com idade de 0 a 24 horas às amostras mais um controle (água de 6
cultivo), por um período de 48 horas. Para cada amostra/diluição, incluindo o controle, foram testadas 4 replicatas, cada uma com 10 ml de amostra e 5 neonatos. Durante o período de teste, os organismos foram mantidos sem alimento em sala com temperatura de 23ºC 2ºC e fotoperíodo de 16 horas de claro por 8 horas de escuro. Após o período de exposição (48 horas), procedeu-se à contagem dos organismos imóveis, sendo considerados imóveis aqueles que não conseguiram nadar dentro de um intervalo de 15 segundos, após leve agitação da amostra. Os resultados foram expressos em CE(I)50 e Tóxica / Não Tóxica para amostras sem diluição. Sedimento: os testes com o sedimento total foram feitos de acordo com a metodologia descrita em BURTON & MACPHERSON (1995). Os testes com Daphnia similis foram realizados com 4 réplicas por ponto, contendo 20 g de sedimento e 80 ml água de cultivo (1 para 4, respectivamente) e 10 neonatos por réplica. Durante o período de teste, os organismos foram mantidos sem alimento em sala com temperatura de 23ºC 2ºC e fotoperíodo de 16 horas de claro por 8 horas de escuro Após o período de exposição (48 horas), procedeu-se à contagem dos organismos imóveis. Os testes são considerados válidos quando a taxa de imobilidade do controle for igual ou menor que 10%, nos testes com água e 20% nos testes com sedimento. A confirmação da toxicidade das amostras sem diluição (água e sedimento) foi feita pela Prova Exata de Fisher. As amostras que apresentaram diferenças significativas, sob um determinado nível fixo de erro (5%), foram consideradas tóxicas. A CE50 do teste de sensibilidade com KCl foi calculada através do método estatístico Trimmed Spearman Karber. 2.2.2 - Controle de sensibilidade Testes agudos - 48 horas: a sensibilidade dos organismos utilizados nos testes de toxicidade é avaliada mensalmente por meio de testes com a substância-referência 7
cloreto de potássio, e as respostas são dadas em termos de CL50 ou CE50, que significam a concentração do agente tóxico que causa letalidade (CL50) ou, no caso da Daphnia similis, imobilidade (CE50) a 50% dos organismos-teste. Os valores desses resultados devem encontrar-se no intervalo delimitado por mais ou menos duas vezes o desvio padrão em relação aos valores médios obtidos anteriormente para a mesma espécie. 2.3 - Pseudokirchineriella subcapitata 2.3.1- Síntese do teste de toxicidade O teste consiste em avaliar a inibição do crescimento algáceo das amostras ambientais comparado com o controle. Quanto menor o crescimento do organismo-teste (Pseudokirchineriella subcapitata) em relação ao controle, mais tóxico é a amostra. A avaliação da toxicidade foi feita utilizando o Teste de Dunnett. 2.3.2 - Cultivo dos organismos-teste Os exemplares iniciais para o cultivo de Pseudokirchineriella subcapitata foram obtidos das culturas-estoque mantidas no Laboratório de Ecotoxicologia e Ecofisiologia de Organismos Aquáticos do Centro de Recursos Hídricos e Ecologia Aplicada (CHREA-USP). 2.3.3 - Testes de sensibilidade Como uma prática recomendada para avaliar as condições fisiológicas do organismo-teste, mensalmente são realizados testes de sensibilidade com culturas de P. subcapitata. Como substância de referência, é utilizado o cloreto de sódio (NaCl), baseado na NBR 12648 (ABNT 2005). Ainda será elaborada uma carta-controle, com cerca de 20 resultados de sensibilidade para a espécie. 8
2.3.4 - Testes de toxicidade em amostra ambiental Foram realizados testes de toxicidade crônica com as amostras ambientais. Essas amostras foram enriquecidas com as soluções do meio oligo (solução nutritiva) para que não houvesse diferença na concentração de nutrientes entre o controle e os tratamentos. Essas soluções nutritivas são necessárias para o crescimento do organismo-teste. 2.3.5 Materiais e Métodos 2.3.5.1 - Teste de toxicidade com Pseudokirchineriella subcapitata Células de P. subcapitata, na fase exponencial de crescimento, foram expostas, por um período de 72 horas, à amostra ambiental. O experimento foi realizado em triplicata usando frascos de policarbonato com 250 ml de capacidade, contendo 100 ml da solução-teste. A solução teste é composta de inóculo (suspensão algácea), meio oligo e a amostra ambiental (coletadas nos pontos de 1 a 9). Os frascos foram colocados em uma mesa agitadora com velocidade de agitação de 100 a 175 rpm e sob iluminação e temperatura controladas, 4000 lux e 20 C 2ºC, respectivamente. Alíquotas de 2 ml foram obtidas dos testes de toxicidade após 72 horas. As amostras destinadas à contagem das células foram fixadas com solução de lugol e contadas no microscópio ótico com auxílio da câmara de Neubauer. 2.3.6 - Tratamento dos dados obtidos A partir dos dados obtidos utilizou-se o programa Toxtat para se fazer o Teste de Dunnett, que compara o controle com cada tratamento, classificando a amostra como tóxica ou não tóxica. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Daphnia similis 3.1.1 - Validade dos resultados 9
O valor de CE50, 48 obtido no teste de sensibilidade foi 586,6 mg KCl.litro -1. Como o intervalo de confiança, com um nível fixo de erro de 5%, encontra-se entre 373,72 e 638,11 mg KCl.litro -1 (limites estabelecidos na carta-controle da espécie), os resultados dos testes efetuados são válidos. 3.1.2 - Testes de toxicidade aguda Amostra Água Sedimento Imobilidade Resultado Imobilidade Resultado (%) (%) Controle 0 ------------------ 0 ------------------ P1 24 Não tóxico 13 Não tóxico P2 40 Toxicidade aguda 0 Não tóxico P3 100 Toxicidade aguda 20 Não tóxico P4 100 Toxicidade aguda 0 Não tóxico P5 100 Toxicidade aguda 75 Toxicidade aguda P6 5 Não tóxico 0 Não tóxico P7 0 Não tóxico 100 Toxicidade aguda P8 75 Toxicidade aguda 88 Toxicidade aguda P9 10 Não tóxico 43 Toxicidade aguda Tabela 2. Porcentagens de imobilidade de Daphnia similis expostas às amostras de água e de sedimento. De acordo com a análise estatística de Fisher, os pontos de coleta 2, 3, 4, 5 e 8 revelaram diferença significativa em relação ao controle para Daphnia similis expostas às amostras de água, com maiores valores de imobilidade para os pontos 3, 4 e 5, os quais correspondem a 100%. Ainda conforme a análise estatística de Fisher, verificou-se que os valores do bioensaio de toxicidade aguda com amostras de sedimento para os pontos de coleta 5, 7, 8 e 9 apresentaram diferença significativa em relação ao controle, sendo registrado o maior valor de imobilidade para o ponto 7 (100%). Os três últimos pontos estavam localizados na área da Represa do Lobo e podem ter apresentado toxicidade no sedimento devido ao fato de água encontrar-se parada, com condições para os poluentes sedimentarem-se. 10
Os contaminantes lançados na água podem ser adsorvidos ou ligar-se ao material particulado e, dependendo das características do corpo d água, depositam-se e podem se tornar parte do sedimento de fundo desses ambientes (VIGANÓ et al., 2003). Os contaminantes ligados ao sedimento podem tornar-se disponíveis na coluna d água dependendo das características físicas e químicas do ambiente. Ao se compararem os resultados das amostras de água e de sedimento para cada ponto de coleta, observa-se que os pontos 2, 3 e 4 apresentam toxicidade aguda apenas para a água, enquanto os pontos 7 e 9 têm apenas seus sedimentos com toxicidade aguda. 3.2 - Pseudokirchineriella subcapitata Contaram-se as células e calculou-se sua densidade através da seguinte fórmula: Densidade (células/ml) = Número de células contadas / Número de quadradinhos x 4 x 10-6 Por meio do teste de Dunett, pôde-se constatar que a diferença máxima entre uma amostra não tóxica e o controle é de 46,165 células ou 13,6% em relação ao número de células do controle. A seguir, os valores foram submetidos ao programa Toxtat. Grupo Identificação Número de réplicas Diferença mínima significativa (no número de organismos) Porcentagem Diferença em relação ao controle 1 Controle 3 2 Ponto 1 3 46.165 13.6 201.667 3 Ponto 2 3 46.165 13.6 164.667 4 Ponto 3 3 46.165 13.6 34.333 5 Ponto 4 3 46.165 13.6 238.333 6 Ponto 5 3 46.165 13.6 189.333 7 Ponto 6 3 46.165 13.6 80.667 8 Ponto 7 3 46.165 13.6 248.667 9 Ponto 8 3 46.165 13.6 214.000 10 Ponto 9 3 46.165 13.6 235.333 Tabela 3. Valores apresentados pelo Toxtat. 11
A partir da Tabela 3, pode-se observar que apenas o ponto 3 não é tóxico, pois a diferença entre o número de células do controle e da amostra deste ponto (34,333) é menor que 46,165. Sendo assim, os pontos 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 e 9 apresentam toxicidade. 3.3 COMPARAÇÃO ENTRE OS RESULTADOS Amostra Daphnia similis Imobilidade (%) P1 24 P2 40 P3 100 P4 100 P5 100 P6 5 P7 Zero P8 75 Resultado Não Tóxico Toxicidade aguda Toxicidade aguda Toxicidade aguda Toxicidade aguda Não Tóxico Não Tóxico Toxicidade aguda Pseudokirchineriella subcapitata Crescimento em relação ao Resultado controle (%) 59.41 Tóxico 48.59 Tóxico 10.38 Não Tóxico 70.36 Tóxico 56.07 Tóxico 23.46 Tóxico 73.39 Tóxico 63.27 Tóxico Não P9 10 69.61 Tóxico Tóxico Tabela 4. Comparação entre os resultados de testes de toxicidade em água. Analisando-se os resultados para Daphnia similis e Pseudokirchineriella subcapitata, verifica-se que as amostras dos pontos 2, 4, 5 e 8 foram tóxicas a ambos os organismos. No ponto 2, a presença de um condomínio no entorno pode ter alterado de alguma forma a qualidade da água no local, apresentando toxicidade para os dois organismos. O ponto 4 localiza-se na confluência dos córregos Água Branca e Limoeiro. No córrego Água Branca, havia o lançamento do esgoto da cidade de Itirapina e de duas penitenciárias, o que explica a toxicidade nesse local. O ponto 5 e 12
ponto 8 estavam localizados no Ribeirão do Lobo. Nesse local não foi encontrada nenhuma explicação para a toxicidade apresentada. Portanto, comparando-se os resultados obtidos nos testes de toxicidade utilizando D. similis e P. subcapitata, verificou-se a importância de se estudar espécies de distintos níveis tróficos, uma vez que diferentes sensibilidades foram apresentadas por essas espécies quando expostas às amostras. 4 - CONCLUSÃO O impacto gerado pelas atividades desenvolvidas na área de entorno, bem como pelos tributários, pode ser verificado nos resultados da maioria dos ensaios de toxicidade para os pontos de coleta da bacia do Rio Itaqueri (SP). Nas amostras de água, por exemplo, foi constatada toxicidade em todos os pontos para, pelo menos, uma das três espécies estudadas. Sendo assim, há contaminantes prejudiciais a esta espécie no local, outros tipos de contaminantes que possuem efeito deletério a outra espécie em outro ponto de coleta e, em alguns locais, até mesmo substâncias prejudiciais a todas. Ou seja, todos os pontos apresentaram algum tipo de toxicidade. As amostras de sedimento, por sua vez, apresentam toxicidade para a maioria dos locais de coleta (as únicas exceções são os pontos 1, 2 e 6). Da mesma forma que as amostras de água, há contaminantes que causam efeito para uma ou outra espécie nos diferentes pontos de amostragem. Por fim, estudos direcionados especificamente para a análise das substâncias deletérias se fazem necessários nos locais que apresentaram toxicidade para, posteriormente, realizarem-se corretamente a gestão e a remediação das áreas impactadas. 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 13
ABNT 2004. NBR 12713. Ecotoxicologia aquática. Toxicidade aguda. Método de ensaio com Daphnia ssp (Crustacea, Cladocera). Rio de janeiro, 21p. ABNT 2005. NBR 12648. Ecotoxicologia aquática. Toxicidade crônica. Método de ensaio com algas (Chlorofyceae). Rio de Janeiro, 24p. BURTON, G.L.; MACPHERSON, C. 1995. Sediment toxicity testing issue and methods. IN: HOFFMAN, D.J., et. al. Handbook of ecotoxicology. Boca Raton, Lewis Publishers. Cap.5. VIGANÓ, L. ; ARILLO, A. ; BUFFAGNI, A. ; CAMUSSO, M. ; CIANNARELLA, R. ; CROSA, G. ; FALUGI, C. ; GALASSI, S. ; GUZELLA, L. ; LOPEZ, A. ; MINGAZZINI, M. ; PAGNOTTA, R. ; PATROLECCO, L. ; TARATARI, G. ; VALSECCHI, S. (2003). Quality assessement of bed sediment of the Pó river (Italy). Water Res., vol. 37. 14