CINÉTICA DOS PROCESSOS FERMENTATIVOS

CINÉTICA DOS PROCESSOS FERMENTATIVOS

INTRODUÇÃO Formação de produto metabólito pode ser relacionada a consumo de nutriente; Além do mais, formação de produto não pode ocorrer sem a presença de células; Assim, é esperado que crescimento e formação de produto estão intimamente relacionados à utilização de nutrientes que dependendo dos controles metabólitos regulatórios; A formação de produto será ligada a crescimento e/ou concentração celular.

INTRODUÇÃO A relação cinética entre crescimento e formação de produto depende do papel do produto no metabolismo celular. As duas cinéticas mais comuns são aquelas que descrevem a síntese do produto durante o crescimento e após o crescimento ter cessado. Um exemplo menos comum aplica ao caso onde o crescimento inicialmente ocorre sem formação de produto, mas após algum período de tempo o produto começa a aparecer enquanto o crescimento continua.

No gráfico (a), a formação de produto é associado ao crescimento celular No gráfico (b), temos formação de produto associado ao crescimento, de uma forma mais ou menos confusa, chamada de formação de produto parcialmente associada ao crescimento X X [ ] X [ ] [ ] P (a) P t (b) t P (c) t No gráfico (c), temos formação de produto não associada ao crescimento.

Velocidade de Formação de Produto A velocidade de formação de produto é a derivada de P em cada ponto dp/dt; Da mesma forma que dx/dt e ds/dt não é usado, dp/dt (velocidade de formação de protuto) pode ser transformada em Velocidade Específica de Formação de Produto (µp) que é definido como: 1 dp µ p= X dt

1 1 µ/µmax µp/µpmax µ/µmax µp/µpmax (d) t (e) t µp/µpmax 1 µ/µmax (f) t Os gráficos mostram: (d) formação de produto associada ao crescimento; (e) formação de produto parcialmente associada ao crescimento e (f) formação de produto não associada ao crescimento.

FATORES DE CONVERSÃO Crescimento e formação de produto por microrganismos são processos de bioconversão nos quais os nutrientes químicos alimentados à fermentação são convertidos a massa celular e metabólitos; Cada uma dessas conversões pode ser quantificada por um coeficiente de rendimentos, expressão como massa de célula ou produto formado por unidade de massa de nutriente consumido, Yx/s e Yp/s, para célula e produto, respectivamente; Assim, o coeficiente de rendimento representa a eficiência de conversão. Nos processos cujo produto é a célula (ex. obtenção de levedura de panificação) o gráfico representativo da fermentação é mostrado abaixo

FATORES DE CONVERSÃO [] s X P X s tempo onde é maximizado o crescimento celular e minimizado a formação de subprodutos. O coeficiente de rendimento de célula por nutriente torna-se Yx/s = X/ S

Nos processos cujo objetivo é a formação de um produto e não a célula (ex. obtenção de etanol, antibióticos); O gráfico representativo da fermentação é mostrado abaixo [] s P X P s tempo onde é maximizado a formação de produtos e minimizado o crescimento celular; O coeficiente de rendimento do produto por nutriente será: Yp/s = P/ S A maneira usual de calcular rendimentos é medir a massa celular ou produto produzido e substrato consumido sob um período de tempo e calcular Yx/s e Yp/s. Obs.: Quando no meio há mais de um substrato de carbono, considera-se o substrato limitante do crescimento.

INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTES NA VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO Durante a maioria das fermentações descontínuas típicas, a velocidade específica de crescimento é constante e independente da concentração de nutrientes que está variando. Todavia, velocidade de crescimento, como uma velocidade de reação química, é uma função da concentração de compostos químicos. Os compostos químicos nesse caso são os nutrientes essenciais para o crescimento; A forma da relação entre velocidade de crescimento e concentração de nutriente foi observada em 1949 por Monod, O modelo de Monod tem a forma: S µ = µ m. Ks + S

INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTES NA VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO S µ = µ m. Ks + S µ = vel. específica de crescimento; µmax = vel. espec. de crescimento máximo; S = concentração de nutriente; KS = constante de saturação e é igual a S quando µ = 0,5.µmax

INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTES NA VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO A equação de Monod representa uma simplificação de várias situações reais: *Não prevê fase LAG (µx=0) µx=0 S >>> Ks. *Não prevê fase estacionária (embora S não seja nulo, S 0; µx=0. *Não prevê nem um tipo de inibição. *Não se aplica a cultivos com limitação de outros nutrientes (apenas S limitante). Representação da equação de Monod. Ex: para µm = 0,14 h-1 e Ks = 0,60 mg/l (curva B), Ks = 0,030 mg/l (curva A).

INFLUÊNCIA DA CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTES NA VELOCIDADE ESPECÍFICA DE CRESCIMENTO A curva apresentada pela µx em função do tempo (condições experimentais), apresenta um trecho máximo e constante (AB), após a fase LAG curta. Variação da (µx) e do tempo de geração (tg), no cultivo descontínuo.

-Outros Modelos Matemáticos: Estes modelos, como o de Monod, támbém não levam em conta o fenômeno da inibição (pelo substrato ou pelo produto).

O fenômeno de inibição do crescimento celular (figura abaixo) somente se aplica para valores de S relativamente baixos,menores ou iguais a Ks. Ks Cinética de inibição pelo substrato (curva A) e sem inibição (---). K i,s S µ x = µ m. * K s + S K i,s + S Ks= Constante de saturação definida na Equação de Monod; Ki,s=Constante de inibição pelo substrato

Com o objetivo de explicar a redução da velocidade específica de crescimento provocada pelos altos valores iniciais de substrato, uma modificação foi proposta para a Equação de Monod: K i,s S µ x = µ m. * K s + S K i,s + S Ks= Constante de saturação definida na Equação de Monod; Ki,s=Constante de inibição pelo substrato; Ki,s = Ks, quando: µx = µ max 2, porém para um valor de S, que provoque a inibição, sendo assim superior ao correspondente S da equação de Monod.

Quanto a inibição pelo produto, um equacionamento semelhante foi proposto por JERUSALIMSKY & NERONOVA K i,p S µ x = µ m. * K s + S K i,p + S Ks= Constante de saturação definida na Equação de Monod; Ki,p=Constante de inibição pelo produto;

MODELO DE MONOD S µ = µ m. Ks + S

CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO Modelo de Monod Em 1942, Jaques Monod propôs uma relação matemática para descrever o efeito do crescimento limitante em função da taxa específica de crescimento. O crescimento da biomassa é dependente da disponibilidade do nutriente. Quando estamos em condições de limitação do nutriente a µx reduz-se até cessar completamente o crescimento, em condições de exaustão do nutriente.

CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO Modelo de Monod where µm taxa específica de crescimento máxima Ks constante de saturação ou de Monod S concentração do substrato limitante.

CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO Modelo de Monod V max[s ] V= Km + [ S ] A taxa específica de crescimento máxima é a taxa máxima de crescimento obtida para condições não limitantes. A constante de Monod (Ks) é a concentração do nutriente limitante para a qual a taxa de crescimento é metade da taxa de crescimento máxima; Representa a afinidade do organismo para o nutriente. Os valores de µm e Ks dependem do organismo do nutriente limitante do meio de fermentação e de fatores como temperatura e ph

CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO A linearização do modelo de MONOD: 1 ks µ µ max 1 µ max 1 S 1 ks 1 1 = * + µ µ max S µ max

CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO Coeficiente de Rendimento Rendimento define-se como a quantidade de produto obtida para determinado substrato. Por exemplo, se 0.6 g de ácido cítrico é produzido a partir de 1 g de glicose, então o rendimento de ácido citrico de glicose é 0.6 g/g. O rendimento pode variar consideravelmente durante a fermentação. Por isto, o rendimento médio é frequentemente expresso como eficiência da produção.

CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO Coeficiente de Rendimento Diferentes tipos de coeficientes de Rendimento de Biomassa (Yxs) Rendimento do produto (Yps). O rendimento à biomassa é a biomassa (média) produzida por unidade de massa de substrato consumido X0 and S0 são as concentrações iniciais de biomassa e de substrato.

CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO Coeficiente de Rendimento O rendimento do produto : Po and So são as concentrações iniciais.

EXEMPLO DE APLICAÇÃO Mode Cinético: Velocidade Específica de Crescimento: (1) dx/dt: variação entre a concentração final (X) e inicial (Xo ) de biomassa em função da variação de tempo (g.l-1.h-1); µmax: máxima velocidade específica de crescimento (h-1); X: concentração de biomassa celular no instante t (g.l-1); S: Concentração de glicose no instante t (g.l-1);; Ks Constante de saturação de glicose do modelo de Monod (g.l-1); Aeração: 0,25 ou 1 L/min

EXEMPLO DE APLICAÇÃO Velocidade de consumo de glicose sem formação de produto: (2) em que: ds/dt é a variação da concentração inicial (So) e final (S) de glicose em função do tempo (g.l-1.h-1). Yx/s: fator de conversão de glicose em biomassa (g.g -1)

EXEMPLO DE APLICAÇÃO Yx/s = rx/rs Yx / s = ( x0 x f ) (S0 S ) X = X0 + Yx/s (So S) então da equação 2, vem: (4) (k s + S ) µ max ds = S ( X o + Yx / s ( S o S ) Yx / s

EXEMPLO DE APLICAÇÃO Integrando a equação 4, tem-se: Z = bu d (equação da reta) S ln So z= t

Os parâmetros Ks e max µ São estimados a partir de dados experimentais:

Valores de µ max e Ks Parâmetros KLa inicial (15 h-1) KLa Inicial (27 h-1) S0 (g/l) 22,19 20,36 KLa (h-1) 15,0 27,0 Xo (g/l) 0,10 0,19 Yx/s (g/g) 0,355 0,344 µmax (h-1) 0,041 0,033 Ks (g/l) 13,03 6,15

CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO Exercício: 4) Os dados obtidos de uma fermentação descontínua estão ilustrados na tabela abaixo. Determine: a) A forma linear do modelo matemático de Monod, demonstrando graficamente os coeficientes linear e angular. b) Os parâmetros cinéticos Ks e µm. T (h) X (g/l) S (g/l) 0,00 15,50 74,00 0,52 22,50 61,00 0,86 28,60 49,00 1,18 35,30 37,00 1,43 41,10 26,00 1,74 48,20 11,00 2,06 53,00 3,00

CINÉTICA DE FERMENTAÇÃO CONCENTRAÇÃO DE SUBSTRATO e PRODUTO CURVA DE CRESCIMENTO E PRODUTO 80 60 Seqüência1 40 Seqüência2 20 0 0 1 2 3 TEMPO (h) T (h) X (g/l) S (g/l) dx/dt 0,00 15,50 74,00 12,24 0,52 22,50 61,00 15,90 0,86 28,60 49,00 19,63 1,18 35,30 37,00 22,29 1,43 41,10 26,00 23,92 1,74 48,20 11,00 20,20 2,06 53,00 3,00 9,12 Le Duy & Zajic

MODELO DE LINVEWEABER-BURK O modelo de Monod tem a forma: µ = µ. m S Ks + S Lineweaver-Burk, inverteu a Equação de Monod linearizando a equação, e assim facilitou as determinações das constantes de Monod: KS 1 1 1 = * + µ µ max S µ max

A linearização do modelo de MONOD: 1 ks µ µ max 1 µ max 1 S 1 ks 1 1 = * + µ µ max S µ max

Alguns valores para Ks no modelo de Monod para crescimento Nutriente KS (mg/l) Microrganismo Glicose 1,0 Enterobacter aerogenes Glicose 2,0-4,0 Escherichia coli Glicose 25,0 Sacharomyces cerevisiae Observações: a)os valores de Ks são muito pequenos em relação à concentração do nutriente nas fermentações industriais. β)µ µmax, quando S> 10 KS c)para S< 10 KS, µ é uma forte função da concentração de nutriente. d)durante a fase exponencial µ é constante.

EVOLUÇÃO DE CALOR DURANTE A FERMENTAÇÃO A evolução de calor durante a fermentação está intimamente relacionada à utilização da fonte de carbono e energia. a) Quando a fonte de carbono está sendo ativamente incorporada à massa celular via crescimento, tipicamente cerca de 40-50% da entalpia disponível é conservada na biomassa e o restante, perdido como calor (50-60%); b) Quando a fonte de carbono está sendo metabolizada para manutenção celular, toda a entalpia associada com combustão é desprendida como calor. ; c) Se um produto está sendo formado, então o calor envolvido por unidade de fonte de carbono metabolizada está entre os dois extremos; O interesse na evolução do calor está na necessidade de removê-lo durante o processo de fermentação e da utilidade do calor como indicador da viabilidade metabólica.

INFLUÊNCIA DO AMBIENTE NO CRESCIMENTO CELULAR A habilidade de um microrganismo crescer e sintetizar produtos em um dado ambiente é determinado pelo microrganismo (m.o); O desenvolvimento bem sucedido de processos de fermentação é dependente, primeiro da obtenção de boas linhagens por isolamento e mutação, segundo, dos parâmetros ambientais no crescimento celular e formação de produto, principalmente temperatura e ph.

Efeito da Temperatura no Crescimento Celular Crescimento microbiano e formação de produto são resultados de uma complexa série de reações químicas. Como elas, eles são influenciados pela temperatura da seguinte forma: tipos de curvas crescimento-temperatura

Efeito da Temperatura no Crescimento Celular A maioria dos m.os crescem num intervalo de temperatura entre 20 e 40 oc; Morte Crescimento µmax µ pode ser dado pela equação de Arrhenius: µ = Ae-Ea/RT α = A e-ea /RT A e A = constante (h-1) Ea e Ea = energia de ativação (cal/mol) R = 1,98 cal/mol K T = temperatura (K) α = velocidade específica de morte (h-1). µ = velocidade específica de crescimento (h-1 (1/T) A velocidade de crescimento cresce rapidamente quando a temperatura aumenta até a temperatura ótima, mas a partir dessa, o crescimento cai também rapidamente; A maioria dos m.o. apresenta o seguinte comportamento:

Efeito da Temperatura no Crescimento Celular A energia de ativação para crescimento varia de 1520kcal/mol e para morte de 60-70kcal/mol; Assim a velocidade específica de morte é muito mais sensível à temperatura que a de crescimento. A temperatura também pode afetar outros aspectos importantes do crescimento microbiano como Yx/s; Na produção de biomassa o importante é atingir a máxima conversão de substrato à massa celular; Assim o coeficiente de rendimento Yx/s celular é de principal interesse; Esse coeficiente de rendimento é mostrado na figura a seguir para crescimento de bactérias em metanol, em função da temperatura.

Efeito da Temperatura no Crescimento Celular Yx/s 45 T(oC) 50 55 60 65

Efeito do ph no Crescimento Celular µ Escherichia coli µmax 5,0 Bactérias ph 4 8 Leveduras ph 3 6 Fungos ph 3 7 (bactéria) 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 ph

Efeito do ph no Crescimento Celular Como consequência o ph deve ser controlado nos seus valores ótimos para melhorar a performance do processo; Durante a fermentação, o ph tem uma tendência a mudar por várias razões; Quando a fonte de N é um sal de amônio NH4+ o m.o. incorpora da forma R-NH3+ liberando H+, portanto o ph diminui; Quando a fonte de N é NO3-, o m.o. remove H+ do meio para reduzir o NO3- a R-NH3+ logo o ph aumenta. Outra razão para variação do ph ocorre quando ácidos orgânicos são produzidos (ácido lático, pirúvico, acético e etc.). Através da medida do ácido ou álcali adicionado para neutralizar a mudança de ph, é possível obter informações sobre crescimento (X) e formação de produto (P).

Efeito do ph no Crescimento Celular A Figura abaixo mostra a relação entre a massa de NH4OH adicionado ao cultivo para controle de ph e a concentração celular. O microrganismo utilizado foi E. coli BL21(DE3)pLysS para produção da proteína recombinante Troponina C X (g/l) X = 0,68 + 0,85(NH4OH) E. coli BL21(DE3)pLysS NH4OH (g)

Efeito do ph no Crescimento Celular