OBTENÇÃO DE ETANOL A PARTIR DE DERIVADOS DO PROCESSAMENTO DO EUCALIPTO PARA PRODUÇÃO DE CELULOSE POR SACARIFICAÇÃO E FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEAS Alice de Tassis Machado, 2 Teresa Cristina Zangirolami, 3 Wellington Sabino Adriano Bolsista de Iniciação Científica FAPESP discente do curso de Engenharia Química 2 Professora da Universidade Federal de São Carlos, Departamento de Engenharia Química 3 Pós-doutorando na Universidade Federal do Ceará, Departamento de Engenharia Química,2 Rodovia Washington Luís, km 23 - SP-3 - São Carlos - SP - Brasil CEP 36-9 3 Avenida Humberto Monte S/N - Bloco 79, Pici, Fortaleza, CE Brasil CEP 64-76 e-mail: teresacz@ufscar.br RESUMO Neste trabalho, estudou-se a obtenção de etanol a partir de derivados do processamento de eucalipto para produção de celulose. Foram empregadas como fonte de biomassa polpa de celulose branqueada e serragem. Ambos derivados foram submetidos a dois tipos de pré-tratamentos para remoção de hemicelulose e lignina. A remoção da hemicelulose foi realizada em duas condições: à temperatura ambiente ou a 2 C, condição na qual foram obtidos os melhores resultados. Posteriormente, o material foi submetido à hidrólise com hidróxido de sódio para remoção de lignina, a 2 C. O meio utilizado nos experimentos SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation) consistia em extrato de levedura, sais, substratos obtidos após pré-tratamentos (gms/l de meio) e enzimas celulolíticas comerciais CELLUCLAST (3 e 6FPU/g de substrato) e NS (2 e 4CBU/g de substrato). Os experimentos foram realizados a 37 C e ph inicial, sob condições anaeróbias. Para os ensaios SSF, a concentração de etanol obtida foi de aproximadamente 4g/L com a polpa de celulose (com 6 FPU/g substrato de Celluclast e 4CBU/g de substrato de NS) e 3g/L com a serragem (com 3FPU/g substrato de Celluclast e 2CBU/g substrato de NS). Estes valores foram alcançados a- pós aproximadamente 2 horas de cultivo, devido à baixa disponibilidade de glicose. Palavras-Chave: eucalipto, etanol, SSF INTRODUÇÃO A biomassa de origem vegetal é, atualmente, a única fonte sustentável de carbono orgânico. Assim, apenas os biocombustíveis, ie, os combustíveis derivados de biomassa vegetal, são considerados combustíveis líquidos renováveis. Além disso, os biocombustíveis geram significativamente menos emissões de gases causadores do efeito estufa do que os combustíveis fósseis (HUBER et al., 26). O processo de produção de etanol a partir de biomassa lignocelulósica é basicamente composto por três etapas (pré-tratamento, hidrólise e fermentação). As etapas adicionais de tratamento do material são requeridas devido à natureza recalcitrante dos materiais lignocelulósicos, que possuem ligações inter e intramoleculares que fazem com que a hidrólise da celulose seja centenas de vezes mais difícil do que a hidrólise de materiais amiláceos, No Brasil, os estudos da produção de e- tanol a partir da biomassa pela via enzimática têm se concentrado quase que exclusivamente na utilização do bagaço de cana de açúcar como fonte de biomassa (ADRIANO, 28; PEÑUELLA et al., 27). Apesar da importância inquestionável do bagaço, tanto pela quantidade gerada como pela disponibilidade nas regiões já produtoras de etanol, é fundamental que a produção de etanol a partir de outras fontes de biomassa também seja investigada. Essa necessidade se justifica por várias razões: i) melhor aproveitamento da diversidade em resíduos agroindustriais gerados nas diferentes regiões do Brasil; ii) minimização nos custos de transporte e distribuição do etanol, que poderia ser produzido a partir dos resíduos disponíveis in loco; iii) geração de empregos e crescimento da economia local em conseqüência do desenvolvimento da nova atividade produtiva; iv) redução da dependência de uma única fonte de energia alternativa; v) incremento do valor agregado aos resíduos e redução do volume para tratamento e disposição, vii) aproveitamento da ociosidade das usinas no período de entressafra da cana de açúcar; viii) minimização do impacto ambiental da colheita da cana-de-açúcar (emprego das queimadas), optando por culturas que não adotam esta prática. VIII Congresso Brasileiro de Engenharia Química em Iniciação Científica 27 a 3 de julho de 29 Uberlândia, Minas Gerais, Brasil
Desta forma, o presente estudo teve como objetivo estudar a obtenção de hidrolisados a partir da ação de celulases sobre a fração celulósica de subprodutos do processamento do eucalipto para produção de celulose e papel, concomitantemente com a fermentação do hidrolisado obtido utilizando a levedura de panificação prensada (Saccharomyces cerevisiae) - processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF). Enzimas MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizadas preparações enzimáticas Celluclast. L e NS (β-glucosidase pura) doadas pela Novozymes A/S (Bagsvaerd, Denmark). Meios de cultivo Dois meios de cultivo foram empregados: meio de ativação da levedura:, g/l de (NH 4 ) 2 HPO 4,,2 g/l de MgSO 4.7H 2 O,, g/l de extrato de levedura e g/l de glicose; meio dos experimentos SSF: semelhante ao de ativação, com substituição da glicose pelo substrato sólido na proporção de gms para 2 ml de volume total. O ph foi ajustado a, para ambos. Todos os meios foram esterilizados a 2 o C por minutos Microorganismo Foi utilizado o microrganismo Saccharomyces cerevisiae na forma de levedura de panificação comercial prensada, da marca Fleischmann, comercializada em tabletes de 9 g embalados individualmente, dentro do prazo de validade. Pré-tratamento da polpa de celulose e serragem Os pré-tratamentos para polpa de celulose e serragem envolveram etapas de remoção de hemicelulose e lignina. Para a remoção da hemicelulose, os pré-tratamentos foram iniciados pela cominuição. Uma massa de aproximadamente g de serragem seca ou polpa foi triturada em liquidificador e classificada em peneiras da série Tyler padrão (PERRY AND GREEN, 997), para obtenção de fragmentos com dimensões inferiores a mm, os quais foram utilizados nas etapas de hidrólise química para extração de hemicelulose e de lignina. O material classificado foi submetido inicialmente à extração de hemicelulose por hidrólise ácida, sendo utilizados dois prétratamentos para comparação (PTA e PTB). Em PTA (adaptado de SASSNER et al, 28), g de material seco permaneceu imerso em ml de ácido sulfúrico diluído, % (m/m) por 2 horas, sob agitação. Após esse período, os sólidos foram lavados em abundância com água destilada para remoção do excesso de ácido, secos a C, pesados e armazenados a 4 o C. No pré-tratamento PTB para remoção de hemicelulose (adaptado de CARVALHO et al., 2), 22 ml de ácido sulfúrico,3 % foram misturados a g de material seco na granulometria previamente definida. A mistura foi autoclavada a 2 o C por hora e processada, após este período, de acordo com o mesmo procedimento descrito para o pré-tratamento PTA. Para remoção da lignina na serragem foi utilizado o processo de deslignificação alcalina (PT2), conforme descrito em MARTINS (27). O tratamento foi aplicado a uma massa de 2 g do material seco obtido após a extração de hemicelulose por PTA e PTB, o qual foi autoclavado a 2 ºC por 3 minutos, com ml de solução de hidróxido de sódio a 4%. Por meio de uma filtração, o hidrolisado foi separado do material recuperado, neutralizado com ácido fosfórico e NaOH e congelado para análises posteriores de sua composição. Os sólidos foram recuperados por uma nova filtração, secos em estufa a ºC e armazenados a 4 ºC. O procedimento foi realizado em triplicata. Todos os derivados obtidos nos prétratamentos descritos anteriormente foram submetidos a secagem em estufa a C e até umidade residual de 2% em massa, conforme recomendado por DOWE (28) que recomenda que a massa utilizada no experimento SSF não seja totalmente seca, visando preservar a estrutura interna da celulose. Ensaios SSF Os experimentos SSF foram divididos em três etapas. A pré-sacarificação foi realizada em frascos Duran de 2 ml contendo ml do meio para SSF, tendo como substrato sólido g do material obtido ao final dos pré-tratamentos PTB e PT2 da polpa de celulose (Experimentos A, B e E) ou da serragem (Experimentos C e D). Os ensaios de pré-sacarificação foram iniciados com a adição de 3 FPU de Celluclast. L /g sólido seco e 2 CBU de β-glucosidase /g sólido seco e conduzidos a o C, sob agitação de rpm, por 6 horas (ensaios A, B, C e D ). Para o Experimento E foi empregada uma carga enzimática mais elevada, de 6 FPU de Celluclast. L /g sólido seco e 4 CBU de β-glucosidase /g sólido seco com g de polpa de celulose como substrato. A ativação da levedura foi realizada em erlenmeyer de ml, contendo ml do meio de ativação, sob agitação de rpm, com incubação a 3 o C por aproximadamente 9 minutos. Os experimentos SSF foram iniciados transferindo-se 2 ml da suspensão ativada para ao conteúdo do frasco Duran ao final da reação de pré-
sacarificação, após redução da temperatura, de forma a obter-se uma concentração inicial de levedura de aproximadamente gms/l. Após a inoculação, gás nitrogênio foi utilizado para remoção do ar presente no frasco Duran, sendo o mesmo incubado a 37ºC, sob agitação de rpm e em condições anaeróbias, por até 96 horas para o estudo da SSF. Amostras retiradas de 8 em 8 horas foram inicialmente filtradas em papel de filtro comum para remoção de material particulado. O filtrado obtido foi recolhido em eppendorf e centrifugado. O sobrenadante foi guardado para determinação de etanol e glicose, enquanto o material depositado no fundo foi diluído para medida de densidade ótica. A cada 24 horas de experimento, foram coletadas amostras de ml para análise de viabilidade. As principais características de cada ensaio SSF estão resumidas na Tabela, sendo os ensaios A-B e C-D duplicatas realizadas nas mesmas condições. Tabela : Características principais dos ensaios SSF realizados. PB polpa branqueada, S- serragem. A e B C e D Material Quantidade de substrato (g) FPU Celulase CBU β - glicosidase PB S E PB 3 2 RESULTADOS E DISCUSSÕES Pré-tratamentos Foram realizados 4 experimentos em triplicata, cujos resultados foram avaliados em termos da massa perdida das amostras após cada prétratamento (Tabela 2) e da composição dos hidrolisados obtidos (Tabela 3). Os dados apresentados nas Tabelas 2 e 3 são as médias das triplicatas realizadas nos experimentos com o desvio padrão correspondente. A Figura ilustra as mudanças que ocorrem nos materiais após o pré-tratamento. Nas Figuras.b e c, amostras de material seco antes e após os pré-tratamentos podem ser comparadas. Visivelmente, a serragem de madeira perde cor em conseqüência da remoção da lignina, um dos principais responsáveis pela coloração na madeira. Esta constatação é confirmada pela Figura.a, a qual mostra a intensa cor escura adquirida pelo hidrolisado resultante do pré-tratamento para remoção de lignina da serragem. A coloração da polpa branqueada não foi modificada por se tratar de material já processado industrialmente. (a) Métodos analíticos As atividades em celulase e β- glucosidase dos preparados enzimáticos Celluclast. L e NS foram determinadas de acordo com a metodologia empregada em ADRI- ANO, 28. A concentração de glicose foi determinada pelo método enzimático (NOCENTINI e ZANGIROLAMI, 27); a concentração de etanol foi quantificada por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), utilizando-se uma coluna Shodex KS-8 lonpak e água Milli-Q como eluente, nas seguintes condições: 8 C e ml/min, com detector índice de refração. Já a concentração celular C X (em gms/l) foi estimada a partir da leitura da densidade ótica a 6 nm utilizando-se uma curva de calibração (Eq. ) e multiplicandose por fator de correção (,7 para a madeira e 6, para a polpa), o qual foi introduzido para compensar a retenção de massa celular pelos sólidos durante o procedimento de filtração. C X (gms/l) =,4799 *ABS(6 nm) () (b) (c) Figura (a) Aspecto da suspensão após a reação para remoção de lignina da serragem (b) Serragem antes (esquerda) e depois (direita) dos pré-tratamentos. (c) Polpa branqueada antes (esquerda) e após (direita) os pré-tratamentos. Tabela 2: Resultados de porcentagem em massa perdida após pré-tratamentos. % em massa perdida nas amostras após tratamento Tratamento Polpa branqueada Serragem PTA,7 ±,6 2, ±, PTB 8, ±,3 2,6 ±, PTA+PT2 32, ±, PTB+PT2 4,2 ±,
A partir dos resultados apresentados na Tabela 2 pode-se constatar que o tratamento realizado com ácido, à temperatura ambiente (PTA) não é tão eficaz quanto aquele realizado a altas temperaturas (PTB). O objetivo deste estudo seria minimizar o gasto de energia no processo caso o resultado para o tratamento com e sem aquecimento fossem semelhantes. O resultado obtido comprova que, dentre os dois tratamentos, o mais efetivo é aquele com aquecimento a 2 C. Outra constatação interessante é que a perda de massa ocorre em ambas as etapas de pré-tratamento para a serragem, sendo mais significativa na etapa de hidrólise alcalina (PT2). Como esperado, para a polpa branqueada não houve perda de massa em PT2 visto que a mesma já não apresenta lignina. É importante destacar que os resultados obtidos para os tratamentos mostraram-se reprodutíveis uma vez que os desvios foram baixos. O valor alto de desvio obtido no tratamento PTA deve-se ao baixo valor da massa perdida, gerando maiores erros de medida. Amostras dos hidrolisados obtidos após os pré-tratamentos foram utilizadas para análise de açúcares. Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 3. A concentração relativamente baixa de açúcares nos hidrolisados dos pré-tratamentos da serragem pode ser explicada pelo fato do material não ter sido submetido ao processo de explosão a vapor. Por isso, a ação dos pré-tratamentos fica limitada, pois a penetração na estrutura da madeira não acontece. Hidrólise e Fermentação Simultâneas A Figura 2 compara imagens dos frascos Duran onde foram realizados os experimentos SSF com serragem e polpa branqueada, no início e ao final dos mesmos. As mudanças na aparência das suspensões devido à ação das enzimas são visíveis. Tabela 3: Concentração dos açúcares presentes nos hidrolisados obtidos após prétratamentos Material Trat. Raf Sac Glic Xil Ara A * * * * * PB B *,7,8 3,2 * A * * * * * B * *, 3,8,2 A+2 * * * * * S B+2,8 * * * * *Não detectados PB: Polpa Branqueada; S: Serragem; Raf: Rafinose; Sac: Sacarose; Glic: Glicose; Xil: Xilose; Ara: Arabinose. (a) (b) Conforme comentado na Tabela 2, verifica-se novamente que o tratamento PTB realmente é o mais eficiente em termos de remoção de hemicelulose, produzindo um hidrolisado que contém diversos açúcares. O mesmo é comprovado para a polpa branqueada, cujo hidrolisado do tratamento PTB é o único que contém açúcares. Cabe ressaltar que os resultados encontrados por CARVALHO (2) também mostram que a maior concentração encontrada no hidrolisado seria de xilose, seguida de glicose e arabinose, demonstrando consistência dos resultados obtidos no presente trabalho. Este mesmo autor obteve resultados de concentrações maiores de xilose (24,32 g/l), de glicose (,3 g/l) e arabinose (,3 g/l). (c) (d) Figura 2: Frascos Duran contendo o material submetido a SSF. (a) Serragem (início) (b) Serragem (final) (c) Polpa de celulose (início) (d) Polpa de celulose (final). As Figuras 3 a,b, c, d e e, mostram o crescimento celular, as variações na concentração de glicose e a formação de etanol durante os experimentos de hidrólise e fermentação simultâneas. A comparação dos dados dos experimentos A e B e dos experimentos C e D evidenciam a reprodutibilidade dos ensaios realizados nas mesmas condições experimentais. Os principais resultados são discutidos a seguir. Os ensaios foram primeiramente realizados até horas visando acompanhar o perfil da produção de etanol durante a
etapa de sacarificação e fermentação simultâneas. Após constatarmos que a produção do álcool ocorria principalmente nas primeiras 2 horas, diminuiu-se o tempo de cultivo para 48 horas (último experimento). 3 2 2 2 4 6 8 3 2 2 (a) 2 4 6 8 9 8 7 6 4 3 2 (b) 2 4 6 8 8 7 6 4 3 2 (c) 2 4 6 8 (d) 3 3 2 2 2 3 4 (e) Figura 3: Resultados de concentração celular, de etanol e de glicose para cada um dos experimentos (a) A, (b) B (c) C (d) D (e) E Crescimento celular: Os dados para crescimento celular são reprodutíveis quando comparados com suas duplicadas porém houve significativa dispersão nos dados de concentração celular devido às dificuldades na metodologia proposta. As concentrações celulares representadas na Figura 3 foram obtidas a partir da leitura dos dados de densidade ótica alimentados a uma curva de calibração. Porém, no resultado original de leitura de densidade ótica, baixos valores de concentração celular foram alcançados. Suspeitou-se que parte da levedura estava ficando retida no material sólido coletado durante a filtração das amostras retiradas dos experimentos SSF. Assim, um experimento de verificação desta hipótese foi realizado e indicou que aproximadamente 9% da massa total de levedura presente na amostra permanecia retida juntamente com o material sólido para a serragem e 8% para a polpa de celulose. A partir desta informação, estimou-se um fator de correção, multiplicando os valores de concentração celular por,7 para a madeira e 6, para a polpa. No entanto, é importante ressaltar que como a consistência da suspensão muda muito ao longo dos experimentos devido à ação das enzimas, este fator de correção não é constante. Por isso, os resultados apresentados na Figura 3 são mais qualitativos do que quantitativos quanto à concentração celular presente. Liberação e consumo de glicose: Os resultados apresentados na Figura 3 mostram claramente que as maiores concentrações de glicose presentes no início dos experimentos e originadas na etapa de pré-sacarificação foram consumidas em aproximadamente horas de fermentação. A partir deste ponto, as concentrações de glicose se mantiveram em valores inferiores a 3 mg/l para todos os experimentos, com exceção do experimento E, no qual a menor concentração medida foi de 97 mg/l. Este resultado mostra que a concentração residual de glicose é dependente da carga enzimática utilizada, o que por sua vez determina o stress devido à limitação por
glicose ao qual as células são expostas. Na Tabela 4 estão relacionados as concentrações residuais máximas de glicose atingidas em cada um dos experimentos. Tabela 4: Concentrações residuais máximas de glicose em cada experimento Concentração residual de Experimento glicose (g/l) A,33 B,22 C,26 D,9 E,97 Produção de etanol: Em todos os ensaios observou-se produção de etanol. Um fator importante a se destacar é referente ao perfil de formação do produto. Em todos os ensaios pode-se notar que a produção de etanol atinge um máximo, normalmente alcançado em torno de 2 horas de experimento. Este período coincide com a exaustão da glicose liberada durante a présacarificação. Assim, o consumo da glicose acumulada durante a pré-sacarificação juntamente com a glicose gradativamente liberada durante o processo SSF leva à maior produção de etanol e ao crescimento mais acentuado. Após esse período, a glicose presente no meio é proveniente apenas do processo SSF, não sendo suficiente para manter o ritmo de crescimento anterior. Provavelmente nesta fase, a glicose disponível não é suficiente nem para atender às necessidades de manutenção celular.. Comparando-se os experimentos realizados em diferentes condições, houve maior produção de etanol para o ensaio realizado com o dobro da carga enzimática. A produção ficou em torno de 4 g/l no experimento E, g/l no experimento A e 3 g/l no experimento C. Estes resultados permitem concluir que a liberação de glicose é o fator determinante da produção de etanol, já que com o aumento da carga enzimática, maior produção de etanol foi alcançada. Outra constatação importante é sobre o papel do pré-tratamento no processo de produção de etanol via hidrólise enzimática e fermentação simultâneas. A polpa de celulose, utilizada como experimento controle, é praticamente celulose pura, com estrutura totalmente aberta (experimentos A e B) e por isso alcança-se uma produção de etanol 3 vezes superior a dos experimentos C e D, realizados com serragem. Finalmente, deve-se levar em consideração que as concentrações de etanol podem estar subestimadas, pois é muito provável que tenha havido perda significativa de etanol por evaporação durante o experimento, já que os mesmos foram realizados a 37 C em reatores sem condensador e tiveram longa duração. Degradação da celulose pela ação enzimática: A Tabela apresenta os resultados para a massa restante de sólidos (polpa de celulose branqueada ou serragem) ao final de cada experimento. Considerando-se que a massa inicial em todos os experimentos foi de aproximadamente gms, é possível estimar a massa de material consumida. Os valores apresentados na Tabela confirmam de forma inquestionável a ocorrência da hidrólise da celulose e da fermentação dos açúcares produzidos simultaneamente. Esta é a única explicação para o desaparecimento de até 9% da massa inicial de polpa e de até 2 % da de serragem. Tabela : Variação na massa de material sólido para os experimentos Massa consumida Ensaio Massa final (gms) (gms) A,4 4, B,33 4,67 C 3,73,27 D 4,2,88 E,33 4,67 Verifica-se ainda que a massa consumida de celulose nos reatores que continham polpa de celulose (A, B e E) foi muito maior se comparada à massa de celulose presente na serragem consumida na reação. Conforme já mencionado anteriormente, a polpa branqueada é um substrato muito mais adequado à ação das enzimas pelo fato de apresentar uma celulose mais exposta. Assim, a serragem, mesmo cominuída, apresenta mais resistência à penetração das enzimas para hidrólise, dificultando a formação de glicose. Estes resultados mais uma vez reforçam a importância da etapa de explosão a vapor na preparação de resíduos lignocelulósicos para a hidrólise enzimática. CONCLUSÕES O presente trabalho teve um caráter exploratório e considerando as condições experimentais investigadas, as seguintes conclusões preliminares podem ser extraídas: ) O pré-tratamento tem grande influência no desempenho do processo. Para as condições empregadas, a remoção de hemicelulose por hidrólise ácida a quente, seguida por prétratamento alcalino para remoção de lignina apresentou os melhores resultados. 2) A reprodutibilidade observada nos experimentos realizados foi boa, garantindo confiabilidade à metodologia empregada;
3) Houve produção de etanol para todos os ensaios e a quantidade de enzima adicionada tem influência nos resultados; 4) Nos ensaios com polpa branqueada de celulose e maior carga de enzimas, atingiu-se a concentração de 4 g/l de etanol em apenas 2 horas de cultivo. Esta produtividade é superior aos valores relatados na literatura. ) A metodologia analítica proposta para a determinação da concentração celular não apresentou resultados satisfatórios pelo fato de haver retenção significativa de células na massa de polpa de celulose ou serragem separada por filtração. 6) Vários resultados obtidos (concentração de açúcares nos hidrolisados, perda de massa durante os pré-tratamentos, produção de etanol e massa consumida durante os experimentos SSF) demonstraram que a serragem não foi efetivamente hidrolisada. Isso é uma clara indicação da necessidade de incluir uma etapa de explosão a vapor no processo proposto, de forma que subprodutos como a serragem possam ser efetivamente convertidos em etanol A partir das conclusões preliminares, é possível identificar alguns aspectos que requerem estudos mais aprofundados para que seja possível definir condições ótimas para o processo SSF a partir de resíduos da indústria de papel e celulose, tais como a definição do tempo necessário para a etapa de pré-sacarificação, a influência da temperatura adotada nos experimentos SSF na produção de etanol e a utilização de métodos indiretos (produção de CO 2, por exemplo) para o acompanhamento do crescimento celular. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADRIANO, W. S. Preparação e Caracterização de Derivados de Enzimas Industriais em Quitosana. 28. Tese (Doutorado em Engenharia Química) Curso de Pós-Graduação em Engenharia Química, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, 28. CARVALHO, G.B.M.; Ginoris, Y.P; Cândido, E. J.; Canilha, L.; Carvalho, W.; Silva, J. B. A.; Estudo do Hidrolisado de Eucalipto em Diferentes Concentrações Utilizando Evaporação a Vácuo para Fins Fermentativos. Revista A- nalytica, n. 4, Dezembro/Janeiro 2 DOWE, N.; McMILLAN, J. (28) SSF Experimental Protocols Lignocellulosic Biomass Hydrolysis and Fermentation, National Renewable Energy Laboratory. HUBER, G.W., IBORRA, S., CORMA, A. (26), Synthesis of Transportation Fuels from Biomass: Chemistry, Catalysts, and Engineering, Chemical Reviews, pág., 26. NOCENTINI, N.C., ZANGIROLAMI, T.C. (27) Produção de etanol em meio suplementado com vinhaça utilizando levedura adaptada. In: VII CONGRESSO BRASILEIRO DE EN- GENHARIA QUÍMICA EM INICIAÇÃO CIEN- TÍFICA COBEQ-IC, 27, São Carlos-SP. Anais do VII COBEQ-IC, p. -6. MARTINS, R.E. Estudo da imobilização de celulase em géis de quitosana, 27.Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) - Universidade Federal de São Carlos, São Carlos. OLIVEIRA, C.G.R, (26) Desenvolvimento de Bioprocesso para a produção de biomassa de levedura (Saccharomyces cerevisae) rica em organoselênio, 26. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) Curso de Pós-Graduação em Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do Paraná, Curitiba. PERRY, R. H.; GRENN, D. W. Perry s chemical engineers' handbook.. 7. ed. New York. : McGraw-Hill, 999. SASSNER, P.; Martensson, C. G; Galbe, M.; Zacchi, G. (28), Steam pretreatment of H2SO4-impregnated Salix for the production of bioethanol, Bioresource Technology 99 37 4 (28). SCHUCHARDT, U.; RIBEIRO, M. L.; GONÇAL- VES, A.R. A indústria petroquímica no próximo século: como substituir o petróleo como matéria-prima?. Química Nova, Vol. 24, No. 2, Março/Abril 2. p.247-2. Disponível em:<http://quimicanova.sbq.org.br/qn/qnol/2 /vol24n2/index.html> Acesso em março de 28. REIS, G.B, HORTA, A.C.L., ZANGIROLAMI, T.C., GIORDANO, R.C., CRUZ, A.J.G. Control of Fed-Batch Yeast Cultivation Using a Capacitance Sensor. In: th International Symposium on Process Systems Engineering PSE29, 29, Salvador-BA, Brazil. AGRADECIMENTOS À FAPESP pela bolsa, à NOVOZYMES pelos preparados enzimáticos, à Aracruz Celulose pela serragem e polpa de celulose e ao técnico Amadeus pelas análises em HPLC.