Procedimento Complementar para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos usando Análise de Regressão Linear Rogério Antonio de Oliveira 1 Chang Chiann 2 1 Introdução Atualmente, para obter o registro de um medicamento genérico o laboratório farmacêutico precisa seguir as regulamentações vigentes e conduzir um estudo de biodisponibilidade/bioequivalência, que consiste em realizar as três etapas: clínica, analítica e estatística. A etapa clínica é responsável pelo recrutamento e seleção de voluntários, internação e coleta das amostras biológicas, plasma ou urina, segundo cronograma de tempos previamente estabelecidos em protocolo. As amostras coletadas são quantificadas pela etapa analítica e, para este fim, desenvolve um método analítico e bioanalítico apropriado para quantificar as concentrações do fármaco a ser estudado. A partir das curvas de concentrações ao longo do tempo dos voluntários, a etapa estatística realiza as análises estatísticas mais adequadas para o conjunto de dados, de acordo com o planejamento experimental adotado e considerando todas as informações das etapas anteriores. Durante a quantificação do princípio ativo nas amostras coletadas na etapa analítica, um método de quantificação bioanalítica é desenvolvido para as características do fármaco a ser estudado. No entanto, esta metodologia precisa ser validada segundo alguns critérios que estabelecem a qualidade dos valores quantificados nas amostras biológicas. Durante o processo de validação, a análise estatística é fundamental em diversos procedimentos. A análise de regressão é uma metodologia empregada no estudo da linearidade das quantificações e extremamente importante na determinação das concentrações nas amostras. Entretanto, uma forma de contribuir na validação de um método bioanalítico pode ser a realização de testes para a comparação dos modelos de regressão de outros métodos diferentes para a quantificação de um mesmo fármaco e, assim, validar o método desenvolvido e proposto pelo laboratório analítico. 2 Material e métodos A análise de regressão é uma metodologia estatística frequentemente utilizada para avaliar a relação entre uma variável resposta e uma ou mais variáveis independentes, regressoras ou preditoras. Este tipo de relação pode ser linear ou não linear, dependendo do conjunto de dados analisados e da área de pesquisa. Neste trabalho, considera-se que as relações entre as 1 UNESP IB Depto. Bioestatística Botucatu. e-mail: Rogério@ibb.unesp.br 2 IME -USP - Depto Estatística. 1
variáveis são lineares. Com intuito de obter linearidade dos dados analisados, pode-se propor alguma transformação matemática, por exemplo, a logarítmica, para tornar a relação mais próxima da linearidade.considere a variável resposta Y e um conjunto de variáveis regressoras X i, i =1, 2..., n que são medidas em um conjunto composto de grupos distintos. Assume-se que a relação entre Y e as k variáveis regressoras X é próxima da linearidade. O modelo de regressão linear múltipla na forma matricial pode ser expresso como Y = Xβ + ε, (1) Y: vetor de observações, nx1, n representa o numero de observações totais; X : matriz das variáveis explicativas de n x (k+1), k é o número de variáveis regressoras ou preditoras; β: vetor de parâmetros (k+1) x 1; ε: vetor de erros aleatórios n x 1. Sob a pressuposição de normalidade dos erros ε, a estimação do vetor de parâmetros β é encontrada pelo método de mínimos quadrados ou pelo método de máxima verossimilhança, que fornecem os mesmos resultados. De acordo com a análise dos resíduos do modelo ajustado e pressuposição sobre o comportamento dos erros, pode existir alguma variação no método de estimação dos mínimos quadrados para o modelo de regressão, por exemplo, o emprego do uso do método de mínimos quadrados ponderados. Caso necessário, pode-se empregar alguma transformação nas variáveis estudadas, por exemplo, a logarítmica com intuito de obter uma distribuição simétrica e próxima da normal para os resíduos do modelo de regressão. O estudo dos modelos de regressão na etapa analítica está ligado à linearidade, que é representada pela relação entre a resposta do equipamento de medição e a concentração conhecida do analito na amostra padrão, considerando uma faixa determinada pela menor e pela maior concentração. Segundo regulamentação vigente, para construir uma curva de calibração para quantificar as amostras de um determinado fármaco, deve-se utilizar a mesma matriz biológica proposta no estudo e incluir a análise de uma amostra branco (matriz isenta de padrão do fármaco e do padrão interno), de uma amostra zero (matriz biológica fortificada com o padrão interno) e de, no mínimo, 6 amostras contendo o padrão do fármaco e o padrão interno, aplicando os critérios analíticos de aceitação. Recomenda-se utilizar o modelo mais 2
simples que descreva adequadamente a relação entre a concentração e a resposta do equipamento de medição. Geralmente o modelo de regressão linear é o mais utilizado e, durante a construção da curva de calibração, pode-se empregar algum tipo de ponderação (1/concentração ou 1/concentrações 2 ) ou alguma transformação, por exemplo, a logarítmica para melhorar a relação linear entre concentração-resposta. A utilização de um modelo não linear pode ser aplicada, desde que seja apresentada uma justificativa para o uso e sejam empregados um maior número de pontos de concentrações na construção da curva de calibração. Para realizar a comparação de alguns modelos de regressão, pode-se utilizar variáveis fictícias, denominadas frequentemente pela literatura como variáveis dummy ou indicadoras. Estas variáveis assumem valores binários, ou seja, tomam valores 0 ou 1, que facilitam a identificação de grupos no conjunto de dados. Desta forma, pode-se avaliar por testes estatísticos cada um dos casos: i) interceptos diferentes, mas inclinação igual; ii) interceptos iguais, com inclinações diferentes; iii) interceptos e inclinações diferentes e iv) interceptos e inclinações iguais. Desta forma, diferentes modelos de regressão linear encontrados na validação de dois ou mais métodos analíticos desenvolvidos por laboratórios analíticos diferentes para a quantificação das amostras de um mesmo fármaco podem ser comparados entre si e, caso as diferenças observadas não apresentem diferença estatisticamente significante, as conclusões podem ajudar na validação dos métodos analíticos empregados na etapa Analítica. 3 Resultados e discussões Com o intuito de analisar dados reais, considere as metodologias analíticas para quantificar as concentrações de 4-nerolidilcatecol (4-NC), uma substância com comprovada ação antioxidante in vitro e in vivo, cuja metodologia de quantificação foi apresentada por Ropke et al. (2003). As concentrações de 4 NC foram quantificadas empregando a solução água: etanol (1:1) e também apenas etanol para ressuspender o princípio ativo após o processo de extração. As validações das duas metodologias foram realizadas utilizando as orientações do Guia para validação de métodos analíticos (ANVISA, 2002). A Tabela 1 apresenta os valores encontrados para algumas concentrações de 0,156 a 2,5 μg/ml de 4-NC dissolvido em etanol e etanol:água. A Figura 1 mostra alguns cromatogramas e as duas retas das metodologias analíticas de 4-NC utilizando o solvente etanol com ou sem acréscimo de água. 3
Tabela 1: Dados da reta de calibração de 4 NC dissolvido em etanol e etanol:água Dissolvido etanol:água(1:1) Dissolvido etanol Lichrosolv Concentração (μg/ml) Média da área do pico* Desvio padrão Média da área do pico* Desvio padrão 0,156 38911 10727 36630 7488 0,313 94598 13126 72341 5506 0,625 202265 28458 180395 4769 1,25 392632 17989 367053 13287 2,5 795876 58313 818386 26104 Regressão Linear y = 320944 conc -6074,5 y = 335051conc - 29636 Simples r=99,9% r=99,8% *média de no mínimo 6 injeções para os 6 valores de concentrações de interesse Figura 1: Cromatograma do padrão de 4-NC em etanol:água na concentração de 0,625μg/ml (A), na concentração de 2,5 μg/ml (B) e retas de calibração no intervalo de 0,156 a 2,5 μg/ml de 4-NC. Tabela 2: Estimativas dos parâmetros dos modelos de regressão ajustados Modelo Regressão Linear Ponderada (1/x 2 ) Parâmetro Estimativa D Padrão T valor p Estimativa D Padrão T valor p βo -6074 8266-0,730 0,490-5320 11301-0,470 0,654 β1 320944 6406 50,100 0,000 320396 5051 63,430 0,000 β2-23562 11691-2,020 0,090-54698 15981-3,420 0,014 β12 14107 9060 1,560 0,170 30539 7144 4,270 0,005 Utilizou variável fictícia para a variável metodologia de quantificação com etanol:água igual a 1 e 0, caso contrário. Para comparar a coincidência dos modelos para as duas metodologias, ajustou-se o modelo de regressão linear: valor do pico (y) = β 0 + β 1 concentração+ β 2 metodologia+ β 12 concentração*metodologia + erro e os parâmetros estimados estão apresentados na Tabela 2. No entanto, pela análise dos resíduos para o modelo ajustado (Figura 2), observa-se que as variâncias dos erros não eram constantes e aumentam com os valores das concentrações, a variabilidade dos dados parece ser bem alta. Portanto, optou-se pelo ajuste do modelo de regressão ponderada (1/x 2 ), cujos parâmetros 4
resíduos estimados estão apresentados na Tabela 2. Por meio da análise dos resíduos, notou-se que os erros estavam distribuídos aleatoriamente em torno de zero e houve uma certa diminuição na variabilidade dos resíduos (Figura 2. Para testar a coincidência dos dois modelos, é necessário testar os parâmetros β 2 e β 12, que correspondem à igualdade de intercepto e a de inclinação, respectivamente. Pelo valor p dos testes dos interceptos, pode-se ser que apresentam diferenças significativas, logo os dois modelos de regressão para as metodologias de quantificação de 4-NC são diferentes. O método analítico, que utiliza o solvente etanol:água, apresenta maior confiabilidade no processo de quantificação das concentrações porque a solução e menos volátil que a quantificação utiliza apenas etanol. 2 Modelo linear ponderado 1 0-1 -2 0,0 0,5 1,0 1,5 concentração 2,0 2,5 Figura 2: Gráfico de dispersão dos resíduos dos modelos de regressão ajustados 4 Conclusões Este procedimento de teste estatístico pode ser utilizado para complementar o processo de validação de metodologias analíticas apresentadas por diferentes laboratórios analíticos para a quantificação de um mesmo princípio ativo. Um estudo sobre diferentes distribuições assimétricas para os erros pode ser bastante útil para investigar como as distribuições dos erros podem ser empregadas para dados provenientes de quantificações de concentrações. 5 Bibliografia [1] CHOW, S.C.; LIU, J-P. Design and Analysis of Bioavailability and Bioequivalence Studies. New York: Marcel Dekker. 2000. [2] DRAPER, N. R.; SMITH, H.; Applied Regression Analysis. New York: Wiley, 1981. [3] DOQ-CGCRE 008, Orientações sobre validação de métodos de ensaios químicos, revisão 1, INMETRO, março/2003. [4] ROPKE, C.D.; et al; Validação de metodologias analíticas para determinação quantitativa de α-tocoferol e 4-nerolidilcatecol, Rev. Bras. Cienc Farmacoc, 39, n.2, 2003. 5