Chlamydia trachomatis IgG

Transcrição

1 B Chlamydia trachomatis IgG Código: Formato: 3 x 12 testes Somente para Uso Diagnóstico in Vitro Uso Pretendido O kit ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgG é um teste EIA rápido para a determinação semiquantitativa de anticorpos IgG para Chlamydia trachomatis, em soro ou plasma humano. Podem ser realizados trinta e seis testes com um kit. Introdução As Chlamydias são bactérias Gram negativo, sem motilidade, com um ciclo de vida intracelular obrigatório em células eucarióticas. O gênero Chlamydia inclui 4 espécies: C. trachomatis, C. psittaci, C. pneumoniae e C. pecorum, que em largo espectro causam doenças humanas e animais bem conhecidas e caracterizadas. As quatro espécies possuem um antígeno lipopolissacarídeo (LPS) gênero específico comum, além de antígenos protéicos de membrana espécie-específicos. A Chlamydia trachomatis é conhecida como o agente causador do tracoma. Entretanto, a infecção genital devido à C. trachomatis é a doença sexualmente transmitida (DST) mais comum em muitos países. Os tipos mais freqüentes de DST induzidas por C. trachomatis são: infecções urogenitais, especialmente a uretrite não-gonocócica (UNG) e epididimite nos homens e doença inflamatória pélvica (DIP) nas mulheres. Embora geralmente assintomática, a infecção não diagnosticada nas mulheres pode levar a salpingite aguda, com alto risco de gravidez ectópica ou infertilidade tubária. Também foram reportadas conjuntivite neonatal e pneumonia, provavelmente adquiridas durante a passagem através do canal de nascimento infectado. O processo tradicional para diagnóstico laboratorial para C. trachomatis é o isolamento em cultura de células. Entretando, a cultura exige condições rigorosas de coleta e transporte, bem como técnicas especializadas e equipamentos caros. Os métodos de detecção direta de antígenos, tais como o imunoensaio enzimático (EIA) e o ensaio de imunofluorescência direto (IFD) ainda são influenciados pela carência de amostras adequadas que afetam o desempenho do teste, principalmente a sensibilidade. A hibridização baseada em ácidos nucléicos e testes de amplificação fornecem altos níveis de especificidade e sensibilidade. Além disso, os métodos moleculares são caros e requerem um alto nível de habilidade para realizar e analisar o teste corretamente. A detecção sorológica de anticorpos para Chlamydia é um meio mais conveniente e altamente sensível para diagnosticar as infecções por Chlamydia. Este método também facilita o diagnóstico em casos de acesso físico problemático. Entretanto, na maioria dos testes, a reação cruzada entre as espécies impede a interpretação clínica significativa dos resultados. O teste de microimunofluorescência (MIF), que permite a discriminação entre as espécies, requer um alto nível de habilidade para ser realizado e interpretado adequadamente. Dependendo do título e de sua cinética, a presença de anticorpos IgG anti-c. trachomatis pode ser indicativo de uma infecção passada por Chlamydia ou para o estado ativo em infecções agudas, crônicas ou recorrentes por Chlamydia. O kit ImmunoComb Chlamydia tracomatis IgG utiliza amplamente os antígenos sorotipo L2 que reagem fortemente com outros sorotipos para a identificação e quantificação de anticorpos IgG anti-c. trachomatis. Princípio do Teste O teste ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgG é um ensaio imunoenzimático (EIA) indireto em fase sólida. A fase sólida é um pente com 12 projeções ( dentes ). Cada dente está sensibilizado em duas posições: Ponto superior anticorpos de cabra para imunoglobulina humana (Controle Interno) Ponto inferior antígenos de C. trachomatis inativados A Placa Reveladora tem 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades, cada fileira contendo reagentes prontos para uso em diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo o Pente de fileira a fileira com incubação em cada etapa. Antes de iniciar o teste, as amostras de soro ou plasma são adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O Pente é então inserido nas cavidades da fileira A. Os anticorpos anti-c.trachomatis, se presentes na amostra, irão ligar-se especificamente aos antígenos de Chlamydia no ponto inferior dos dentes do Pente (figura 1). Simultaneamente, as imunoglobulinas presentes nas amostras serão capturadas pela imunoglobulina anti-humana do ponto superior (Controle Interno). Os componentes não ligados são lavados na fileira B. Na fileira C, os IgG humanos capturados nos dentes reagirão com anticorpos anti-igg humano marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras, os componentes não ligados são removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada irá reagir com o substrato cromogênico. Os resultados são visualizados como pontos cinza azulados na superfície do dente do Anticorpos anti-c.trachomatis Conjugado anti-igg Humano Substrato cromogênico Figura 1. Princípio do Teste Formação do complexo antígeno C.trachomatis-anticorpo 10 min Ligação do conjugado anti-igg Humano, 20 min Reação enzimática de cor,10 min O kit inclui um Controle Positivo (IgG anti-c.trachomatis) e um Controle Negativo, para serem inserídos em cada ensaio. Ao término do teste, o dente usado com o Controle Positivo deve mostrar 2 pontos cinza azulados. O dente utilizado com o Controle Negativo deve mostrar o ponto superior e nenhum ponto inferior ou um ponto inferior bem fraco. O ponto superior deve também aparecer em todos os outros dentes, para confirmar se o kit está funcionando adequadamente e que o teste foi realizado corretamente. Conteúdo do Kit Pentes O kit contém 3 Pentes de plástico. Cada Pente tem 12 dentes, um dente para cada teste (Figura 2). Cada dente é sensibilizado com duas áreas reativas: Ponto superior anticorpos de cabra para imunoglobulina humana (Controle Interno) Ponto inferior antígenos C. trachomatis inativados /B9/OR 1

2 ImmunoComb II Controle Interno Antígenos C.trachomatis Figura 2. Pente Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio, contendo dessecante. Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras, cobertas por folhas de alumínio. Cada Placa Reveladora (Figura 3) contém todos os reagentes necessários para o teste. A Placa Reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) de 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é: Fileira A Diluente de amostra Fileira B Solução de lavagem Fileira C Anticorpos de cabra anti-igg humano, marcados com fosfatase alcalina Fileira D Solução de lavagem Fileira E Solução de lavagem Fileira F Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazólio (NBT) armazenados a 2-8ºC. O desempenho do kit após a primeira utilização é estável até a data de validade do kit, quando armazenado a 2-8ºC. Após a primeira utilização, o pente e a placa não podem ser utilizados mais do que três vezes. Manipulação de Amostras Você pode testar tanto amostras de soro como plasma. Estes devem ser totalmente separados das células vermelhas do sangue por pelo menos uma centrifugação. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias a 2-8 ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a - 20 ºC ou inferior. Todas as amostras congeladas devem ser centrifugadas a g por 5 minutos em temperatura ambiente. Retirar cuidadosamente a amostra do sobrenadante. Se uma camada lipídica é formada na superfície do líquido, garantir que a amostra seja colhida a partir do liquído transparente abaixo da camada. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Os resultados do teste não foram afetados por anticoagulantes como heparina, EDTA e Citrato de sódio. Procedimento do Teste Material Necessário Pipetas de precisão e ponteiras descartáveis para dispensar 10 µl. Tesoura. Cronômetro ou relógio de laboratório. Preparando o Teste Trazer todos os componentes, Placa Reveladora, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de ºC. Figura 3. Placa Reveladora Controle Positivo 1 frasco (tampa vermelha) de 0,25 ml de plasma humano inativado pelo calor, diluído a um título ImmunoComb de 1:32 para IgG anti- C. trachomatis. Controle Negativo 1 frasco (tampa verde) de 0,2 ml de plasma humano diluído, inativado pelo calor, negativo para anticorpos para Chlamydia. Perfurador para a perfuração da folha de alumínio que cobre as cavidades da Placa Reveladora. CombScale TM para a leitura dos resultados do teste. Segurança e Precauções Todos os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para antígeno de superfície da hepatite B, anticorpos para hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos aceitos para laboratório para trabalhar com soro ou plasma. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes*, Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. * A menos que sejam armazenados para documentação posterior. Preparando a Placa Reveladora 1. Incubar a Placa Reveladora em uma incubadora a 37ºC por 30 minutos; ou deixar à temperatura ambiente (22 26ºC) por 3 horas. Trazer todos os reagentes (pentes, controles e amostras) à temperatura ambiente. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como resíduo bioinfectante no final do teste. 3. Misturar os reagentes agitando a Placa Reveladora. Nota: Não remover a folha de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura de alumínio usando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando indicado nas instruções do Teste. Preparando o Pente Precaução: Para assegurar o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar a embalagem de alumínio do Pente na extremidade marcada. Remover o 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para usar parte de um pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. Você precisa de um dente para cada teste. Cada dente mostra o número 10 do código do kit para permitir a identificação dos dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (n 0 de testes + 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para o saco de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clip, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit a C para uso posterior. ImmunoComb II Armazenamento e Estabilidade do kit O kit é fornecido a 2-8 ºC. Durante o transporte o kit pode ser conservado a 30ºC por períodos curtos de tempo não excedendo o total de 48 horas. Armazenar os componentes na embalagem original a 2-8ºC. Não congelar o kit. Após a primeira utilização do kit os componentes devem ser Figura 4. Quebrando o Pente /B9/OR 2

3 Instruções do Teste Reação Antígeno-Anticorpo (Fileira A da Placa Reveladora) 1. Pipetar 10 µl de uma amostra. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar enchendo e esvaziando repetidamente a ponteira com a solução. Descartar a ponteira. 2. Repetir o passo 1 para as outras amostras e para os dois controles. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 3. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Agitar: Retirar e inserir o Pente nas cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por 10 minutos. Ajustar o cronômetro. Próximo do final dos 10 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c) Ao final dos 10 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes com papel absorvente limpo. Não tocar a superfície frontal dos dentes. Primeira Lavagem (Fileira B) 4. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e inserir vigorosamente o Pente nas cavidades por pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 3c. Ligação do Conjugado (Fileira C) 5. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Misturar como no passo 3a. Ajustar o cronômetro para 20 minutos. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 20 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Segunda Lavagem (Fileira D) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 4. Neste intervalo perfurar a cobertura da fileira E. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Terceira Lavagem (Fileira E) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Após 10 minutos, retirar o Reação de Parada (Fileira E) 9. Colocar o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto, retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso futuro: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit. Armazenar a 2-8 ºC. Resultados dos Testes Validação Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as quatro condições abaixo devem ser cumpridas (veja figura 5). 1. O Controle Positivo deve produzir dois pontos no dente do 2. O sinal do ponto inferior do Controle Positivo deve ser aproximadamente igual à segunda cor da escala iniciando da esquerda, se utilizar o CombScale TM ) 3. O Controle Negativo deve produzir um ponto superior (Controle Interno). O ponto inferior não irá aparecer ou aparecerá bem fraco, não afetando a interpretação dos resultados. 4. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (Controle Interno). Esta etapa confirma se a amostra foi adicionada ao teste. Se alguma destas quatro condições não for cumprida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Controle Positivo Figura 5. Validação do Teste Controle Negativo Resultados Inválidos Leitura e Interpretação dos Resultados Interpretação Semiquantitativa por Leitura Visual O nível de IgG anti-chlamydia espécie-específico em cada amostra pode ser avaliado pela comparação da intensidade de cor do ponto inferior em cada dente com a escala de cor do CombScale fornecido com o kit. Isto é realizado como segue (Figura 6): 1. Calibrar o CombScale para avaliar os títulos de IgG anti-c. trachomatis. Colocar o ponto inferior do dente do Controle Positivo sob a intensidade de cor mais semelhante ao da escala. Ajustar a régua de modo que 1/32; C+ apareça na janela acima da intensidade de cor selecionada. 2. Ler os resultados sem alterar a posição calibrada da régua. Comparar a intensidade de cor de cada ponto inferior com a intensidade de cor semelhante ao da escala. Marcar o valor indicado na janela como sendo o título aproximado de anticorpos IgG para C. trachomatis para a amostra correspondente. Orgenics CombScale Calibrar o CombScale CHLAMYDIA TRACHOMATIS IgG 1/ 1/ 1/ 1/ 1/ C+ Figura 6. CombScale Interpretação dos Resultados Tabela 1. Interpretação dos Resultados Títulos ImmunoComb Interpretação < 1:16 Negativo 1:16 Fracamente Positivo 1:32 Positivo Tanto um título 1:64 ou um Fortemente positivo, indicando aumento de quatro vezes o infecção ativa por Chlamydia título de amostras coletadas em intervalos de 2 3 semanas* * Após 2 3 semanas coletar nova amostra de soro e testar tanto a primeira amostra como a segunda simultaneamente. Nota: É altamente recomendado o teste simultâneo para os anticorpos IgA para C. trachomatis, que são mais proeminentes na infecção ativa. Documentação dos resultados Como a cor desenvolvida no Pente é estável, os pentes podem ser guardados para documentação posterior. Limitações Como em outros testes destinados para uso diagnóstico in vitro, os resultados deste teste devem ser avaliados em conjunto com todos os sintomas, histórico clínico e outros testes laboratoriais realizados para o paciente. Além disso, pode ocorrer algum grau de reação cruzada com C. penumoniae /B9/OR 3

4 Características de Desempenho* A sensilibilidade e especificidade do ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgG foram testadas em diversos laboratórios. Foram analisadas 748 amostras e os resultados comparados com MIF como referência. Os resultados estão sumarizados na tabela 2. Tabela 2. Resultados dos Testes de Avaliação Clínica Teste ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgG de Referência Positivo Negativo Positivo Negativo Sensibilidade 91.6 % Especificidade 85 % (Estudo baseado em 401 doadores de sangue) Repetibilidade 10 pentes foram escolhidos aleatoriamente de várias partes de um lote de produção. Um soro foi testado 12 vezes nestes pentes. Em todos os pentes foi observado o mesmo título de IgG para Chlamydia trachomatis. Reprodutibilidade Três amostras foram testadas em pentes retirados de 3 diferentes lotes de produção. As amostras foram testadas em duplicata. Em todos os pentes foi observado o mesmo título de IgG para Chlamydia trachomatis. Reação Cruzada A reação cruzada com amostras positivas para outras doenças como HIV, HBsAg, EBV, Mycoplasma, Legionella, Doenças Auto-imunes e Fator Reumatóide foi considerada insignificante. A reação cruzada com amostras positivas para Chlamydia psitacci, Chlamydia penumoniae, CMV e Toxoplasmose não pode ser excluída. Interferência Não foram observadas interferências com amostras hemolíticas (hemoglobina acima de 10 mg/ml); lipêmicas (colesterol acima de 281,6 mg/dl); triglicérides (381,0 mg/dl) e bilirrubina elevada (acima de 20 mg/dl). * Informação detalhada disponível mediante solicitação. Bibliografia Barnes RC Laboratory diagnosis of human chlamydial infections. Clin Microbiol Rev 2: Bjercke S, Purvis K Characteristics of women under fertility investigation with IgA/IgG seropositivity for Chlamydia trachomatis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 51: Chutivongse S, Kozuh-Novak C, Annus J, Ward M, Cates Jr W, Rowe PJ, Farley TMM. WHO task force on the prevention and management of infertility Tubal infertility: Serological relantionship to past chlamydial and gonococcal infection. Sex Transm Dis 22: Clad A, Flecken U, Petersen EE Chlamydial serology in genital infections: ImmunoComb versus Ipazyme. Infection 22: Csángo PA, Sarov B, Schiotz H, Sarov I Comparison between cell culture and serology for detecting Chlamydia trachomatis in women seeking abortion. J Clin Pathol 41: Moss T, Darougar S, Woodland R, Nathan M, Dines RJ, Cathrine V Antibodies to Chlamydia species in patients attending a genitourinary clinic and the impact of antibodies to C. pneumoniae and C. psittaci on the sensitivity and the specificity of C. trachomatis serology tests. Sex Transm Dis 20: Odland JO, Änestad G, Rasmussen S, Lungren, Dalaker K Ectopic pregnancy and chlamydial serology. Int J Gynecol Obstet 43: Sarov I, Kleinman D, Holoman D, Potashnik G, Insler V, Cevenini R, Sarov B Specific IgG e IgA antibodies to Chlamydia trachomatis in infertile women. Int J Fertil 31: Schachter J Chlamydiae in Balows A. Hausler WJ, Hermann KL, Isenberg HD, Shadomy HJ. eds. Manual of Clinical Microbiology. Fifth edition. American Society for Microbiology, Washington, DC. pp Sellors JW, Mahony JB, Chemesky MA, Rath DJ Tubal factor infertility: an association with prior chlamydial infection and asymptomatic salpingitis. Fertil Steril 49: Sweet RL, Schachter J, Landers DV Chlamydial infections in obstetrics and gynecology. Clin Obstet Gynec 26: Theunissen JJH, Minderhourt-Bassie W, Wagenvoort JHT, Stolz E, Michel MF, Huikeshoven FJM Chlamydia trachomatis specific antibodies in patients with pelvic inflammatory disease: comparison with isolation in tissue culture or detection with polymerase chain reaction. Genitourin Med 70: Version: /B9/OR (05/2010) Registro e Distribuição: PRODIMOL BIOTECNOLOGIA S/A Praça Carlos Chagas 49-3 andar Santo Agostinho- CEP: Belo Horizonte-MG CNPJ: / Atendimento ao consumidor (31) ou (31) Registro ANVISA nº Resp. Técnico: Vanessa P. Figueiredo Soares - CRF-MG CONSERVAR ENTRE 2-8ºC Lote Vide Embalagem Data de Validade Vide Embalagem SOMENTE PARA USO DIAGNOSTICO in vitro Versão: /B9/OR (05/2010) /B9/OR 4

5 Resumo dos Principais Procedimentos do Teste Pré-incubação da Placa Reveladora: 3 horas à temperatura ambiente ou 20 minutos a 37 C Aspirar amostras e Adicionar amostras e Remover o Pente da controles. controles na filira A. embalagem. Misturar Inserir o Pente na fileira A e misturar. Incubar. Abrir a fileira B. Absorver o líquido residual do Inserir o Pente e agitar na fileira B. Incubar Após misturar/agitar e incubar nas fileiras C, D e E Reação de cor na fileira F Resultados Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb Chlamydia trachomatis IgG. (Para instruções detalhadas, por favor, veja o texto completo). 1. Trazer todos os reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26ºC. 2. Dispensar 10 µl de cada amostra e os dois controles nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora e misturar. 3. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 1. Tabela 1. Resumo do Procedimento de Teste Etapa Fileira Proceder como a seguir Reação antígeno-anticorpo A Misturar; incubar por 10 minutos; absorver. Lavagem B Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Ligação do conjugado C Misturar; incubar por 20 minutos; absorver. Lavagem D Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Lavagem E Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Reação de cor F Misturar; incubar por 10 minutos. 1 2 Reação de parada E Incubar por 1 minuto; secar ao ar livre. Dobrando e quebrando o /B9/OR 5