Dengue IgM/IgG BiSpot

. B por hemaglutinação (HAI) tem sido usado tradicionalmente para diferenciar entre infecção primária e secundária da Dengue, onde o título de HAI 1:2560 é definido como um cut-off para infecção secundária. Entretanto, o teste de HAI sofre influência de várias limitações, incluindo a dificuldade para padronização, pré-tratamento de amostras, necessidade de amostras de soro pareadas e inaplicabilidade para diagnóstico de infecção primária. A utilização do sistema ImmunoComb na detecção simultânea da presença de Dengue IgG e IgM fornece um diagnóstico presuntivo de infecção por Dengue, incluindo a diferenciação entre a infecção primária e secundária, a partir de uma amostra única de soro ou plasma. Código: 60483002 Dengue IgM/IgG BiSpot Formato: 3 x 12 Testes O kit ImmunoComb II Dengue é um teste para a detecção qualitativa simultânea dos anticorpos IgM e IgG para o virus da Dengue no soro ou plasma humanos e para a diferenciação entre infecção primária e secundária. Podem ser realizados trinta e seis testes com um kit. Introdução A febre da Dengue (DF), uma infecção transmitida por mosquito, sendo o maior problema epidemiológico global e de saúde pública, afetando regiões tropicais e subtropicais ao redor do mundo, predominantemente em áreas urbanas e semi-urbanas. Mais da metade da população mundial está sob o risco de infecção por Dengue. O vírus da Dengue é um arbovírus pertencente ao gênero Flavivírus. Quatro sorotipos distintos do vírus, estreitamente relacionados antigenicamente, foram definidos: Dengue-1, -2, -3 e -4. O vírus é transmitido pelos mosquitos vetores, primariamente, Aedes aegypti e Aedes albopictus. A forma febril da doença, comumente observada na infecção primária, é caracterizada pelo início da reação aguda de febre alta, dor de cabeça frontal, dor retro orbital e mialgias. Esta fase é freqüentemente caracterizada por erupção, dores nos ossos ou nas juntas e musculares, náusea, vômito e linfodenopatia. A enfermidade aguda pode permanecer por uma semana, com convalescência prolongada por várias semanas. A infecção secundária é freqüentemente associada à forma hemorrágica da doença (DHF). A DHF é comumente observada em crianças, mas também ocorre em adultos. Ela é caracterizada por quatro manifestações clínicas principais: febre alta, hemorragia, freqüentemente com hepatomegalia e em casos graves, sinais de insuficiência circulatória. Em muitos casos graves, estes pacientes podem desenvolver choque hipovolêmico, resultado da perda plasmática. Isto é conhecido como Síndrome de Choque da Dengue (DSS), que pode ser rapidamente fatal. A resposta imune durante a infecção primária da Dengue é caracterizada pelo aumento de anticorpos IgM por volta do quinto dia do início dos sintomas, podendo persistir ao longo de três meses. Os anticorpos IgG aparecem após duas semanas de infecção e persiste por muitos anos. A resposta imune da infecção secundária é caracterizada pelo aumento de IgG dentro de 1-2 dias após o início dos sintomas, enquanto que os anticorpos IgM são induzidos 20 dias depois. Métodos sorológicos tem sido desenvolvidos para avaliar a confirmação laboratorial da infecção por Dengue. O teste de inibição Princípio do Teste O teste ImmunoComb II Dengue IgM & IgG BiSpot é um imunoensaio enzimático (EIA) em fase sólida, baseado no princípio da imunocaptura. A fase sólida é um pente com doze projeções ( dentes ). Cada dente está sensibilizado em três posições: Ponto superior albumina de soro bovino biotinilada ( Interno) Ponto Intermediário Anticorpos de coelho para IgG humano Ponto inferior Anticorpos de coelho para IgM humano A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contem reagentes prontos para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. No início do teste, amostras de soro ou plasma são adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então inserido nas cavidades da fileira A. O IgM e o IgG humanos serão capturados, respectivamente, pelos anticorpos anti-igg e anti-igm nos pontos inferior e intermediário nos dentes do Pente (Figura 1). Na fileira B, o IgM e o IgG anti-dengue capturados nos pontos inferior e intermediário os dentes reagirão com antígenos da Dengue. Na fileira C, os antígenos da Dengue capturados nos dentes reagirão com anticorpos anti-dengue biotinilados. Na fileira D, o complexo antígeno/anticorpo biotinilado nos pontos inferior e intermediário dos dentes, e a albumina de soro bovino biotilinada no ponto superior dos dentes ( Interno) reagirão com a estreptavidina marcada com fosfatase alcalina (FA). Na fileira E, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada reagirá com componentes cromogênicos. Os resultados são visualizados como pontos cinza azulados na superfície dos dentes do Pente. Anti-IgG humano IgM e IgG Anti-IgM humano Humanos Antigeno Dengue Anti-Dengue Biotinilado Avidina/ Fosfatase substrato Chromogênico Figura 1. Princípio do Teste Captura de Anticorpo 10 minutos/ Reaçäo Dengue- Anti- Dengue 40 minutos/ Ligaçäo de Anti- Dengue Biotinilado 40 minutos/ Ligaçäo Avidina/ Fosfatase Alcalina 10 minutos/ Temperatura Ambiente Reaçäo Enzimatica de Cor 10 minutos/ 60483002/B1/OR 1

O kit inclui um Positivo (anti-dengue IgM e IgG) e um Negativo para serem inseridos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Positivo deve mostrar 3 pontos cinza azulados. O dente utilizado com o Negativo deve mostrar um ponto superior e nenhum ponto inferior ou intermediário ou pontos bem fracos. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e se o teste foi realizado corretamente. Conteúdo do Kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente está sensibilizado com três áreas reativas: Ponto superior albumina de soro bovino biotinilada ( Interno) Ponto intermediário anticorpos de coelho para IgG humano Ponto inferior anticorpos de coelho para IgM humano ImmunoComb II 83 83 83 83 83 83 83 83 83 83 83 83 Figura 2. Pente Interno Anti- IgG humano Anti- IgM humano Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo um saco de dessecante. Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras cobertas com folhas de alumínio. Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A- F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira são os seguintes: Fileira A Diluente de amostra Fileira B Antígenos da Dengue Fileira C Anticorpo monoclonal biotinilado para proteínas da Dengue Fileira D Estreptavidina conjugada com Fosfatase Alcalina Fileira E Solução de Lavagem Fileira F Solução de substrato cromogênico contendo 5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazólio (NBT) Como nenhum método pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos laboratoriais recomendados para trabalhar com soro ou plasma. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes (*), Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. (*) A menos que seja arquivado para documentação. Armazemamento do Kit O kit é embarcado numa temperatura de 2-8ºC. Durante o trasporte o kit pode ser conservado a 30ºC por um curto período de tempo, não excedendo o total de 48 horas. O controle interno indica que o kit não foi danificado durante o transporte. Armazenar o kit em sua embalagem original de 2-8ºC. Não congelar o kit. Os componentes devem ser armazenados de 2-8ºC após a abertura do kit. O desempenho do kit, após a abertura, é estável até a data de validade expressa no kit, quando armazenado de 2-8ºC. Após a primeira utilização o Pente e a Placa Reveladora não podem ser utilizados mais que três vezes. Manipulação de Amostras Tanto soro como plasma podem ser testados. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias a 2-8ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a 20 ºC ou inferior. Centrifugar as amostras de soro após descongelamento. Testar o sobrenadante. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Anticoagulantes como heparina, EDTA e citrato de sódio não causam nenhum efeito sobre o resultado dos testes. Procedimento do Teste Material Necessário Pipetas de precisão com ponteiras descartáveis para dispensar 10 µl, 25 µl e 100 µl. Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Microtubos ou tiras de cavidades de microtitulação. Preparando o Teste Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, Pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26ºC. Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 30 minutos; ou deixar em temperatura ambiente (22-26ºC) por 3 horas. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante no final do teste. 3. Misturar os reagentes invertendo a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado nas Instruções do Teste. Figura 3. Placa Reveladora Positivo 1 frasco (tampa vermelha) de 0,15 ml de plasma humano inativado por calor, contendo anticorpos anti-dengue IgG e IgM. Negativo 1 frasco (tampa verde) de 0,15 ml de plasma humano reconstituído inativado por calor e diluído, negativo para anticorpos para vírus da Dengue. para leitura dos resultados Perfurador para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. Segurança e Precauções Este kit é para ser usado apenas em diagnósticos in vitro. Os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e não foram reativos para os antígenos de hepatite B, e para anticorpos de HIV e HCV. Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um Pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número 83 do código do kit, para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (ver Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes incluindo 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para a embalagem de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clip, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit a 2-8ºC para uso posterior. 60483002/B1/OR 2

ImmunoComb 83 83 83 83 83 83 83 83 83 83 83 83 Figura 4. Quebrando o Pente Instruções do Teste Captura do Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 1. Pipetar 10 µl de uma amostra. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar enchendo e esvaziando repetidamente a ponteira com a solução. Descartar a ponteira. 2. Repetir o passo 1 para as outras amostras, incluindo dois s. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 3. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Misturar: Retirar e inserir o Pente nas cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por 10 minutos à temperatura ambiente. Ajustar o cronômetro. Próximo ao final dos 10 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final dos 10 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em papel absorvente limpo. Não tocar na superfície frontal dos dentes. Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira B) 4. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Misturar como no passo 3a. Incubar a Placa Reveladora com o pente por 40 minutos (ajustar o cronômetro) à temperatura ambiente. Perfurar a cobertura da fileira C. Após 40 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 3c. Ligação do Anti-Dengue Biotinilado (Fileira C) 5. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Agitar como no passo 3a. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por 40 minutos (Ajustar o cronômetro) à temperatura ambiente. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 40 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso a embalagem original do kit. Armazenar a 2-8ºC. Resultados dos Testes Validação Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições abaixo devem ser cumpridas (veja Figura 5). 1. O Positivo deve produzir três pontos no dente do Pente. 2. O Negativo deve produzir um ponto superior ( Interno). O ponto inferior ou o intermediário não devem aparecer ou aparecer fracamente, sem afetar na interpretação dos resultados. 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior ( Interno). Se alguma destas três condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Positivo Negativo Figura 5. Validação dos testes Resultados Inválidos Leitura e Interpretação dos Resultados Interpretação Visual de Dengue IgM Comparar a intensidade do ponto inferior de cada dente de amostra com o ponto inferior do dente do Positivo (figura 6). Um ponto com intensidade maior ou igual à do ponto do controle positivo indica um resultado positivo para a amostra. Nenhum ponto ou um ponto com intensidade menor que o ponto do Positivo indica ausência de anticorpos IgM anti-dengue na amostra (Resultado Negativo). Amostras equívocas devem ser testadas. Se a interpretação permanecer equívoca, uma nova amostra deve ser coletada. Ligação da avidina modificada/ fosfatase alcalina (Fileira D) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar. Incubar a Placa Reveladora com o Pente por 10 minutos à temperatura ambiente. Perfurar a cobertura da fileira E. Após 10 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Primeira Lavagem (Fileira E) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar: vigorosamente, retirar e inserir o pente no mínimo 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Negativo < Positivo < Figura 6. Resultado dos Testes Amostra Positiva IgM Presença de Anticorpos para Dengue IgM Reação de Cor (Fileira F) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Incubar a Placa Reveladora com o Pente exatamente 10 minutos (ajustar o cronômetro) à temperatura ambiente. Após 10 minutos retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 9. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Descarte do resíduo Descartar as Placas Reveladoras, ponteiras de pipetas, microtubos ou tiras de microtitulação, papel absorvente e luvas usadas, como resíduo bioinfectante. Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se não foram utilizadas todas as cavidades da Placa Reveladora, podem ser guardadas para uso posterior: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora esteja vazia. Leitura do e Interpretação da Dengue IgG A presença de IgG específico anti-dengue em cada amostra pode ser avaliada pela comparação da intensidade de cor do ponto intermediário de cada dente, com a escala de cor no fornecido com o kit. Este processo é realizado como a seguir (figura 7): 1. Calibrar o. Colocar o ponto intermediário do dente do Positivo sob a intensidade de cor semelhante ao da escala. Ajustar a régua de modo que C+ apareça na janela acima da intensidade de cor selecionada. 2. Ler os resultados sem alterar a posição calibrada da régua. Comparar a intensidade de cor de cada ponto intermediário com a intensidade mais parecida da escala de cor. Qualquer ponto intermediário com uma intensidade de cor igual ou maior que a intensidade na escala de cor na janela abaixo do CO deve ser considerado como Positivo para Dengue IgG. Na ausência de IgM positivo, qualquer ponto intermediário com intensidade de cor maior que o ponto CO mas menor que C+ deve ser considerado como Negativo sem evidência para presença de infecção. Um ponto intermediário com uma intensidade de cor similar ou maior que o ponto de C+ pode ser utilizado como indicativo para Infecção 60483002/B1/OR 3

Secundária por Dengue. Calibrar o Orgenics CO DENGUE IgG 32 C+ Tabela 2. Especificidade do kit ImmunoComb II Dengue Amostras Número Negativo pelo Especificidade ImmunoComb II Dengue % Doadores de Banco de 312 310 99.3 Sangue Mulheres Grávidas 98 95 96.9 Doenças não Infecciosas 112 109 97.3 Doenças Infecciosas 110 106 96.3 Flavoviroses 37 35 94.6 Total 669 655 97.9 Figura 7. Resumo da Interpretação dos Resultados Leitura Presença de: Interpretação IgM IgG < C+ < CO Sem evidência para infecção por Dengue. < C+ CO S<C+ Sem evidência para infecção por Dengue. C+ < CO Pode indicar infecção primária por Dengue. C+ CO S<C+ Pode indicar infecção primária por Dengue. < C+ C+ Pode indicar infecção secundária por Dengue. C+ C+ Pode indicar infecção secundária por Dengue. Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os Pentes podem ser armazenados para documentação posterior. Limitações Como em outros testes para uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em relação a todos os sintomas, histórico clínico e outros dados laboratoriais realizados para o paciente. Características de Desempenho A. Sensibilidade Um estudo foi realizado com 365 amostras positivas para Dengue, obtidas de vários centros de saúde em áreas endêmicas na América Central (Colômbia, Guatemala e Venezuela) e nas Filipinas. Os resultados estão detalhados na tabela 1: Tabela 1. Sensibilidade do kit ImmunoComb II Dengue Especificidade Total do kit: 97,9% Valor Preditivo Positivo (PPV) Para IgG: 91,4% Para IgM: 91,4% Valor Preditivo Negativo (NPV) Para IgG: 100% Para IgM: 96,8% Bibliografia Gubler DJ. 1998. Dengue and Dengue hemorrhagic fever. Clin. Microbiol. Rev 11(3)480-496. Guzman MG and Krouri G. 1996. Advances in Dengue diagnosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 3:621-627. Innis BL et al. 1989. An enzyme-linked immunosorbent assay to characterize Dengue infections where Dengue and Japaneze Encephalitis co-circulate. Am. J. Trop. Med. Hyg. 40(4):418-427. Lam SK. 1995. Dengue hemorrhagic fever. Rev. Méd. Microbiol. 6:39-48. World Health Organization. 1997. Dengue haemorrhagic fever: Diagnosis, tretment, prevention and control. 2ª edition. Who publications, Geneva, Switzerland. Registro e Distribuição: Quantum Diagnóstico LTDA Avenida José Cândido da Silveira, 2100 Cidade Nova Belo Horizonte MG CEP: 30170-020 CNPJ : 05.524.816/0001-38 Atendimento ao consumidor: SAC: (31) 2122-2900 FAX: (11) 2122-2944 e-mail: astec@prodimol.com.br Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" Registro ANVISA nº80242750037 Resp. Técnico: Humberto Decerega Mendez CRQ-MG: 02300433 CONSERVAR ENTRE 2-8ºC Versão: 04/2010 Origem Número Amostras Definido positivo para Detectado pelo ImmunoComb Dengue IgG IgM IgG IgM IgG + IgM América 324 304 213 302 207 320 Central Filipinas 41 40 34 39 34 41 Total 365 344 247 341 241 361 Sensibilidade Total: Para IgG: 99,1% Para IgM: 97,5% Para IgG+IgM: 98,9% B. Especificidade Um estudo foi realizado com 669 amostras negativas para Dengue incluindo amostras obtidas de doadores de sangue de baixa e alta prevalência para Dengue, mulheres grávidas, doenças não infecciosas (câncer e doenças auto-imune) e doenças infecciosas, como HIV, HCV e HBV e de pacientes com anticorpos de outras flavoviroses (Encefalite Japonesa, Febre Amarela, Vírus Oeste do Nilo). Os resultados estão resumidos na Tabela 2. Versão: 60483002/B1/OR (04/2010) 60483002/B1/OR 4

Resumo dos Principais Procedimentos do Teste Trazer a Placa Reveladora á temperature ambiente 30 min a 37 C. 1 2 3 4 Aspirar amostras e controles Adicionar amostras e controles na fileira A. Remover o Pente da embalagem 5 6 7 8 Inserir e agitar o Pente na fileira A. Incubar á temperature ambiente Abrir a fileira B Absorver o liquido residual do Pente Inserir e agitar o Pente na fileira B. Incubaçäo. Após misturar / agitar e incubar nas fileiras C,D e E 9 10 Reaçäo de corn a fileira F Resultados Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II Dengue IgM & IgG BiSpot. (Para instruções detalhadas, favor ver o texto completo) 1. Trazer todos os reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura ambiente. 2. Dispensar 10 µl de cada amostra e controle nas cavidades separadas da fileira A da Placa Reveladora. 3. Colocar o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1. Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste Etapa Fileira Proceder como a seguir Captura de Anticorpo A Misturar; incubar 10 minutos; absorver. 1 Reação Antígeno-Anticorpo B Agitar; incubar 40 minutos; absorver. Ligação de Anti-Dengue Biotinilado C Misturar; incubar 40 minutos; absorver. Ligação de Avidina/ Fosfatase D Agitar; incubar 10 minutos; absorver. Alcalina modificada Lavagem E Agitar; incubar 2 minutos; absorver. Reação de cor F Agitar; incubar 10 minutos. Reação de Parada E Incubar 1 minuto; secar ao ar livre. Dobrando e quebrando o Pente 2 60483002/B1/OR 5