Introdução à Bioquímica Nucleotídeos e Ácidos Nucléicos Dra. Fernanda Canduri Laboratório de Sistemas BioMoleculares. Departamento de Física.. UNESP São José do Rio Preto - SP.
Tópicos! Estrutura e função dos nucleotídeos! Estrutura dos ácidos nucléicos! Visão geral da função dos ácidos nucléicos! Sequenciamento dos ácidos nucléicos! Tecnologia do DNA recombinante
Métodos para sequenciar ácidos nucléicos Sequenciamento manual : 2,3 -dideoxinucleosídeo-trifosfato ddntp Sequenciamento automático : Marcadores fluorescentes
Sequenciamento pelo método de terminação de cadeia seq. manual
Uso de marcadores fluorescentes - Sequenciamento automático
Tecnologia do DNA recombinante! Técnicas de clonagem! Bibliotecas genômicas! Amplificação de DNA por PCR! Aplicações da Tecnologia do DNA recombinante
Tecnologia do DNA recombinante
Como genes são isolados da fita de DNA??
As nucleases de restrição A endonuclease cliva um ácido nucléico no interior de uma fita polinucleotídica A exonuclease cliva um ácido nucléico por meio da remoção de um dos seus resíduos terminais
Técnicas de clonagem " Amplificação de um segmento de DNA 1. Um fragmento de DNA de tamanho apropriado é produzido por meio de endonucleases de restrição, e isolado 2. O fragmento é incorporado em uma outra molécula de DNA (vetor), que contém as seqüências necessárias para dirigir a replicação do DNA 3. O vetor recombinado é introduzido em células, onde é replicado 4. As células que contém o DNA desejado são identificadas, ou selecionadas
Clonagem Produção de múltiplos organismos idênticos, derivados de um ancestral comum Em um organismo hospedeiro (como E. coli) podem ser produzidas grandes quantidades do DNA
Uso da DNA-ligase na clonagem! A DNA-ligase une fragmentos de DNA para produzir uma molécula de DNA-recombinante
Plasmídeos bacterianos podem ser usados para clonar DNA! Plasmídeo: DNA circular Genes humanos são isolados pela clonagem de DNA
Vetor de clonagem - plasmídeo + fragmento de DNA (inserto) Plasmídeo recombinante
Os plasmídeos recombinantes são geralmente clonados em células bacterianas Processo denominado transformação
Bibliotecas genômicas Bibliotecas de cdna representam o RNAm produzido por determinado tecido
A hibridização permite que mesmo genes pouco relacionados possam ser identificados relação com a função de proteínas conhecidas
Amplificação de DNA por PCR! A reação em cadeia da polimerase amplifica sequências selecionadas de DNA Iniciadores! Proteínas celulares raras podem ser produzidas em grandes quantidades usando DNA clonado
PCR
Aplicações da Tecnologia do DNA recombinante
Estudo estrutural da CDK9 Objetivos Expressar a proteína quinase (CDK9), purificá-la, para então resolver sua estrutura cristalográfica a alta resolução. Usar as informações estruturais para desenhar drogas específicas.
Principal função das CDKs O ciclo celular
Ciclo de divisão celular: processo básico da gênese de novas células Mitose
A regulação da divisão celular é crucial para o desenvolvimento normal de organismos multicelulares O sistema controle do ciclo celular está baseado em duas famílias de proteínas que são chaves para o seu funcionamento: 1) quinases dependentes de ciclinas ( cyclindependent kinase CDKs), 2) ciclinas, denominadas proteínas ativadoras.
Cada subunidade catalítica da CDK pode associar-se a diferentes ciclinas Existem ao todo 13 CDKs (CDK1-CDK13). CDKs1-8 estão envolvidas no controle do ciclo celular. CDKs 9 e 10 são importantes reguladores transcricionais. CDKs 11-13 suas funções não estão bem claras Existem 15 ciclinas: Ciclinas A - T
CDKs e ciclinas
A formação, ativação e a separação dos complexos ciclinas-cdks são os eventos fundamentais que coordenam o ciclo celular
Proteínas regulatórias envolvidas em neoplasias
Quinase dependente de ciclina 9 (CDK9) CDK9 é uma subunidade catalítica da P-TEFb, um fator de transcrição que estimula a elongação da RNA polimerase II
Complexo de pré-iniciação para a transcrição da RNA polimerase II do HIV (Fackler et al., 2001).
Ex.: Replicação do vírus HIV O estudo estrutural de proteínas envolvidas na sua replicação são importantes para o desenvolvimento de novos inibidores da sua transcrição.
Clonando o gene da CDK9
cdna total + iniciadores PCR Amplificação do fragmento de cdna Sequenciamento Extração e purificação do gene da CDK9 plasmídeo Reação com ligase Inserção do gene da CDK9 no vetor pet23a Transformação Clonagem do vetor em Escherichia coli (DH10B) Purificação do vetor Clonagem e expressão em E. coli (BL21-DE3) Solubilização!! Purificação da CDK9
5 ggggacccggagcaggagcggcggcagcagcgactgggggcggcggcggcgcgttggag gcggccatggcaaagcagtacgactcggtggagtgccctttttgtgatgaagtttccaa atacgagaagctcgccaagatcggccaaggcaccttcggggaggtgttcaaggccaggc accgcaagaccggccagaaggtggctctgaagaaggtgctgatggaaaacgagaaggag gggttccccattacagccttgcgggagatcaagatccttcagcttctaaaacacgagaa tgtggtcaacttgattgagatttgtcgaaccaaagcttccccctataaccgctgcaagg gtagtatatacctggtgttcgacttctgcgagcatgaccttgctgggctgttgagcaat gttttggtcaagttcacgctgtctgagatcaagagggtgatgcagatgctgcttaacgg cctctactacatccacagaaacaagatcctgcatagggacatgaaggctgctaatgtgc ttatcactcgtgatggggtcctgaagctggcagactttgggctggcccgggccttcagc ctggccaagaacagccagcccaaccgctacaccaaccgtgtggtgacactctggtaccg gcccccggagctgttgctcggggagcgggactacggcccccccattgacctgtggggtg ctgggtgcatcatggcagagatgtggacccgcagccccatcatgcagggcaacacggag cagcaccaactcgccctcatcagtcagctctgcggctccatcacccctgaggtgtggcc aaacgtggacaactatgagctgtacgaaaagctggagctggtcaagggccagaagcgga aggtgaaggacaggctgaaggcctatgtgcgtgacccatacgcactggacctcatcgac aagctgctggtgctggaccctgcccagcgcatcgacagcgatgacgccctcaaccacga cttcttctggtccgaccccatgccctccgacctcaagggcatgctctccacccacctga cgtccatgttcgagtacttggcaccaccgcgccggaagggcagccagatcacccagcag tccaccaaccagagtcgcaatcccgccaccaccaaccagacggagtttgagcgcgtctt ctgagggccggcgcttgccactagggctcttgtgttttttttcttctgctatgtgactt gcatcgtggagacagggcatttgagtttatatctctcatgcatattttatttaatcccc accctgggctctgggagcagcccgctgagtggactggagtggagcattggctgagagac caggagggcactggagctgtcttgtccttgctggttttctggatggttcccagagggtt tccatggggtaggaggatgggctcgcccaccagtgactttttc 3
Mapa do vetor pet23a, mostrando os sítios de restrição no (MCS) sítio múltiplo de clonagem (flecha em preto).
Desenho dos primers Primer S: 5 CGC GAA TTC ATG GCA AAG CAG TAC GAC 3 Primer A: 5 CCG GAA TTC TCA GAA GAC GCG CTC AAA C 3 sítio da enzima de restriçã ção o Eco RI
pet23a + fragmento da CDK9 Vetor pet23a linearizado com enzima de restrição, mostrando a inserção do gene da CDK9 com T4 DNA ligase.
Intervençã ção o da atividade de CDKs
Moduladores diretos de CDKs Flavopiridol UCN-01 (7-hidroxi-estaurosporina) Olomoucina Roscovitina Purvanalol Conseqüê üências da inibiçã ção o de CDKs Interrupção do ciclo celular Apoptose Diferenciação Efeitos transcricionais
Inibidores de CDKs Ligam-se ao sítio de ligação do ATP, com o benzopirano ocupando a mesma região do anel de purina do ATP
Potenciais aplicações dos inibidores de CDKs Por estar envolvida na proliferação celular, apoptose, funções neuronais e transcrição, inibidores farmacológicos de CDKs são usados em múltiplas áreas terapêuticas.
Modelagem da CDK9 com flavopiridol Elementos de estrutura secundária da CDK9 complexada com o inibidor flavopiridol, obtida por modelagem molecular por homologia (MODELLER).
Situação atual do projeto Purificar em grande quantidade e tentar cristalizar a CDK9 para resolver sua estrutura cristalográfica