CENTRO ESTADUAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA PAULA SOUZA FACULDADE DE TECNOLOGIA DE PIRACICABA- FATEC GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE BIOCOMBUSTÍVEIS

CENTRO ESTADUAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA PAULA SOUZA FACULDADE DE TECNOLOGIA DE PIRACICABA- FATEC GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIA DE BIOCOMBUSTÍVEIS HIDRÓLISE DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR PARA OBTENÇÃO DE ETANOL ALINE GRELLA DE CAMPOS MARIA MARTINS DA SILVA MARLENE APARECIDA DA SILVA PIRACICABA - SP JUNHO/ 2011

ALINE GRELLA DE CAMPOS MARIA MARTINS DA SILVA MARLENE APARECIDA DA SILVA HIDRÓLISE DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR PARA OBTENÇÃO DE ETANOL Trabalho de Graduação apresentado a Faculdade de Tecnologia de Piracicaba como requisito parcial a obtenção do Título de Graduação de Tecnologia em Bicombustíveis. Profª. Drª. Eliana Mª G. Rodrigues de Siqueira. Co-orientadora: Profª. Drª. Sandra Helena da Cruz ESALQ/USP PIRACICABA - SP JUNHO/ 2011

PIRACICABA-SP 17 /JUNHO/ 2011 ii

iii "... Faça, erre, tente, falhe, lute. Não jogue fora a extraordinária oportunidade de ter vivido. Tendo consciência de que, cada homem foi feito para fazer história. Que todo homem é um milagre e traz em si uma evolução. Que é mais do que sexo ou dinheiro. Você foi criado para construir pirâmides e versos, para descobrir continentes e mundos. E caminhar sempre com um saco de interrogações numa mão e uma caixa de possibilidades na outra..." Nizan Guanaes

iv AGRADECIMENTOS A Deus, por tudo, por todos, pela vida... Aos nossos familiares A todos os companheiros de jornada acadêmica Banca examinadora Profª. Drª. Eliana Mª G. Rodrigues de Siqueira (Orientadora) Faculdade de Tecnologia de Piracicaba (FATEC) Profº Dr. James Rogado Universidade Metodista de Piracicaba (UNIMEP) Profª. Drª. Daniela Defavari do Nascimento Faculdade de Tecnologia de Piracicaba (FATEC)

v RESUMO Recentemente há grande interesse em aproveitar materiais lignocelulósicos para produção de combustível limpo e renovável, no Brasil por ser o segundo maior produtor de cana-de-açúcar o principal material lignocelulósico é o bagaço advindo do processo de extração do caldo de canade-açúcar, resíduo gerado em grande quantidade pelas Usinas produtoras de açúcar e álcool. O bagaço de cana-de-açúcar, assim como outros resíduos de origem vegetal possuem parede celular composta de celulose, hemicelulose e lignina que em associação são denominados de lignocelulósicos que contém energia armazenada que muitas vezes são descartadas ou queimadas para geração de vapor. Para o melhor aproveitamento desta energia contida em grande parte na celulose é necessário desconstruir a sua estrutura, assim a produção de etanol a partir de biomassa celulósica requer um pré-tratamento para remoção da lignina e desestruturação da celulose através da hidrólise ácida ou enzimática. A fim de avaliar quais processos de pré-tratamento apresenta maior influencia no rendimento de hidrolisado após a hidrólise o objetivo deste trabalho foi utilizar bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado com ácido, água e com fungos lignocelulolíticos: Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei Rut-30, Trichoderma harzianum 3844, Aspergillus niger IZ-9 e Agaricus bisporus (G4), capazes de hidrolisar o bagaço a açúcares potencialmente fermentáveis por leveduras industriais e analisar o etanol obtido. Realizando os experimentos em escala laboratorial os melhores resultados observados no prétratamento foram bagaço pré-tratado com H 2 SO 4 (2%), com 13,75 mg de AR/mL, determinado pelo método DNS e através da hidrólise total deste resíduo realizou análise cromatográfica do hidrolisado e observamos liberação de 1,18% e 91,38% do seu potencial de glicose e xilose, respectivamente, isto resultou na baixa obtenção de etanol, devido a presença de resíduos tóxicos para as leveduras, como os furfurais. No tratamento controle com fungos foram 3,0 g/ L de açúcares redutores liberados. O fungo P. chrysosporium desenvolveu-se muito bem quando incubados no bagaço de tratamento controle (TC) e de tratamento ácido (TA). No tratamento bagaço pré-tratado com ácido os fungos P. chrysosporium e T. reesei Rut-30 se beneficiaram dos carboidratos liberando aproximadamente 35g AR/L, no tempo inicial, mas posteriormente ocorreu diminuição da concentração de AR, devido o crescimento dos fungos que consumiram grande parte dos açúcares. Palavras-chave: Bagaço. Hidrólise. Etanol. Ácido. Fungo

vi ABSTRACT Recently there is great interest in using lignocellulosic materials for production of clean fuels and renewable, in Brazil for being the second largest producer of cane sugar is the main lignocellulosic bagasse coming from the process of extracting the broth of cane sugar waste produced in large amounts by plants that produce sugar and alcohol. The crushed cane sugar, as well as other plant wastes has cell walls composed of cellulose, hemicellulose and lignin in combination are called lignocellulosic that contains stored energy that are often discarded or burned to generate steam. For better utilization of energy contained largely in the cellulose is necessary to deconstruct its structure, so the production of ethanol from cellulosic biomass requires pretreatment to remove the lignin and cellulose breakdown by acid hydrolysis or enzymatic. In order to evaluate which processes pre-treatment has greater influence on the yield of hydrolyzed after hydrolysis the purpose of this study was to use bagasse-cane pre-treated with acid, water and lignocellulolytic fungi: Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei Rut- 30, 3844 Trichoderma harzianum, Aspergillus niger IZ-9 and Agaricus bisporus (G4), capable of hydrolyzing bagasse potentially fermentable sugars by yeasts and analyze industrial ethanol obtained. Performing experiments on laboratory scale the best results observed in the residue levels were pre-treated with H2SO4 (2%), AR with 13.75mg/mL, determined by the DNS method by hydrolysis and total waste of chromatographic analysis performed hydrolyzate and observe the release of 1.18% and 91.38% of its potential for glucose and xylose, respectively, this resulted in lower production of ethanol, due to the presence of toxic waste to the yeasts, such as furfur. In the control treatment fungi were 3.0 g/l of reducing sugars released. The fungus P. chrysosporium developed very well when incubated in the bagasse treatment control (CT) and acidic (TA). In treating bagasse pretreated with acid fungi P.chrysosporium and T. reesei Rut-30 benefited from releasing approximately 35g carbohydrate AR/ L at baseline, but subsequently decrease in the concentration of RA, because the growth of fungi that consumed most of the sugars. Keywords: Bagasse. Hydrolysis. Ethanol. Acid. Fungus.

vii LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Corte transversal da fibra de material lignocelulósico...14 FIGURA 2. Estrutura geral do bagaço de cana-de-açúcar... 15 FIGURA 3. Hidrólise ácida de celulose e arabinoxilano...20 FIGURA 4. Reação do DNS com açúcar redutor... 29 FIGURA 5. Açúcares redutores liberados após pré-tratamento do bagaço de cana... 32 FIGURA 6. Açúcares redutores liberado após cultivo de fungos A) T. resseei Rut 30. B) T, harzianun 3844 e C) P. Chrysosporium cultivados em bagaço de cana pré- tratado com H 2 O ou H 2 SO 4...33 FIGURA 7. Açúcares redutores liberados durante pré-tratamento do bagaço de cana pelo método de DNS...34 FIGURA 8. Concentração de açúcares, obtido por HPAEC-PAC, após pré-tratamento ácido do bagaço de cana...35 FIGURA 9. Concentração de açúcares, obtido por HPAEC-PAC, do bagaço de cana submetido á hidrolise total...36 FIGURA 10. Açúcares redutores liberados e valores de ph após pré-tratamento do bagaço de cana...38 FIGURA 11. Açúcares redutores liberados e valores de ph após cultivo do bagaço de cana prétratado por Apergillus nizer IZ-9 (Asp) e Agaricus bisporus (G4) a 28ºC...39 FIGURA 12. Açucares redutores liberados e valores de ph após cultivo simultâneo do bagaço de cana, pré-tratado com ácido, por fungo P.chrysosporium e T. reesei Rut-30...40

viii LISTA DE GRÁFICOS E TABELAS GRÁFICO 1. Curva Padrão de glicose, obtida pelo método DNS...30 TABELA 1. Comparação do bagaço submetido a hidrolise total e parcial...36

SUMÁRIO RESUMO... v ABSTRACT... vi LISTA DE FIGURAS... vii LISTA DE GRÁFICOS E TABELAS... viii 1. INTRODUÇÃO... 11 2. OBJETIVO... 12 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 13 3.1. Bagaço de cana-de-açúcar no Brasil... 13 3.2. Bagaço de cana-de-açúcar como matéria-prima para produção de etanol... 14 3.3. Parede celular da cana-de-açúcar... 16 3.4. Hidrólise de material lignocelulósico... 18 3.5..Hidrólise ácida... 19 3.6. Hidrólise enzimática... 21 3.7. Fungos lignocelulósicos... 23 3.8.. Fermentação do hidrolisado para obtenção do bioetanol... 24 4. MATERIAIS E MÉTODOS... 26 4.1 Bagaço de cana-de-açúcar... 26 4.2 Microrganismos... 26 4.3 Hidrólise do bagaço de cana-de-açúcar... 26 4.4 Fermentação do hidrolisado... 27 4.5 Análises físico-químicas e microbiológicas... 28 4.6 Análise dos Açúcares por HPAEC-PAC... 29 4.7 Concentração de açucares redutores totais (ART)... 29 4.8 Biomassa... 30 4.9 Viabilidade das células de levedura... 30 4.10 Umidade de bagaço... 31 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 32 5.1 Liberação do açúcar redutor do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado... 32

5.2 Tratamentos biológicos do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado... 32 5.3 Açúcares redutores liberados no hidrolisado do bagaço de cana-de-açúcar... 34 5.4 Hidrólise total do bagaço de cana-de-açúcar... 35 5.5 Análises da umidade do bagaço durante incubação a 30 C... 37 5.6 Liberação de açúcar redutor de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado... 37 5.7 Tratamento biológico do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado... 38 5.8 Tratamento biológico com dois fungos simultaneamente... 39 5.9 Fermentação do hidrolisado... 41 5.10 Formação de outros compostos... 41 6 CONCLUSÃO... 42 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 43

11 1. INTRODUÇÃO O Brasil é o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo, no processamento da cana-deaçúcar para obter açúcar e álcool, são gerados os subprodutos, bagaço e palha, resíduos lignocelulósicos compostos por celulose, hemicelulose e lignina. A celulose é a matéria mais abundante na terra, e ocorre em associação com a hemicelulose e a lignina, resultando assim o termo lignocelulósico, este, é, portanto, o material orgânico renovável mais abundante e favorável de conversão biológica, química e fisiológica em produtos de interesse econômico (PAVARINA, 1997). Subprodutos como bagaço e palha de cana-de-açúcar, cascas, gramíneas e resíduos florestais que são tradicionalmente queimados ou descartados, podem ser utilizados como matérias-primas para obtenção de etanol (JARDINE et al., 2009). Há décadas o Brasil utiliza o etanol como combustível, diretamente no tanque dos carros ou sob forma de mistura com a gasolina, de 22% a 25% de álcool. O Programa Nacional do Álcool (Proálcool), lançado em 1975, para a produção de álcool combustível, visava uma política de independência para o setor energético em resposta à primeira crise internacional do petróleo (BON et al., 2008). Nesse cenário em busca de fontes de energia renováveis, desde o século XIX, a hidrólise da biomassa surge como opção de matéria-prima para a fermentação e consequentemente obtenção do etanol, somente nos últimos vinte anos essa tecnologia tem sido proposta para atender o mercado de combustível no Brasil, Estados Unidos e na Europa. As tecnologias para a obtenção de bioetanol com base em materiais lignocelulósicos envolvem a hidrólise dos polissacarídeos da biomassa em açúcares fermentescíveis e sua posterior fermentação para produção de bioetanol. Essa biomassa é composta de lignina, hemicelulose e celulose. A lignina devido as suas características químicas impede a hidrólise das camadas internas, por isto, nos processos enzimáticos de conversão de celulose a etanol ou outros bioprodutos, um pré-tratamento é necessário para que a estrutura lignocelulósica da biomassa seja rompida (BNDES, 2008).

12 2. OBJETIVO O presente trabalho visa testar a obtenção do etanol via hidrólise ácida e via fungos lignocelulolíticos: Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei Rut-30 e Trichoderma harzianum 3844, Aspergillus niger IZ-9, Agaricus bisporus (G4).

13 3.REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 Bagaço de cana-de-açúcar no Brasil Os países norte-americanos e europeus estão interessados no etanol brasileiro, reconhecido mundialmente pelas suas vantagens ambientais, sociais e econômicas, diante disso há necessidade de aumentar a produção, sendo estimados para a safra 2010/11 na região Centro- Sul 595,89 milhões de toneladas de cana, um total de 34,09 milhões de toneladas de açúcar e de 27,39 bilhões de litros de álcool (UNICA, 2011). No Brasil, o bagaço de cana é o resíduo agroindustrial obtido em maior quantidade, aproximadamente 280 kg/t de cana moída. Estima-se que a cada ano sejam produzidos de 5 a 12 milhões de toneladas desse material, correspondendo a cerca de 30% do total da cana moída e na produção de etanol, cerca de 30% da cana é transformada em bagaço (RODRIGUES e CAMARGO, 2008). Do processamento da cana, para obtenção de açúcar e álcool, são gerados os subprodutos, bagaço e palha, resíduos lignocelulósicos compostos por celulose, hemicelulose e lignina. A celulose ocorre em associação com a hemicelulose e a lignina, resultando assim o termo lignocelulósico, o material orgânico renovável mais abundante da Terra e favorável de conversão biológica, química e fisiológica em produtos de interesse econômico (PAVARINA, 1997). Subprodutos como bagaço e palha de cana-de-açúcar, cascas, gramíneas e resíduos florestais geralmente são queimados ou descartados, mas podem ser melhores aproveitados como matérias-primas para obtenção de etanol (JARDINE et al., 2009). Em termos energéticos, a cana-de-açúcar equivale a 49,5% de bagaço, 43,2 % de etanol e 7,3% de vinhoto. Mesmo com esse valor energético, o destino do bagaço nas usinas, é a incineração, para produção de vapor de baixa pressão (20 kgf/cm²). Atualmente as principais pesquisas, em todo o mundo, estão sendo direcionadas, principalmente, para a conversão bioquímica da celulose. As dificuldades estão na hidrólise enzimática e na lignina, pois esta dificulta o acesso de enzimas aos carboidratos fermentáveis, acarretando perdas, uma vez que a enzima é consumida no decorrer do processo (RODRIGUES e CAMARGO, 2008). As fibras do bagaço são recobertas de lignina, possuindo uma camada intermediária de hemicelulose e uma camada interna de celulose, como mostrado na Figura 1.

14 FIGURA 1. Corte transversal da fibra de material lignocelulósico (Fonte:RODRIGUES e CAMARGO, 2008). De acordo com Rodrigues (2011) devido ao desenvolvimento tecnológico, os combustíveis de segunda geração podem beneficiar o emprego de elevadas quantidades de resíduos e rejeitos lignocelulósico que estão atualmente disponíveis e com baixo custo de aquisição. Assim um incentivo para seu aproveitamento, permite a co-produção de combustíveis valiosos, compostos químicos, eletricidade e calor conduzindo a produção de energia sustentável. 3.2 Bagaço de cana-de-açúcar como matéria-prima para produção de etanol O bagaço de cana é um material fibroso obtido após a extração do caldo no processo de moagem. Ao sair da moenda, o bagaço apresenta aproximadamente 30% da massa da cana umidade em torno de 50%. Devido a sua acessibilidade e elevada disponibilidade, principalmente nos grandes centros açucareiros do País, pode representar uma opção economicamente viável para a produção de etanol (CARDOSO, 2008). A composição química do bagaço varia de acordo com diversos fatores, dentre eles, o tipo de cana, o tipo de solo, as técnicas de colheita e até o manuseio. A Figura 2 apresenta a estrutura geral do bagaço de cana-de-açúcar com os seus respectivos grupos químico.

15 FIGURA 2: Estrutura geral do bagaço de cana-de-açúcar. (Fonte: RODRIGUES e CAMARGO, 2008). Apesar de todas as características positivas inerentes ao uso de bagaço de cana como matéria-prima na produção de etanol, um grande desafio a superar consiste em reduzir os custos operacionais associados à disponibilização dos carboidratos para conversão biotecnológica. O desenvolvimento de processos eco-eficientes de pré-tratamento do bagaço e de hidrólise da celulose emerge, neste cenário, com especial relevância (BAUDEL, 2007). A cana de açúcar é uma das mais ricas fontes de carboidrato na natureza. De uma tonelada de cana-de-açúcar, obtém-se 150 kg de açúcares fermentescíveis e 140 kg de bagaço seco contendo: a) kg de celulose (43%), b) kg de xilanas (25%), c) kg de lignina (23%), além de 4 kg de ácido acético (3% em grupos acetílicos nas heteroxilanas), 6 kg de extratos incluindo sacarose (4%) e 3 kg de cinzas (2%). É importante observar que esse balanço de material não leva em conta o consumo de energia, que nas usinas é suprido com a queima do próprio bagaço. Para um processo completamente auto-sustentável, sem o uso de combustíveis fósseis, é preciso descontar a quantidade de bagaço de cana consumida para gerar energia para esse processo. Considerando que a quantidade de açúcares fermentescíveis encontrada no bagaço pode ser recuperada, por exemplo, com 90% de eficiência após 2 etapas de tratamento ácido, o rendimento teórico de açúcares fermentescíveis na cana de açúcar em sua totalidade (caldo e bagaço) pode chegar a 227 kg/ton, com o

16 bagaço contribuindo com um aumento de 50% no etanol produzido. Assim, se promove o aumento da produção sem promover a expansão de área plantada, de forma a evitar a competição com as áreas produtoras de alimentos ou entrar em áreas protegidas como florestas (RODRIGUES, 2007). Segundo Baudel (2007), resultados preliminares de experimentos realizados na Universidade de Lund (Suécia) evidenciam a possibilidade de produzir aproximadamente 210 L etanol/ton bagaço seco utilizando levedura Saccharomices cerevisae convencional em estratégias Sacarificação e Fermentação Separadas ( Separate Hydrolysis and Fermentation, SHF) utilizando unicamente glicose como substrato. Há inúmeras opções de processo de hidrólise, todas com um pré-tratamento do material lignocelulósico para remoção da lignina e separação da hemicelulose, em alguns casos; exemplos de pré tratamentos: físicos (picadores, moagem), físico-químicos (auto-hidrólise: descompressão com vapor, com amônia ou com CO2), químicos (com ozônio, ácidos diluídos ou concentrados, alcalino) ou com solventes (para dissolver a lignina, como no processo Dedini-Copersucar) (MACEDO e NOGUEIRA, 2005). 3.3 Parede celular da cana-de-açúcar A cana-de-açúcar pertence a um grupo de plantas denominadas família Poaceae (gramíneas), do qual também fazem parte o milho, sorgo, trigo e arroz os quais apresentam como principal hemicelulose os glucuronoarabinoxilanos (GAXs), embora também possua, em pequenas proporções, xiloglucanos, mananos e os β-glucanos, estes últimos relativamente abundantes em todos os tecidos da cana (BUCKERIDGE et al. 2008). A celulose é o principal componente da parede celular dos vegetais e o composto orgânico mais abundante da natureza, composto por um polímero, com até 15.000 unidades de D- glicose unidas por ligações glicosídicas β-1,4. Estas cadeias individuais estabelecem ligações de hidrogênio intermoleculares, rígidas e em forma de fita. A formação de pontes de hidrogênio intracadeias resulta na formação de fibrilas, uma estrutura altamente ordenada que se associam formando as fibras de celulose (BON et al., 2008). Apesar de sua estrutura relativamente simples, não é um polímero facilmente degradável; as moléculas estão associadas formando microfibrilas cristalinas, estabilizadas por pontes de

17 hidrogênio. Na parede celular a celulose encontra-se associada a outros polímeros como hemiceluloses, lignina e substâncias pécticas (FERRAZ, 2004). A hemicelulose é um grupo de polissacarídeos associados a outros componentes na parede celular, principalmente às microfibrilas de celulose por pontes de hidrogênio e formam ligações covalentes com a lignina e compostos fenólicos. As hemiceluloses ocorrem como heteropolissacarídeos, consistindo de uma cadeia linear de açúcares unidos por ligações β-1,4, geralmente com ramificações muito curtas. Os açúcares residuais presentes podem ser pentoses (xilose e arabinose) ou hexoses (glicose, manose e galactose). Os açúcares apresentam-se na forma de polímeros ramificados, de menor massa molecular que a celulose e podem ser homopolímeros (exemplo: xilana, formado por xilose) ou heteropolímeros (exemplo: glicomanana, formado por glicose e manose). O teor de polioses em diferentes tipos de lignocelulósico é bastante variável, mas pode ser admitido um valor médio de cerca de 20% (FERRAZ, 2004). A lignina é um constituinte da parede celular de todas as plantas vasculares, sendo considerada uma macromolécula constituída de unidades de fenilpropano, em uma conformação tridimensional e amorfa, representando de 20% a 30% do total dos lignocelulósicos. É um dos biopolímeros mais abundantes na biosfera, sendo uma parte considerável do carbono fixado por fotossíntese. Devido à estreita associação entre celulose, hemicelulose e lignina, esses compostos não estão uniformemente distribuídos na parede das plantas. A parte interna contém alta quantidade de celulose, enquanto a lamela média possui maior quantidade de lignina. Entretanto, os três compostos podem ser encontrados em todas as camadas da parede celular vegetal (AGUIAR FILHO, 2008). A tradicional matéria-prima para a obtenção de açúcares fermentescíveis via hidrólise ácida tem sido a madeira, mas devido às propriedades físicas e diversas vantagens do ponto de vista econômico, os resíduos agrícolas mostrou ser a matéria-prima mais favorável para a indústria de sacarificação, especialmente no cenário brasileiro. Sem dúvida alguma, o etanol é o mais importante produto final obtido pela fermentação do hidrolisado, porém outros produtos também podem ser obtidos, (RODRIGUES, 2007). Para obter os açúcares da celulose, principalmente a glicose, e da hemicelulose, principalmente a xilose, é preciso um pré-tratamento do material que remova a lignina, e então

18 uma hidrólise, quebrando as ligações nos polímeros e liberando os monômeros (glicose, xilose, etc). O processo de hidrólise pode causar degradação dos açúcares formados originando compostos tóxicos ao metabolismo microbiano, como furfural, hidroximetilfurfural e compostos fenólicos (CANETTIERE, 2004). A hidrólise alcalina proporciona baixos rendimentos na liberação de açúcares e gera um maior volume de efluentes quando comparada com outros processos. A hidrólise pode ser feita com catálise ácida ou enzimática; em alguns processos a hidrólise (sacarificação) e a fermentação são feitas simultaneamente ( Simultaneous Scarification Fermentation ) (MACEDO e NOGUEIRA, 2005). 3.4 Hidrólise de material lignocelulósico O material celulósico pode ser hidrolisado através de processos químico, físico, enzimático ou uma combinação de métodos. Os pré-tratamentos biológicos são usados às vezes em combinação com tratamentos químicos para solubilizar a lignina a fim de deixar a celulose mais acessível à hidrólise e a fermentação (GRAF e KOEHLER, 2000). A hidrólise (sacarificação) quebra as pontes de hidrogênio nas frações de hemicelulose e de celulose em seus componentes do açúcar: pentose e hexoses, (MACHADO, 2009), e esses açucares podem ser fermentados a etanol. Um dos processos de hidrólise mais utilizado é através da elevação e queda brusca de pressão. Portanto, a hidrólise é um processo que visa extrair do material celulósico a glicose, açúcar formado por uma cadeia de seis carbonos, e utilizado pelas leveduras para a transformação em etanol. A celulose, formada por moléculas de glicose unidas por ligações β-1,4, é o principal constituinte estrutural da parede dos vegetais, responsável pela extrema resistência. Devido à natureza da ligação β-1,4 entre as unidades de glicose, ocorre a formação de pontes de hidrogênio dentro da molécula, o que torna a molécula de celulose bastante rígida e plana, permitindo o empilhamento de várias cadeias que formam uma estrutura polimérica extremamente resistente (KOOLMAN, 2005). Como os polissacarídeos possuem muitos grupos hidroxila a formação de pontes de hidrogênio exerce uma influência forte na estrutura da cadeia. Os polímeros de D- glicose, como a celulose, podem ser representados por uma série de anéis piranosídicos rígidos

19 conectados por um átomo de oxigênio que faz ponte entre dois átomos de carbono, sendo difícil à quebra dessa cadeia. Segundo Buckeridge e colaboradores (2000), no caso da parede celular de cana, os glucuronoarabinoxilanos possuem ramificações de ácido glucurônico e arabinose cujas ligações são do tipo α, e estas são as primeiras a serem quebradas. Posteriormente, são quebradas as ligações β (como as β-1,4 dos xilanos). A celulose, por sua vez, é a última a ser hidrolisada devido à sua forte interação intermolecular, à completa ausência de água na estrutura da microfibrila e também ao fato das fibrilas estarem cobertas pelas hemiceluloses. O problema em um processo de hidrólise de polissacarídeos contendo ligações α e β é que o tempo necessário para hidrólise é diferente, os monossacarídeos liberados antes tendem a se degradar. Este processo é chamado de caramelização. Se a degradação é muito intensa ocorre formação de furfurais, compostos tóxicos para as leveduras na etapa de fermentação. Assim, ao hidrolisar uma mistura de celulose e hemiceluloses, a desconexão temporal das quebras das ligações glicosídicas de cada tipo de polissacarídeo torna-se um entrave para a produção de monossacarídeos fermentáveis. Nos processos industriais, a hidrólise ácida tem sido realizada com ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ). Segundo Martín e colaboradores (2007) a explosão a vapor pode ser realizada utilizando diferentes temperaturas e tempos. Observa-se que quanto maior o tempo e temperatura aplicados ao bagaço maior o rendimento em açúcares redutores, no entanto, maior será também a formação de compostos como furfural e 5-hidroximetilfurfural (HMF) que são inibidores da fermentação. A hidrólise ácida, por outro lado, pode produzir subprodutos tóxicos à fermentação, o qual reduz a eficiência do processo fermentativo. Ao contrário deste, a hidrólise enzimática utiliza as enzimas xilanases, que limpam a fibra, e permitem que as celulases atuem diretamente na celulose; tornando o processo mais eficiente. 3.5 Hidrólise ácida De acordo com Buckeridge et al.(2008) a produção de etanol celulósico tem como objetivo desmanchar a estrutura da parede celular para que os polissacarídeos possam ser usados como fonte de açúcares fermentáveis. O procedimento de hidrólise ácida utiliza um ácido concentrado para quebrar as ligações glicosídicas entre os monossacarídeos de um polissacarídeo.

20 A Figura 3 mostra o processo de forma simples. Os ácidos mais indicados para o processo de hidrólise em laboratório são ácido sulfúrico, ácido clorídrico e o ácido trifluoroacético. Cada um deles apresenta resultados diferentes, enquanto ácido sulfúrico e clorídrico discriminam pouco as ligações glicosídicas de diferentes tipos, atacando celulose e hemicelulose de forma similar, o ácido trifluoroacético quebra preferencialmente as ligações mais fracas, que são as ligações do tipo alfa (α) presente nas ramificações das hemiceluloses. FIGURA 3. Hidrólise ácida de celulose e arabinoxilano. (Fonte: BUCKERIDGE, 2000). O processo via ácido concentrado emprega o ácido sulfúrico como agente de prétratamento desfazendo a estrutura cristalina da celulose. Os carboidratos solubilizados são finalmente hidrolisados com ácido diluído e com isso a estrutura da celulose passa para o estado amorfo, possibilitando sua transformação completa e rápida em açúcares redutores, (RODRIGUES e CAMARGO, 2008). A hidrólise ácida, com ácido concentrado ou diluído ocorre em dois estágios para aproveitar as diferenças entre a hemicelulose e celulose. O primeiro envolve a hidrólise da hemicelulose, conduzida nas condições do pré-tratamento, em temperaturas altas, otimizando a hidrólise da fração celulósica.

21 O processo com ácido diluído utiliza altas temperaturas e pressões, com tempos de reação de segundos a alguns minutos, o que facilita o uso de processos contínuos, o processo de ácidos mais concentrado é conduzido em condições mais brandas e com a reação num longo tempo (BNDES, 2008). O ácido utilizado para a conversão da celulose em açúcar tem na etapa de hidrólise um processo crítico, pois o tipo de ácido e sua concentração têm um significado muito importante no custo da usina. Os processos que utilizam ácido clorídrico e sulfúrico concentrado podem atacar os equipamentos da usina corroendo-os, então, estes devem ser resistente ao ácido, o que tende a elevar o custo. Outra dificuldade advém da necessidade de neutralização da solução contendo os açúcares para que se possa proceder à fermentação. Em geral, para a neutralização, utiliza-se hidróxido de cálcio (cal hidratada). No entanto, ao se proceder desse modo, o ácido sulfúrico é convertido em sulfato de cálcio e não pode ser reaproveitado. Esse é o principal fator que contribui para o alto custo da técnica. Para se obterem níveis aceitáveis de comercialização (US$ 0,36/kg) será necessária a redução dos custos associados principalmente ao consumo e reutilização do ácido e ainda a melhora na produtividade e eficiência na conversão da biomassa (GOLDENBERG, 2007). Segundo Rodrigues (2008), os furfurais que se formam naturalmente durante a hidrólise ácida, poderiam ser aproveitados como matéria-prima na produção de solventes e resinas para fabricação de fibra de vidro e outros materiais plásticos. Sua comercialização pelas usinas poderia se tornar rentável e contribuir para reduzir o custo do etanol celulósico. Furfural é exclusivamente produzido a partir de material lignocelulósico por desidratação com ácido sulfúrico ou clorídrico das pentoses (principalmente a xilose) que está presente em quantidades significativas na hemicelulose (RODRIGUES, 2007). 3.6 Hidrólise enzimática A utilização da enzima para o processamento de biomassa para etanol é relativamente recente. Enquanto a química de obtenções de açucares a partir de madeira tem em torno de dois

22 séculos de pesquisa e desenvolvimento, as enzimas para hidrólise enzimática somente contam com 50 anos (MACHADO, 2009). Durante anos as enzimas são utilizadas como catalisadores na produção de etanol através da hidrólise do amido. No entanto, usa-se enzimas para conseguir a celulose, um processo complexo e protegido por matérias resistentes ao ataque químico como a lignina e a hemicelulose (ROSA, GARCIA, 2009). A hidrólise enzimática de materiais lignocelulósicos é um processo muito estudado por apresentar especificidade da reação, ausência de reações secundárias (que levariam à perda de rendimento), ausência de formação de produtos secundários (inibidores da fermentação alcoólica) e reação em condições suaves que não requerem altas pressões e temperaturas ou ambientes corrosivos para os equipamentos (BASTOS, 2007). A cristalinidade da celulose, a proteção da lignina e as configurações espaciais do complexo celulose-hemicelulose-lignina tornam este tipo de hidrólise um processo lento e pouco econômico. A estrutura capilar das fibras de celulose e a presença de metais diminuem a eficiência da hidrólise enzimática (CANETTIERE, 2004). No processo enzimático, a hidrólise é catalisada por enzimas chamadas celulases que atacam as cadeias de celulose para obter polissacarídeos menores as enzimas exoglucanases atuam nos terminais não-redutores das cadeias menores removendo a celobiose e β-glucosidases que hidrolisam a celobiose e outros oligômeros à glicose. As enzimas conhecidas como celulases hidrolisam a celulose liberando inclusive a glicose e outros açúcares, fonte de energia dos fungos, por degradação de parte de fibras de celulose. A celulase pode diminuir o comprometimento e o diâmetro das fibras de madeira. Um ataque fúngico preliminar facilita a abertura das fibras de madeira por métodos mecânicos (AGUIAR, 2008). A produção de celulases pelos fungos é lenta, porém de custo potencialmente baixo. A hidrólise conduzida em condições brandas em ph 4,8 e temperatura entre 45º e 50ºC, apresenta custo de utilidade relativamente baixo (BNDES, 2008).No caso da hidrólise enzimática dependente bastante da natureza do material celulolítico, a principal vantagem é que a reação pode ser realizada em condições favoráveis não sendo necessário temperaturas altas e pressões ou ph extremo. Comparativamente, a hidrólise com ácido diluído encontra-se em um estágio avançado, o limitante é o rendimento de 50 a 70%. A hidrólise com ácido concentrado apresenta rendimentos maiores e maiores problemas de inibidores, necessidade de recuperação do ácido e de

23 equipamentos resistentes a corrosão, o que compromete o desempenho econômico do processo. A hidrólise enzimática apresenta rendimentos de 75 a 85%, e melhorias são esperadas para 85 a 95%. Além disso, a não utilização de ácidos pode representar grandes vantagens não só econômica, em equipamentos com materiais mais baratos e menor custo operacional, como também ambiental, pois não há produção de resíduos (MACHADO, 2009). 3.7 Fungos lignocelulolíticos Há séculos os fungos filamentosos vêm sendo utilizados pela humanidade na produção de alimentos, bebidas e fármacos. Entretanto, a exploração do imenso potencial desses organismos como produtores de uma vasta gama de enzimas, extracelulares de aplicação industrial (catalases, amilases, xilanases, peroxidases, invertases, pectinase, queratinases, lipase e proteases, entre outros) somente se tornou possivel com o avanço do conhecimento da sua fisiologia, bioquímica e genética (MACHADO, 2009). Os fungos que decompõem substâncias lignocelulósicas ocorrem, geralmente, no solo colonizando raízes e resíduos vegetais, com importante função de reciclagem de nutrientes. Na natureza existe uma grande variedade de microrganismos que produzem celulases, entretanto apenas alguns são conhecidos como verdadeiros celulolíticos, isto é, capazes de degradar a celulose natural (AGUIAR FILHO, 2008). Os fungos degradadores de madeira são classificados em fungos de degradação branca, degradação marrom e degradação branda ou macia, de acordo com a morfologia da degradação. Esses fungos degradadores são taxonomicamente variados e pertence à divisão Basidiomycotina (MELO 2008 apud AGUIAR FILHO, 2008). O estudo das celulases começou no pós-guerra com objetivo estratégico de bioconverter materiais lignocelulósicos em combustíveis. Desde então, foi isolada uma espécie com alta capacidade celulolítica que se converteu no organismo modelo para esse tipo de estudo: Trichoderma reesei (REESE, 1976 apud GALVAGNO e FORCHIASSIN, 2004). O Trichoderma reesei tem atraído grande interesse por ter facilidade na degradação do material celulósico, ou seja, este fungo consegue liberar enzimas capazes de degradar o bagaço de cana e outras plantas que constituem fibras, o principal interesse é que ele ataque a celulose. No Brasil, onde há condição privilegiada de custo baixo de matéria-prima existem grandes

24 chances de viabilizar a hidrólise em escala comercial. Os açúcares resultantes são matériasprimas adequadas, não só para produção de etanol, mas para uma grande variedade de produtos. Também se busca valorizar a lignina residual, através do desenvolvimento de seus derivados (CARDOSO, 2008). As celulases são enzimas que constituem um complexo capaz de atuar sobre materiais celulósicos, promovendo sua hidrólise. A velocidade da decomposição dos lignocelulósicos na natureza é bastante variável dependendo das condições de umidade e temperatura nas quais são expostos, numa biodiversidade fúngica existente no local. Assim, a decomposição completa de um fragmento de material lignocelulósico pode demandar meses ou vários anos. Em condições frias e secas os lignocelulósicos podem permanecer décadas antes de ser decompostos (FERRAZ, 2004). Sistemas completos de celulases são produzidos por vários microrganismos, como os fungos Penicillium, Aspergillus, e outros. 3.8 Fermentação do hidrolisado para obtenção do bioetanol A fermentação ocorre diretamente em substâncias açucaradas como o caldo de cana, suco de frutas e de beterraba açucareira, e indiretamente em substâncias amiláceas como o milho, trigo, arroz e batatas e substâncias celulósicas como madeira e papel para obtenção de diferentes compostos inclusive o etanol. A utilização de hidrolisados de bagaço de cana-de-açúcar como substrato para fermentação é uma opção natural para aumentar a produção de etanol nas destilarias (CETENE,2011). Nesta etapa o hidrolisado proveniente do pré-tratamento ácido, rico em açúcares, é fermentado pela levedura Sacharomyces cerevisae. As leveduras são formadas por carboidratos, que funcionam como material energético, de estrutura e de reserva, por lipídios com função estrutural, proteínas com funções estruturais e principalmente catalíticas, sendo a hidrólise da molécula de sacarose em uma molécula de glicose e frutose a mais importante. Essas proteínas com ação catalítica são denominadas enzimas, e no processo fermentativo é a invertase, que realiza a hidrólise da sacarose (AMORIM e OLIVEIRA, 1982).

25 O hidrolisado sofre a ação das leveduras, com a transformação dos açúcares em etanol, CO 2 e outros sub-produtos em menores quantidades; duas opções básicas de processo são consideradas para a fermentação do hidrolisado da celulose contida no material lignocelulósico; a primeira alternativa considera a fermentação realizada após o término da etapa de hidrólise, permitindo que o processo de produção de álcool a partir do material lignocelulósico seja acoplado completamente à planta convencional, com o hidrolisado sendo misturado ao caldo de cana alimentado à dorna de fermentação; a segunda alternativa para a conversão de celulose a etanol é a realização do processo de sacarificação e fermentação de forma simultânea (SSF), num único reator, levando teoricamente, a maiores velocidades, maiores rendimentos e mais elevadas concentrações de produto, principalmente devido à redução do efeito de inibidores no processo, com a desvantagem de se trabalhar com um controle rígido de temperatura, ph, entre outros fatores durante as operações de hidrólise e fermentação (APTA, 2011). O hidrolisado da hemicelulose contida no material lignocelulósico, rico em pentoses, também pode ser convertido a etanol empregando microrganismos capazes de realizar esta transformação, ou manipulados geneticamente para esta finalidade (APTA, 2011). Ele passa por um processo de sacarificação por meio de enzimas e é fermentado pela levedura Sacharomyces cerevisiae. Na etapa final, ambos os líquidos provenientes das diferentes fermentações são destilados. O produto desta destilação é o etanol, que possui as mesmas características daquele fabricado a partir da cana em processo industrial (BIODIESELBR, 2010). A Petrobras ainda estuda enzimas mais eficazes para este processo de fabricação, testando enzimas disponíveis no mercado e pesquisando novos preparados enzimáticos (BIODIESELBR, 2010). Para Baudel (2007) o grande desafio da produção economicamente viável de bioetanol a partir de uma biomassa lignocelulósica consiste em determinar a melhor opção de disponibilizar a glicose a partir da hidrólise da celulose em termos de custo global, rendimento glicosídico e fermentabilidade do hidrolisado.

26 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Bagaço de cana-de-açúcar Neste estudo foi utilizado bagaço de cana-de-açúcar proveniente da Usina Ipiranga de Açúcar e Álcool Ltda., Descalvado - SP. O material foi armazenado sob refrigeração a 15ºC até o consumo total e peneirado em peneiras de malha 1,19 mm. 4.2 Microrganismos Os fungos basidiomicetos: Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei Rut-30, Trichoderma harzianum 3844, Aspergillus niger IZ-9 e Agaricus bisporus (G4) foram mantidas em meio MEA (extrato de levedura - 2g/L; extrato de malte 20g/L e ágar 20g/L) ou BDA (Filtrado de 200g de batata cozida em água, 15g de glicose e 15g de ágar, para 1L de meio). Os meios após esterilização em autoclave a 121ºC, 1 atm por 20 min foram inoculados e incubados a 28ºC, e mantidas durante 7 dias a 5ºC até o uso. 4.3 Hidrólise do bagaço No presente experimento utilizou quatro métodos de hidrólise do bagaço da cana-deaçúcar: o tratamento controle, tratamento ácido, tratamento biológico e tratamento biológico com dois fungos simultâneos. Segue os procedimentos realizados. Tratamento controle (TC): Cinco gramas de bagaço de cana peneirado e umedecido com 25 ml H 2 O foram autoclavados a 121ºC, 1 atm por 20 min. Após resfriamento à temperatura ambiente, foi adicionado 25 ml de H 2 O em cada frasco e realizada a filtração em papel de filtro, para a remoção dos compostos hidrolisados. A concentração de açúcares redutores (AR) e o ph foram determinados. Tratamento ácido (TA). Cinco gramas de bagaço de cana peneirado foram submetidos à pré-tratamento ácido, utilizando 25 ml de ácido sulfúrico (H 2 SO 4 2%, v/v) e autoclavados a 121ºC, 1 atm por 20 min. Após o resfriamento o material foi neutralizado com adição de 8 ml de solução aquosa de hidróxido de sódio (NaOH, 2N, M= 40g). Para a remoção dos compostos

27 hidrolisados, foram adicionados 25 ml de H 2 O, realizada a filtração em papel de filtro, e análise dos açúcares redutores e ph. Tratamento biológico (TB). Os fungos Phanerochaete chrysosporium, Trichoderma reesei Rut-30, Trichoderma harzianum 3844, Agaricus bisporus (G4) e Aspergillus niger (IZ-9) foram inoculados em bagaço tratado como o controle e como o tratamento ácido e incubados a 28ºC em incubadora tipo BOD. Após diferentes tempos de incubação o hidrolisado foi obtido adicionando 25 ml de H 2 O ao frasco e filtrando em papel. Em alguns experimentos após adição de 25 ml de H 2 O o material foi transferido para câmara de, um equipamento como um destilador, onde por prensagem ocorre a obtenção do hidrolisado. Tratamento utilizando dois fungos simultaneamente (TB2). Amostras de bagaço preparadas como em controle e pré-tratamento ácido, conforme descrito acima, após neutralização, o bagaço foi inoculado com um plug de P. chrysosporium e mantido a 28ºC em incubadora (BOD) por 4 dias, suficiente para o desenvolvimento do fungo. Após este período, foi inoculado nos frascos um plug de Trichoderma reesei Rut 30 e mantido a 28ºC em incubadora (BOD). Em diferentes tempos de incubação foram obtidos os hidrolisados, conforme descrito acima e realizadas as análises de AR e ph. 4.4 Fermentação do hidrolisado Os ensaios de fermentação foram realizados com hidrolisados obtidos após tratamento ácido do bagaço e neutralização. Para isto, os hidrolisados foram concentrados por aquecimento direto em chama, obtendo-se o mosto de fermentação, com 14,8º Brix. O primeiro ensaio foi analisado por determinação da perda de peso, já que ocorre formação de CO 2 na fermentação, que pode ser acompanhado por pesagem dos frascos em balança analítica. As amostras contendo 12,5 ml de mosto e 0,25 g de fermento, Saccharomyces cerevisiae Y 904, foram pesadas antes e após incubação a 32ºC por 24 horas. O segundo ensaio de fermentação foi realizado transferindo 60 ml de mosto resfriado para Erlenmeyer (250 ml) e adicionando 1,2 g de fermento, S. cerevisiae Y-904. As amostras, em triplicata, foram incubadas a 32ºC em estufa por 24 horas. Os Erlenmeyers foram pesados no início e no final do experimento. Análises de ART, AR e viabilidade celular foram realizadas no

28 início e final da fermentação, enquanto a concentração células de levedura foi obtida apenas no vinho (final da fermentação). O terceiro ensaio de fermentação foi realizado transferindo 80 ml de mosto resfriado para Erlenmeyer (250 ml) e adicionando 1,6 g de fermento, S. cerevisiae Y-904. As amostras, em triplicata, foram incubadas a 32ºC em estufa por 24 horas. Os erlenmeyers foram pesados no início e no final do experimento. Análises de ART e AR foram realizados no início e final da fermentação, enquanto a concentração células de levedura foi obtida apenas no vinho (final da fermentação). A viabilidade celular foi acompanhada durante o período. 4.5 Análises físico-químicas e microbiológicas A concentração de açúcares (AR) foi determinada pelo método do ácido 3,5 dinitrossalicílico (DNS) (MILLER, 1959), no qual alíquotas de 0,5 ml das amostras foram transferidas para tubos de ensaio contendo 0,5 ml da solução do reagente DNS. Após aquecimento em banho-maria em temperatura de ebulição por 5 minutos e posterior resfriamento em água corrente foi adicionado 5 ml de água destilada a cada amostra. A leitura de absorbância a 540 nm de cada amostra foi efetuada em espectrofotômetro digital FEMTO 700S. O branco da reação, utilizado para calibrar o aparelho, foi obtido utilizando somente 0,5 ml água destilada. A absorbância observada foi correlacionada em concentração de açúcar redutor (AR) utilizando uma curva padrão de glicose, obtida a partir de uma solução estoque contendo 1,0 g de glicose em 1000 ml de água destilada e convenientemente diluída. As amostras seguiram o mesmo procedimento descrito acima. A equação da reta obtida no gráfico correlaciona os valores de concentração de glicose com a respectiva absorbância. O método do ácido dinitrossalicílico (DNS) é dos mais empregados. Este reagente é composto de ácido dinitrossalicílico, sais de Rochele, fenóis, bissulfito de sódio e hidróxido de sódio. O ácido DNS foi muito discutida durante vários anos. O ácido 3,5 dinitrossalicílico é reduzido para ácido 3- amino-5 nitrosálico, um produto de coloração laranja, enquanto o grupo aldeído dos açúcares redutores são oxidados para grupos carboxílicos(miller, 1959), conforme mostra a Figura 4.

29 FIGURA 4. Reação do DNS com o açúcar redutor (MILAGRES, 1994). 4.6 Análise dos Açúcares por HPAEC-PAC As amostras foram submetidas à quantificação do conteúdo de monossacarídeos via HPAEC-PAC (High Performance Anion Exchange Chromatography with Pulsed Amperometric Detection), ajustando o equipamento de acordo com Bragatto (2007). As curvas de concentração para cada monossacarídeo foram construídas de acordo com o perfil cromatográfico das amostras com os referidos padrões: D-Fucose, D-Arabinose, D- Galactose, D-Glicose, D-Xilose, todos da Sigma. As quantificações foram realizadas com o auxílio do equipamento ICS 2500, HPLC Dionex equipado com DS50 gradiente; detector amperométrico ED50 com eletrodo de ouro e um amostrador automático AS50. O eluente de arraste utilizado foi 4 mm de NaOH e o eluente de limpeza foi de 200 mm de NaOH, com fluxo de 1 ml.min -1, pressão no sistema de aproximadamente 1500 psi. As amostras forma injetadas com volume de 25 µl determinado pelo loop de amostragem. A coluna utilizada foi a de troca aniônica Dionex CarboPac PA1 (4 x 250 mm) com coluna-guarda CarboPac PA1 (4 x 50 mm). 4.7 Concentração de açucares redutores totais (ART) A concentração de açúcares redutores totais (ART) foi obtida após inversão ácida da sacarose. Para isto, 5 ml da amostra foi transferida para balão volumétrico de 100 ml, adicionando-se 25 ml de ácido clorídrico HCl 1,3N. Após 30 minutos em banho a 60-65 ºC, os balões foram resfriados em água corrente, até atingir a temperatura ambiente. As amostras foram

30 neutralizadas com solução de NaOH 4N, utilizando como indicador papel Tornassol. Depois de completar o volume do balão com água destilada e homogeneização do mesmo, as amostras foram convenientemente diluídas de modo a situar a concentração de redutores totais no intervalo linear da curva padrão do método adotado. A curva padrão foi obtida toda vez que o regente de DNS foi preparado, uma das curvas utilizadas está apresentada no Gráfico 1. Gráfico 1. Curva padrão de glicose, obtida pelo método do DNS 4.8 Biomassa A biomassa foi determinada por turbidimetria pela relação da absorbância da massa seca de levedura presente em solução, em 610 nm. Para medir a concentração de células, uma alíquota do mosto inoculado foi diluída e efetuada a leitura de absorbância a 610 nm. A curva padrão foi obtida correlacionando uma concentração conhecida de células e a absorbância a 610nm. 4.9 Viabilidade das células de levedura A viabilidade das células de levedura foi determinada através da coloração diferencial das células pela solução de azul de metileno (10µL de caldo fermentado e 90 µl de solução de azul

31 de metileno). A contagem das células foi realizada por microscopia ótica utilizando câmara de Neubauer espelhada em microscópio OLYMPUS, modelo BH, em aumento de 400x, de acordo com a metodologia descrita por Oliveira et al. (1996). Foram consideradas células viáveis aquelas que se apresentavam incolores, enquanto que as não viáveis apresentavam cor azulada. Os resultados foram expressos em porcentagem, sendo que a viabilidade representa a relação entre células viáveis e o total de células de levedura, seguindo a relação: Viabilidade celular n o células vivas (CV) x 100 = (% células vivas) n o células contadas 4.10 Umidade de bagaço Para a análise de umidade o bagaço de cana-de-açúcar foi umedecido com água destilada, na proporção 1:5, foi autoclavado a 121ºC e 1 atm por 20 minutos. Após resfriamento do material, uma amostra foi transferida para os cestos da estufa Spencer e submetido a aquecimento a 105ºC por 60 min. Após resfriamento os cestos foram pesados novamente até peso constante. As análises foram realizadas em duplicata, para os tempos iniciais, 5 e 10 dias. A diferença de peso foi transformada em umidade pela fórmula: U = (Pi Pf) x 2

[AR] (mg/ml) 32 5. RESULTADOS E DISCUSSÕES 5.1 Liberação de açúcar redutor de bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado O bagaço de cana foi submetido à pré-tratamento com água ou ácido sulfúrico e aquecimento. Os resultados mostram que o pré-tratamento ácido aumenta a quantidade de açúcar redutor obtido no hidrolisado (Figura 5). 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 H2O H2SO4 FIGURA 5. Açúcares redutores liberados após pré-tratamento do bagaço de cana 5.2 Tratamento biológico do bagaço de cana-de-açúcar pré-tratado Os fungos T. reesei Rut-30, T. harzianum 3844 e P. chrysosporium foram cultivados em bagaço de cana pré-tratado com água ou ácido. Antes da inoculação o bagaço foi lavado e neutralizado. Após 5 e 10 dias foi obtido o hidrolisado para cada frasco. Os resultados mostram que os fungos cresceram pouco e ocorreu pequena liberação de açúcar (Figura 6). Como o bagaço hidrolisado foi lavado, ocorrendo à retirada dos açúcares, os fungos tiveram que hidrolisar o bagaço para o seu crescimento. Neste caso, os valores de açúcar liberado foram inferiores ao observado em outros trabalhos. Viégas et al (2009), trabalhando com T. reesei, obteveram uma atividade enzimática de 0,56 FPU/mL, quantidade suficiente para quebrar as moléculas de celulose, obtendo 20,40 mg de AR/100g de bagaço.