TÉCNICAS PARASITOLÓGICAS DE TF-TEST (THREE FECAL TEST) CONVENTIONAL E MODIFIED I. COMENTÁRIOS A técnica parasitológica de TF-Test Conventional, utilizando o kit comercial TF- Test, foi avaliada para o estudo de fatores interferentes na realização da coleta, homogeneização, preservação, transporte, processamento e triagem de material fecal. O mencionado kit é constituído por um conjunto de diferentes componentes ou peças confeccionados em plásticos recicláveis [Fig. 1], sendo dois componentes mantidos em laboratório, e o terceiro componente constituído de três tubos, denominados de tubos coletores-usuário, com capacidade de 12 ml de volume cada. Estes tubos são fornecidos ao paciente para a realização de coleta de material fecal, em dias alternados, conforme a bula explicativa encontrada na embalagem. Externamente aos tubos coletores-usuário existem graduações de 1 ml até 10 ml. Cada tubo contém 5 ml de um líquido preservador, à base de solução neutra de formalina. Ainda, em cada tubo, externamente, há uma faixa indicando que o nível do líquido preservador não deverá ultrapassá-la, após a introdução do material fecal. Internamente à tampa do tubo coletor está conectada uma peça plástica em forma de pá, que é utilizada para a coleta de material fecal, de aproximadamente de 1,2 g de fezes. No laboratório, os três tubos coletores-usuário contendo amostras fecais são acoplados por encaixe em três orifícios de um sistema duplo de filtros, denominado conjunto de filtros, contendo internamente malhas metálicas filtrantes de 400 m e 200 m. Ao conjunto já acoplado, de tubos coletores-usuário com o sistema de filtros, é conectado um tubo de centrifugação. O tubo de centrifugação apresenta-se na forma de cone, com o fundo em forma de V. Por fim, a montagem dos três tubos coletores- usuário, mais conjunto de filtros e tubo de centrifugação, vem a constituir o conjunto processador TF-Test Conventional. 1 P á g i n a
Fig. 1: Detalhamento de peças do Kit TF-Test. II. PROTOCOLO DE EXECUÇÃO DA TÉCNICA DE TF-TEST CONVENTIONAL. O protocolo operacional da técnica de TF-Test consiste em: a) Orientar o paciente a coletar somente uma pazinha de fezes, de acordo com a instrução que se encontra na embalagem (kit paciente) contendo os três tubos coletoresusuário, em dias alternados, e em um período de tempo que não ultrapasse a 10 dias; b) No laboratório, agitar vigorosamente os tubos coletores-usuário contendo as amostras fecais, homogeneizando-as para serem processadas; c) Em uma estante própria para a técnica de TF-Test, acomodar os três tubos coletores pertencentes a cada paciente, em separado, com as tampas semi-abertas. Em seguida, adicionar em um dos tubos uma gota de solvente orgânico (detergente neutro incolor) e 3 ml de acetato de etila p.a.; d) Fechar os tubos coletores com as suas respectivas tampas, e agitar vigorosamente por 30 segundos todos os tubos coletores, a fim de obter uma suspensão homogênea de partículas fecais; e) Retirar as tampas dos tubos coletores, descartando-as em um recipiente apropriado para descarte de material sólido contaminante, seguindo normas de biossegurança; 2 P á g i n a
f) Encaixar os três tubos coletores pertencentes ao mesmo paciente ao conjunto de filtros, que já contém o tubo de centrifugação acoplado em uma de suas extremidades. A unificação de todas essas peças constituirá o conjunto processador TF-Test Conventional; g) Verificar se o conjunto processador não apresenta nenhum vazamento de material a ser processado, fazendo para isto a inversão do conjunto; h) Centrifugar o conjunto processador por um minuto, a 500 g (1.500 rpm), tendo os três tubos coletores voltados para a parte superior da caçapa e o tubo de centrifugação voltado para a parte inferior da caçapa. A caçapa utilizada é a de 100 ml universal; i) Após a centrifugação, desacoplar cuidadosamente do restante das peças do conjunto processador o tubo de centrifugação, colocando-o na estante, descartando o restante das peças em recipiente próprio para material sólido contaminante, seguindo normas de biossegurança; j) Decantar o líquido sobrenadante do tubo de centrifugação em recipiente para descarte de líquido contaminante, também conforme as normas de biossegurança; k) Adicionar cerca de 10 gotas de solução salina fisiológica (NaCl a 0,85%) sobre o sedimento formado no fundo do tubo de centrifugação, ressuspendendo-o e homogeneizando-o delicadamente com o auxílio de pipeta plástica descartável; l) Com a mesma pipeta, transferir uma ou duas gotas do material processado sobre uma lâmina de microscopia; m) Adicionar, sobre a(s) gota(s), uma gota de solução de Lugol diluído, e mais uma gota de solução salina fisiológica. Preparar, em seguida, um esfregaço de todo o material sobre a lâmina; n) Cobrir o esfregaço com lamínula e examiná-lo em microscopia de luz convencional com aumentos de 100 e 400 vezes; e o) Finalizado a leitura microscópica, descartar o tubo de centrifugação com o resto da suspensão de material fecal em um recipiente para material sólido contaminante, como já referido anteriormente. 3 P á g i n a
III. PROTOCOLO DE EXECUÇÃO DA TÉCNICA DE TF-TEST MODIFIED II.1 Técnica de flutuação-espontânea para a detecção seletiva de cistos de protozoários e ovos leves e larvas de helmintos intestinais (< 1,17 g/ml). a) Esta etapa tem início logo após o processamento laboratorial de centrífugo-sedimentação da técnica parasitológica denominada TF-Test Conventional. Após este processamento, são obtidos cerca de 600 µl de sedimento fecal, localizado na região cônica do tubo de centrifugação [Fig. 1, (A)]; b) Neste sedimento, são adicionadas aproximadamente 10 gotas de solução salina fisiológica a 0,85%, de modo a formar uma suspensão fecal; c) Toda a suspensão é homogeneizada e duas partes desta, de cerca de 300μl cada, são transferidas do para dois tubos (A e B) de processamentos [Fig. 1, (B), (C) e (D)] apropriados, por meio de uma pipeta plástica descartável ou similar; d) No primeiro tubo processador (A), adiciona-se ao sedimento 3 ml de solução de sulfato de zinco, com densidade específica de 1,17g/ml, e toda esta suspensão é homogeneizada por um tempo de 30 segundos [Fig. 1, (E)]; e) Em seguida, o tubo processador é completado com a mesma solução, formando um menisco na sua borda [Fig. 1, (F)]; f) Uma lâmina de microscopia, com dimensão de 26mm x 76mm, é colocada sobre o menisco, de forma a ficar em contato com a suspensão (líquido) [Fig. 1, (G), (H)]; g) Um tempo de 15 minutos é aguardado [Fig. 1, (H)] e, logo após, a lâmina é retirada da borda do tubo, com um movimento brusco de inversão, e colocada em um local apropriado. Uma película de suspensão é formada na região central da lâmina após inversão; h) Adiciona-se uma gota de solução corante, à base de Lugol, sobre esta película de suspensão. Logo após, é feito um esfregaço na suspensão, colocando uma lamínula, de 22mm x 22mm de dimensional, sobre este esfregaço; e i) Por fim, lâmina e lamínula são conduzidas ao microscópio para a primeira análise microscópica (leitura) [Fig. 1, (I)]. 4 P á g i n a
(A) (B) (C) (D) (E) (F) 5 P á g i n a
(G) (H) (I) Fig. 1: Etapas do processamento laboratorial para obtenção de parasitos com o uso de técnica de flutuação-espontânea com o emprego de sulfato de zinco. As figuras acima apresentadas estão brevemente descritas abaixo: (A) Tubo de centrifugação da técnica parasitológica convencional (TF-Test) contendo todo o sedimento fecal processado ( ± 600µl) por centrífugo-sedimentação; (B) tubos processadores (A e B) utilizados para acomodar suspensão fecal e reagentes. Estes tubos devem estar livres de impurezas (limpos); (C) metade do sedimento fecal (± 300µl) processado sendo adicionado ao tubo processador (A), para a realização da etapa de flutuação-espontânea de estruturas leves de parasitos; (D) tubos processadores (A e B) contendo suspensão fecal; (E) adição de reagente sulfato de zinco na suspensão fecal do tubo processador (A); (F) menisco formado na borda do tubo processador (A); (G) sobreposição da lâmina de microscopia ao menisco; 6 P á g i n a
(H) lâmina em repouso (15 minutos) sobreposta ao menisco; e (I) lâmina e lamínula preparadas para a leitura microscópica. A área da lamínula, localizada na região central da lâmina, com a presença de estruturas parasitárias e livres em grande parte de impurezas fecais, é que será aproveitada à leitura. II.2 Técnica de sedimentação-espontânea de parasitos, com flutuação-espontânea de impurezas fecais, para a detecção de ovos pesados (> 1,17 g/ml) e larvas de helmintos intestinais. a) A outra metade da suspensão fecal, de cerca de 300μl, é transferida, por meio de pipeta plástica descartável ou similar, para o segundo tubo (B) de processamento [Fig.1, (B), (C) e (D)]; b) Em seguida, 3 gotas de um composto, formado por hipoclorito de sódio + hidróxido de sódio + cloreto de sódio + água com teor de cloro ativo, são adicionadas à suspensão [Fig. 2, (A)]. Esta suspensão é homogeneizada por 30 segundos e ficará em repouso por um tempo de 5 minutos, quando o material adquire uma cor clarificada [Fig. 2, (B)]; c) Logo após, neste meio, são adicionadas 3 ml de solução neutra de formalina [Fig. 2, (C)]. A suspensão é novamente homogeneizada e, em seguida, receberá a adição de 3 ml de acetato de etila p.a.. Uma nova homogeneização é estabelecida, desta vez de forma vigorosa, por um tempo de 30 segundos; d) O tubo de processamento, contendo toda a suspensão homogeneizada, ficará em repouso em uma estante apropriada [Fig. 2, (D)] por um tempo de 15 minutos, até que grande parte das impurezas fecais venham a flutuar por diferença de densidade específica [Fig. 2, (E)], segundo seta na imagen, mantendo as estrutras parasitárias na parte inferior do tubo, onde deve ficar localizado parte do material fecal sedimentado; e) Uma decantação é aplicada ao sobrenadante, sempre de cima para baixo, de forma cuidadosa e com o uso de pipeta plástica descartável ou similar, de modo a deixar 0,5 ml da suspensão fecal no tubo; f) Logo após, 4 gotas de solução salina fisiológica são adicionadas a suspensão fecal e, em seguida, todo o material é novamente homogeneizado, com o uso de pipeta plástica descartável ou similar, através de movimentos bruscos de sucção e ejeção do meio. Logo após, duas gotas da suspensão são succionadas e conduzidas a uma lâmina de microscopia; 7 P á g i n a
g) Na sequência, sobre as gotas localizadas na lâmina de microscopia, é adicionada uma gota de solução corante a base de Lugol. Este corante é preparado com água glicerinada, na proporção de 12 volumes/gotas desta água (6 volumes de água tratada para 2 volumes de glicerina - glicerol ou propano-1,2,3-triol - tamponada) para 8 volumes/gotas de Lugol; e h) Por último, lâmina e lamínula são conduzidas ao microscópio para a segunda análise microscópica (leitura) [Fig. 2, (F)]. (A) (B) (C) (D) 8 P á g i n a
(E) (F) Fig. 2: Etapas de processamento laboratorial da técnica de sedimentação-espontânea para obtenção de ovos pesados e larvas de helmintos, com uso de reagentes para a eliminação de impurezas fecais por flutuação-espontânea. As figuras acima apresentadas estão brevemente descritas abaixo: (A) composto sendo adicionado ao tubo processador (B); (B) suspensão em repouso por um tempo de 5 minutos; (C) tubo de processamento em repouso contendo o segundo reagente; (D) tubo de processamento em repouso, após homogeneização vigorosa, contendo suspensão fecal, composto e duas soluções reagentes; (E) impureza fecal sendo elevada por flutuação-espontânea, através de densidade específica, por exemplo; e (F) lâmina e lamínula preparadas para a leitura microscópica. A área da lamínula, localizada na região central da lâmina, com a presença de parasitos e livres, em grande parte, de impurezas fecais, é que será aproveitada à leitura. 9 P á g i n a