A base da espectrometria de massas

The father of MS and the first mass spectrometrist to win the Nobel Prize. Pure species and mixtures JJ Thomson's 'Plum Pudding Model' of the atom, a sphere of positive charge containing electrons

Mass spectra and isotopes The Nobel Prize in Chemistry 1922 "for his discovery, by means of his mass spectrograph, of isotopes, in a large number of non-radioactive elements, and for his enunciation of the wholenumber rule" Francis William Aston At the end of 1909 he accepted the invitation of Sir J.J.Thomson to work as his assistant at the Cavendish Laboratory, Cambridge, on studies of positive rays. It was during this period that he obtained definite evidence for the existence of two isotopes of the inert gas neon.

EI : Ionização por elétrons (Dempster e Nier)

Princípio Geral de EI Moléculas neutras, na fase gasosa (dessorção térmica), a uma pressão típica de 10-5 torr, são bombardeadas por elétrons, com energia típica de 70 ev. Ocorre principalmente a retirada ou captura de um eléctron formando íons M +. ou M -.. Íons positivos são em geral predominantes (~100 vezes mais). M -. se tornam importantes para moléculas com alta EA. M + e - (70 ev) M +. (~ 5 ev) + 2e - (65 ev) ē F 1 F 2 M M + F 3 F 4

Princípios Gerais Processo unimolecular. Os íons formados são rapidamente extraídos da fonte de ionização pelo eletrodo de repulsão ("repeller ). Íons moleculares são formados com excesso de energia interna e se fragmentam total ou parcialmente. EI é bastante popular: produz tanto o íon molecular (massa) como também fragmentos (estrutura); espectros reprodutíveis; bibliotecas de espectros de EI a 70 ev; estável; fácil de operar; alta sensibilidade. Aplica-se a moléculas de média e baixa polaridade e baixo peso molecular (~500u), voláteis e termo-estáveis: moléculas orgânicas relativamente pequenas.

Princípios Gerais Quando o íon molecular não é observado (devido a dissociação excessiva), é inútil diminuir a energia dos elétrons. Uma em cada 10 3-10 5 moléculas que entram na fonte de EI é ionizada. EI ocorre em ~10-16 s. Ocorre sem mudanças nas distâncias internucleares (Frank-Condon).

Esquema Geral

A diminuição da energia dos elétrons provoca uma queda brusca nas intensidades absolutas de todos os íons, mas um aumento na intensidade relativa do íon molecular.

Espectros Típicos de EI a 70 ev 2-Hydroxy-1,2-diphenyl-ethanone

100 56 41 OH 70 50 84 29 27 39 100 45 15 18 37 50 62 73 77 91 97 101 112 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 (mainlib) 1-Octanol 43 55 41 70 50 27 29 39 83 112 97 14 31 45 59 62 72 77 91 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 (mainlib) 1-Octene 55 100 41 50 27 29 39 70 112 83 67 51 15 32 77 97 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 (mainlib) 2-Octene

Alguns espectros de EI apresentam dissociação excessiva, outros pouca dissociação. M +. = massa e isótopos F + = estrutura

Espectro de Massas: Ionização por Elétrons (EI)

Isômeros C 3 H 6 O

M-1 Perda de hidrogênio radicalar M -. H M-15 Perda de metil radicalar M -. CH 3 M-29 Perda de etil radicalar M -. C 2 H 5 M-31 Perda de metoxi radicalar M -. OCH 3 M-43 Perda de propil radicalar M -. C 3 H 7 M-45 Perda de etoxi radicalar M -. OC 2 H 5 M-57 Perda de butil radicalar M -. C 4 H 9 M-2 Perda de hidrogênio M H 2 M-18 Perda de água M H 2 O M-28 Perda de CO ou etileno M-CO ou M- C 2 H 4 M-30 Perda de formaldeido M- CH 2 O M-32 Perda de metanol M-CH 3 OH M-44 Perda de CO 2 M-CO 2 M-60 Perda de ácido acético M-CH 3 CO 2 H

100 56 41 70 OH Íon Molecular 50 84 29 27 39 100 45 15 18 37 50 62 73 77 91 97 101 112 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 (mainlib) 1-Octanol 43 55 41 70 50 27 29 39 83 112 14 31 45 59 62 72 77 91 97 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 (mainlib) 1-Octene

Chemical Ionization CI Munson and Field - 1966

Princípios Gerais Ionização por reação química (ex: protonação : MH + ). A exotermicidade da reação controla a extensão dos processos dissociativos. Gases ionizantes típicos: metano, isobutano, amônia. Como em EI, aplica-se a moléculas de média e baixa polaridade e baixo peso molecular (~500u), voláteis e termo-estáveis: "moléculas orgânicas". Uma aplicação típica de CI ocorre para substâncias que não apresentam o íon molecular por EI. Adutos formados entre M e o íon reagente podem ser observados (Ex. M-NH 4+ ). Estes adutos podem diferenciar isômeros. CI é uma técnica branda de ionização, por provocar pouca ou nenhuma fragmentação da molécula ionizada.

CI IONIZAÇÃO QUÍMICA

Ionização Química (CI).

Controle da Exotermicidade da Reação: Extensão de Fragmentação Reação Íon/molécula CH 4 + e - 70 ev + CH 4 + CH + 4 CH 3 + H + + CH 4 CH 2 + H 2 + CH 4 + CH 4 CH + 5 + CH 3 + CH 3 + CH 4 C 2 H + 5 + H 2 + CH 2 + CH 4 C 2 H + 3 + H 2 + C 2 H + 3 + CH 4 C 3 H + 5 + + e - + e - 50 ev térmica H 2 H

Ionização Química (CI). Ionização Química Positiva: Metano: CH 4 + e -----> CH +. 4 + 2e ------> CH 3+ + H. CH +. 4 + CH 4 -----> CH 5+ + CH. 3 CH +. 4 + CH 4 -----> C 2 H 5+ + H 2 + H. Isobutano: i-c 4 H 10 + e -----> i-c 4 H +. 10 + 2e i-c 4 H +. 10 + i-c 4 H 10 ------> i-c 4 H 9+ + C 4 H 9 +H 2 Amônia: NH 3 + e -----> NH +. 3 + 2e NH +. 3 + NH 3 ------> NH 4+ + NH. 2 NH 4+ + NH 3 --------->N 2 H + 7

Reserpina EI 70 ev Reserpina CH 4 CI

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionization APPI Atmospheric Pressure Photo-Ionization

SIMS IONIZAÇÃO POR ÍONS SECUNDÁRIOS 1970 Benninghoven ion guns (LMIG) Ga+ and In+ Csþ ions give higher yield SF5 +, Bi + n, Au + n

FAB IONIZAÇÃO POR BOMBARDEAMENTO DE ÁTOMOS ACELERADOS (liquid SIMS)

Formação de átomos acelerados Xe + e - IONIZAÇÃO ÁTOMO LENTO Xe + ACELERAÇÃO Xe + ÍON LENTO Xe + ÍON LENTO Xe + + Xe ÍON RÁPIDO ÁTOMO LENTO ÍON RÁPIDO TROCA DE ENERGIA Xe + + Xe ÍON LENTO ÁTOMO RÁPIDO

Índice de popularidade - FAB

Matrizes

Efeito da Matriz

Sistema CF-FAB (continuous-flow FAB)

The Nobel Prize in Chemistry 2002 "for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules" Yamashita, M.; Fenn, J.B., J. Phys. Chem. 88 (1984) 4451. Whitehouse, C.M.; Dreyer, R.N.; Yamashita, M.; Fenn, J.B., Anal. Chem. 57 (1985) 675. Fenn, J.B.; Mann, M.; Meng, C.K.; Wong, S.F.; Whitehouse, C.M., Science 246 (1989) 64. "Electrospray Ionization for Mass Spectrometry of Large Biomolecules,

Popularidade do Electrospray

Príncipio Geral Uma solução acidificada ou basificada da amostra (ou neutra de um sal) é submetida a um spray eletrolítico sob pressão atmosférica. Um fino spray (aerosol) se forma (cone de taylor) na presença de um alto campo elétrico (+4000V ou 4000V). O contra-íon é oxidado ou reduzido e formam-se gôtas com excesso de carga (positiva ou negativa). O solvente das gôtas evapora com redução de volume, e as gôtas se subdividem. Eventualmente, devido a alta repulsão entre os íons de mesma carga, ou se formam gôtas contendo apenas um íon (modelo CRM) ou íons são expelidos das gôtas para a fase gasosa (modelo IEM de evaporação de íons).

O C OH HCl H 3 N + Cl - O C OH + 4.000 V H 3 N + O C OH ESI Positivo NH 2 NaOH H 2 N O C O - Na+ - 4.000 V H 2 N O C O - ESI Negativo

Enganando as moléculas neutras com curvas Z-spray (Micromass)

Fonte Z-spray ESI+, Full Scan Extracted at m/z 256 Total Run Time > 25 Hr More than 500 mg salt n = 1 n = 509 0.00 0.40 0.80 1.20 1.60 Time

Fonte de ESI: Ionização sob pressão atmosférica! MS

Proteínas Positive ESI-MS m/z spectrum of the protein hen egg white lysozyme

Ionização a Pressão Atmosférica (API). Eletrospray (ESI)/Pequenas moléculas Possibilidade de formação de íons com múltiplas cargas

Espectros de ESI-MS típicos : Pequenas Moléculas

n=(m1-1)/(m2 M1) n=(1131.2 1)/(1211.9-1131.2) = 14,1 M = n(m1 1) 14 (1131.2 1)= 15822,8

MALDI vs ESI

Popularidade do Electrospray

MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization The Nobel Prize in Chemistry 2002 "for the development of methods for identification and structure analyses of biological macromolecules" (Karas & Hillenkamp - 1987)

Popularidade do MALDI

MALDI fazendo um elefante voar!

MALDI- IONIZAÇÃO/DISSORÇÃO A LASER ASSISTIDA POR MATRIZ

Matrizes (1) α-cyano-4-hydroxycinnamic acid : CCA (2) 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (sinapinic acid) : SA (3) 2,5-dihydroxybenzoic acid. Razão matriz-amostra: 100:1 a 5000:1

Prepara-se solução da amostra e matriz (pequenas moléculas orgânicas). O solvente é evaporado resultando em uma solução sólido-sólido que é depositada sobre a superfície da sonda. Esta solução é então irradiada com laser. Ocorre aquecimento localizado e seletivo. A matriz absorve fortemente a radiação do laser. Ocorre a evaporação rápida da matriz e a molécula ionizada (ex: MH + ) é então liberada para a fase gasosa, e acelerada em direção ao analisador de massas pelo alto potencial (20.000 V) aplicado à sonda.

Espectros e Aplicações

MALDI de polímeros

Conceitos Importantes

Notação dos Espectro de Massas 100 Ion Abundance (%) 80 60 40 20 0 0 50 100 150 200 250 m/z Eixo y: Abundância % Eixo x: Relação massa/carga (m/z) Informações Estruturais Informação da Massa do Compostos

Algumas definições importantes Isóbaros São moléculas com diferentes elementos e mesma de massa molecular. Ex.: [C 5 H 6 O 4 ] + ; [C 6 H 10 O 3 ] +, [C 9 H 22 ] + = 130 Da Isótopos São núcleos associados ao mesmo elemento da tabela periódica (mesmo número atômico) mas com diferentes números de nêutrons. Ex: Hidrogênio, Deutério e Trítio

Espectro de Massas: ISÓTOPOS Elemento Carbono Hidrogênio Nitrogêio Oxigênio Enxoger Cloro Bromo Isótopo Abund. Relativa Isótopo Abund. Relativa Isótopo Abund. Relativa 12 C 100 13 C 1.1 1 H 100 2 H 0.016 14 N 100 15 N 0.38 16 O 100 17 O 0.04 18 O 0.2 32 S 100 33 S 0.78 34 S 4.4 35 Cl 100 37 Cl 32.5 79 Br 100 81 Br 98

Espectro de Massas: abundância isotópica Pico monoisotópico Pico do Carbono 13

Espectro de Massas Ion Abundance (%) 100 80 60 40 20 Espectro de dissociação/fragmentação Fragmentos Precursor Íon molecular 0 0 50 100 150 200 250 m/z

100 C 7 H 6 O 3 138.12 138.031694 C 60.87% H 4.38% O 34.75% 120 OH 92 O 50 O 152 39 65 15 53 28 18 45 50 55 76 81 104 109 137 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 (mainlib) Benzoic acid, 2-hydroxy-, methyl ester

Espectro de Massas: abundância isotópica 25% Para se estimar o número de carbonos em uma molécula: dividir a intensidade de A+1 por 1.1 (abundância do Carbono 13 na natureza). 25 / 1.1 = 23,7 ~ 23 átomos de carbono na molécula

Espectro de Massas: abundância isotópica Br - CH 3 15 uma 79 Br-CH 3 =94 81 Br-CH 3 =96 Informações: Relação m/z Presença dos isótopos Diferença de massa entre os sinais

Espectro de Massas: abundância isotópica Cloro Peso atômico = 35,453 Mistura de Cloro 35 (75,77%) e Cloro 37 (24,23%) 100 50.0 7.49e12 % CH 3 Cl 52.0 0 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 mass

Padrão isotópico: Cloro 35 (75,77%) e Cloro 37 (24,23%) 100 50.0 100 84.0 % CH 3 Cl % 86.0 CH 2 Cl 2 52.0 0 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 mass 87.9 0 74 76 78 80 82 84 86 88 90 92 94 96 mass 100 117.9 119.9 100 153.9 151.9 % CHCl 3 % 155.9 CCl 4 121.9 123.9 0 108 110 112 114 116 118 120 122 124 126 128 130 132 mass 0 157.9 145 150 155 160 165 mass

Padrões isotópicos complexos 100 % 178.9436 3.06e12 Composto contendo 1 átomo de Rutênio 172.9467 0 100 165 170 175 180 185 190 mass 279.8496 1.52e12 % Composto contendo 2 átomo de Rutênio 0 265 270 275 280 285 290 mass Evidência do número de elementos presentes na molécula

Medida de Massa Molecular Ex: M = 249 C 20 H 9 + C 19 H 7 N+ C 13 H 19 N 3 O 2 + Sistemas de Baixa resolução Ex: M = 249 C 20 H 9 + 249.0700 C 19 H 7 N+ 249.0580 C 13 H 19 N 3 O 2 + 249.1479 Sistemas de Alta resolução

Massa Massa nominal Massa de um íon de uma determinada fórmula empírica calculada através do isótopo mais abundante. Ex : M=249 C 20 H 9+ or C 19 H 7 N + or C 13 H 19 N 3 O 2 + Massa exata Massa de um íon da uma determinada fórmula empírica calculada através da massa exata do isótopo mais abaundante da cada elemento. Ex : M=249 C 20 H + 9 249.070 C 19 H 7 N + 249.0580 C 13 H 19 N 3 O + 2 249.1479 Faixa de massas - Limite superior e inferior de m/z observáveis por um dado analisador de massas.

Resolução Medida da habilidade de um analisador de massas de separar íons adjacentes. C 20 H 9 + C 19 H 7 N+ C 13 H 19 N 3 O 2 + C 20 H 9 + C 19 H 7 N+ C 13 H 19 N 3 O 2 + 3 compostos diferentes Mesma massa nominal Baixa Resolução 3 compostos diferentes 3 massas exatas diferentes alta resolução 249 249.0700 249.0580 249.1479

Massa Exata [C 18 H 15 P] + m/z 262.0911 Massa exata (ppm)=10 6 (M cal. M obs )/M obs

Caminhos de Fragmentação

Possibilidades de EI

Regra do Nitrogênio Contém Números ímpares de nitrogênio: Íon molecular [M]+. terá massa ímpar!! Contém Números pares de átomos de Nitrogênio ou não contém átomos de nitrogênio: Íon molecular [M]+. terá massa par!!

Regras do elétron impar Regras do elétron par

Fragmentação direcionada pelo elétron Fragmentação direcionada pela carga

Rearranjos