AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DO FÁRMACO CLORIDRATO DE FLUOXETINA SOBRE O ORGANISMO DAPHNIA SIMILIS.
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1 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DO FÁRMACO CLORIDRATO DE FLUOXETINA SOBRE O ORGANISMO DAPHNIA SIMILIS. Flávia Junqueira de Castro*, Dominique M. de Almeida Moura*, Fernando Sanzi Cortez**, Aldo Ramos Santos**, Augusto César** * Acadêmicas da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade Santa Cecília (UNISANTA), ** Professores orientadores RESUMO. Recentemente muitos estudos têm identificado diferentes classes de fármacos, como analgésicos, antibióticos e antidepressivos, em diferentes matrizes ambientais como água superficial, efluentes de ETE s, bem como em sedimentos. Neste sentido, é de suma importância o emprego de testes de toxicidade para se obter o conhecimento sobre as concentrações que tem potencial para causar efeitos adversos aos organismos aquáticos. A fluoxetina é um antidepressivo muito prescrito, o qual tem sido identificado em diversos efluentes urbanos, constituindo assim, uma importante rota para o ambiente aquático. Neste estudo, foi avaliada a toxicidade da fluoxetina através de testes de toxicidade aguda, com o organismo-teste Daphnia similis. Os resultados obtidos por este estudo, demonstram um valor médio da CE50 (48) para essa espécie de cladócero de 4,41mg/L -1.Os efeitos dos fármacos, especialmente para a biota aquática, ainda são pouco conhecidos e ocorrerem em baixas concentrações (na ordem de µg/l -1 a mg/l -1 ). Palavras-chave. Fluoxetina; Teste de toxicidade aguda, Daphnia similis. Introdução O monitoramento de substâncias farmacêuticas residuais em matrizes ambientais têm sido abordado em vários trabalhos de pesquisas desde o final da década de 90, tornando-se um tema bastante discutido devido ao fato de muitas dessas substâncias serem freqüentemente encontradas em efluentes de estações de tratamento de esgotos (ETE s), águas de abastecimento (ETA s) e em outras matrizes ambientais tais como solo, sedimento e águas naturais em concentrações na faixa de µg/l -1 e ng/l -1. As grandes preocupações da presença destes fármacos residuais na água são os potenciais efeitos adversos para a saúde humana, animal e de organismos aquáticos (1;4). Pesquisas recentes têm demonstrado que múltiplas classes de fármacos têm sido encontrados em efluentes municipais (2; 3; 4). Segundo Bertoletti (5) a ecotoxicologia vêm estudando o comportamento e as transformações de agentes químicos no ambiente, assim como seus efeitos sobre os organismos vivos. Sendo assim para identificar os efeitos dessas substâncias sobre a biota Página 155
2 aquática, tem se utilizado nessas ultimas décadas, testes de toxicidade com organismos de águas continentais, estuarinas e marinhas, em condições laboratoriais e/ou de campo. Tais testes têm permitido estabelecer limites permissíveis para várias substâncias químicas e, ainda se avaliar o possível impacto de misturas de poluentes sobre os organismos aquáticos dos corpos receptores. As principais aplicações para os testes de toxicidade são as avaliações dos riscos potenciais de substancias químicas ao meio ambiente, o monitoramento da qualidade das águas superficiais e subterrâneas, a fiscalização de efluentes, a identificação de fontes poluidoras e a investigação de sinergismos e antagonismos de substâncias (5). Historicamente se conhece a contaminação por agentes biológicos tais como bactérias, vírus e parasitas, assim como há grande conhecimento sobre os problemas causados pelos contaminantes clássicos, como por exemplo, os metais pesados, HPA`s, DDT, etc. No entanto, os efluentes municipais tem se destacado como uma fonte dos chamados compostos químicos emergentes e/ou micropoluentes, como os fármacos e os produtos de higiene e cuidados pessoais (3). O constante progresso da medicina faz com que novas drogas e novos compostos ativos sejam disponibilizados para o consumo humano e animal constantemente. Os produtos farmacêuticos já representam mais de moléculas em especialidades diferentes (6). Segundo Mulroy (7), em uma dosagem de fármaco, 50% a 90% são excretados inalterados e estes tendem a se acumular no ambiente, pois são desenvolvidos para serem persistentes, mantendo suas propriedades químicas o bastante para servirem a um propósito terapêutico. Este fato eleva o mérito das investigações, já que estes têm potencial para bioacumular e biomagnificar através dos níveis tróficos (3). O cloridrato de fluoxetina tem sido um dos antidepressivos mais prescritos atualmente, podendo ser encontrado sob diversas formas farmacêuticas, como em comprimidos, cápsulas e soluções. A fluoxetina é um antidepressivo inibidor da recaptação da serotonina, muito similar aos antidepressivos tricíclicos clássicos, porém, usada em doses menores que estes (9). Brooks (2) realizou um estudo sobre a toxicidade da fluoxetina, no qual a média da LC50 para os cladóceros, Ceriodaphnia dúbia, Daphnia magna e para o peixe Pimephales promelas foram de 234 µg/l-1, 820 µg/l-1 e 750µg/L-1, respectivamente. O crescimento de algas (Pseudokischneriella subcapitata) e a fertilidade de Ceriodaphnia dúbia diminuíram com o tratamento de fluoxetina à 14µg/L-1, e 750 µg/l-1 respectivamente. A LC50 média estimada para Chironomus tentans foi de 15,2 mg/kg. Já a sobrevivência de Hyalella azteca não foi afetada por exposições a concentrações acima de 43mg/Kg de fluoxetina no sedimento. Estes estudos indicaram que a fluoxetina apresenta a possibilidade de causar danos sobre os organismos que habitam o sedimento e/ou a coluna d água. A diretiva 93/67/EEC da União Européia contempla a realização de ensaios ecotoxicológicos para estimar o perigo potencial de substâncias químicas dentre elas os fármacos. No estudo realizado por Blaise (3) foi estabelecida uma nomenclatura para o enquadramento de substâncias químicas quanto à toxicidade baseado em resultados de testes de toxicidade. Os níveis de toxicidade estabelecidos foram: extremamente tóxicos (concentrações menores 0,1mg/L), muito tóxicos (0,1 a 1mg/L), tóxicos(1 a 10mg/L), nocivos (10 a 100mg/L) e não tóxicos (concentrações maiores 100mg/L). Desta forma, o desenvolvimento de estudos ecotoxicológicos se torna cada vez mais importante, para determinar a toxicidade dos fármacos e determinar o risco potencial para biota aquática. Nesse sentindo o principal objetivo Página 156
3 deste estudo foi avaliar o efeito agudo do fármaco cloridrato de fluoxetina através de testes de toxicidade com Daphnia similis (Cladocera, Crustácea). A partir dos resultados obtidos determinar em qual classe da nomenclatura estabelecida por Blaise (3) este composto se enquadra. Além disso, estabelecer limites de concentrações seguras para a fluoxetina que possam ser inseridos em futuras legislações. Materiais e Métodos Teste de toxicidade - O método utilizado neste estudo consistiu na exposição do organismo Daphnia similis (Cladocera, Crustacea), conforme a ABNT NBR 12713/2004 (8). Para a preparação da solução estoque com fluoxetina 0,01mg deste fármaco foi dissolvido em 0,5ml de acetona, e posteriormente diluída em água para cultivo de D. similis em um balão volumétrico de 1000ml. A partir desta solução foram preparadas as seguintes concentrações 2,8mg/L; 3,4mg/L; 4,1mg/L; 5,0mg/L; 6,0mg/L; 7,1mg/L e 8,6mg/L, em paralelo, foram preparados dois controles, um contendo água para o cultivo e o outro contendo o solvente (acetona). Com essas soluções, com o auxilio de uma pipeta automática, foram colocados 10mL em cada tubo de ensaio com quatro réplicas para cada concentração. Em cada tubo de ensaio foram colocadas cinco neonatas e os experimentos foram mantidos em uma câmara de germinação com fotoperíodo (12/12hs) por 48horas. Em paralelo aos experimentos foram realizadas análises físico-químicas, confirme descrito pela norma. Cloridrato de fluoxetina - A fluoxetina ((±)-N-metil-Ɣ[4- trifluorometil)pentox) benzopropamina]hidrocloridrico) se apresenta na forma de um pó branco cristalino, inodoro, com ph entre 4,5 e 6,5, levemente solúvel em água, parcialmente solúvel em éter e ligeiramente solúvel em diclorometano (10). Terapeuticamente este medicamento é utilizado como antidepressivos, atibulímicos e antiobesidades (11). Análises estatísticas - O tratamento estatístico dos dados foi realizado através do método de Trimmed Spearman-Karber, Versão 1.5 (12), com o qual se determinou a CE50(48), ou seja, a concentração efetiva que causa imobilidade e/ou mortalidade em 50% dos organismos expostos. Resultados Os resultados dos ensaios realizados para o fármaco fluoxetina apresentou a CE50(48) entre 4,06mg/L e 5,01 mg/l conforme mostram os dados expressos na tabela 1. A figura 1 apresenta a média de sobrevivência dos organismos nas diferentes concentrações. Os resultados das analises físico-químicas finais (ph e OD) estiveram dentro dos limites estabelecidos pela norma, não interferindo nos resultados finais. Tabela 1 Média da CE50(48) nos três testes e o respectivo intervalo de confiança (95%) com desvio padrão e coeficiente de variação. De acordo com as tabelas abaixo podemos observar que há grande variação no número de poros de Ampolas de Lorenzini com relação a ontogenia e sexo. Entre os sexos foi observada uma variação pequena, diferentemente da ontogenia onde constata-se que a quantidade de poros aumenta conforme o desenvolvimento do animal. Página 157
4 Experimentos CE50(48) (mg/l) Intervalo Confiança 95% Teste 1 4,06 3,28-5,03 Teste 2 4,16 3,52-4,93 Teste 3 5,01 4,23-5,92 Média 4,41 3,67-5,29 Desvio Padrão 0, ,49-0,54 CV (%) 11,83707% 13,43% 10,29% de 20 FLUOXETINA 15 Sobrvivência média Cointrole 2,8 3,4 4,1 5,0 6,0 7,2 8,6 10,0 Concentrações testadas Figura 1 O gráfico apresenta o n de organismos sobreviventes para cada concentração. Discussão A média dos resultados obtidos neste trabalho (CE50(48)) para o cladócero D. similis foi de 4410µg/L -1, este resultado demonstrou uma menor sensibilidade para essa espécie quando comparado ao estudo realizado por Brooks (2), onde a média da CE50(48) para os cladóceros, Ceriodaphnia dúbia e Daphnia magna foram de 234 µg/l-1 e 820 µg/l-1 respectivamente. A diretiva 93/67/EEC da União Européia tornou obrigatório o desenvolvimento de estudos para caracterização da toxicidade de substâncias químicas antes que as mesmas sejam inseridas no mercado, de forma a gerenciar os riscos existentes. Baseado nesta diretiva, Blaise (3) desenvolveu uma escala de toxicidade para diferentes compostos químicos emergentes classificando-os como: extremamente tóxicos (concentrações < 0,1 mg/l -1 ), muito tóxicos (0,1 a 1mg/L -1 ), tóxicos(1 a 10 mg/l -1 ), nocivos (10 a 100 mg/l -1 ) e não tóxicos (>100mg/L -1 ). De acordo com a média de CE50(48) (4,41mg/L -1 ) obtida neste estudo, podemos classificar o fármaco, cloridrato de fluoxetina, um elemento tóxico. Portanto este composto que é encontrado em diversos efluentes em muitas partes do mundo, revelou-se capaz de causar danos, Página 158
5 Anais do Congresso Brasileiro de Iniciação Científica COBRIC mesmo quando encontrado em baixas concentrações, evidenciando a necessidade de um melhor controle e monitoramento dessa substância nos ecossistemas aquáticos. Apesar das Ampolas de Lorenzini serem um dos órgãos mais estudados em elasmobrânquios, são restritas as informações sobre o número de poros em tubarões, principalmente em Rhizoprinodon lalandii, o qual não foi encontrado nenhum trabalho do gênero. Este trabalho foi realizado com intenção de abrir caminhos para pesquisas mais específicas sobre o assunto, a diferença da quantidade de poros pode estar relacionada com a forma de predação, habitat e acasalamento, mas para afirmar isso seria necessário mais estudos para determinar quais são os fatores que influem nesse caráter. Conclusão De acordo com os resultados dos testes de toxicidade com Daphnia similis para o fármaco cloridrato de fluoxetina, verificou-se que o mesmo se enquadra como um composto tóxico segundo a nomenclatura de Blaise(3), portanto este fármaco apresenta um potencial de risco ao meio ambiente. Desta forma, se faz necessário o desenvolvimento de estudos, com o intuito de gerar um conhecimento mais profundo sobre os possíveis efeitos adversos que este fármaco pode causar a biota aquática devido a sua toxicidade. O estabelecimento das concentrações de efeito observado e não observado, pode subsidiar futuras legislações que visem regulamentar os diferentes compostos emergentes. Referências Bibliográficas PONEZI,A.N; DUARTE,M.C.T, CLAUDINO,M.C. Fármacos em Matrizes Ambientais - Resumos CPQBAUNICAMP BOORKS,W.B., TURNER,K.P. et al. Waterborne and Sediment Toxicity of Fluoxetine to Select Organism Jan., BLAISE,C., GAGNÉ,F., EULLAFFROY,P., FÉRARD,J.F. Ecotoxicity of Selected Pharmaceuticals of Urban Origin Discharged to the Saint-Lawrence River (Québec, Canada): A Review BILA,D.M; DEZOTTI,M Química Nova vol.26 n.4 São Paulo July/Aug BERTOLETTI,E., ZAGATTO,P.A; Ecotoxicologia Aquática Princípios e Aplicações ; Rima BEAUSSE,J. Pharmaceuticals - horizontal 26 July MULROY, A., Water Environ. Technol. 2001, 13, 32. CETESBE, Desenvolvimentos de Métodos para o Estabelecimento de Critérios Ecotoxicologicos. Relatório Final, Vol. 1, 174p. São Paulo. MARTINDALE The Extra Pharmacopeia. 30 ed. London: Pharmaceutical Press, SAÚDE, MINISTÉRIO DA - Farmacopéia Brasileira 3 - Andrei 11. Farmacopéia Portuguesa 8 - Instituto Nacional da Farmácia e do Medicamento Página 159
6 Anais do Congresso Brasileiro de Iniciação Científica COBRIC Environmental Science e Techology, 18/08/2009. Página 160
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