SUSCETIBILIDADE ANTIMICROBIANA DE Staphylococcus spp. ISOLADOS DE CÃES COM PIODERMA SUPERFICIAL

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA SUSCETIBILIDADE ANTIMICROBIANA DE Staphylococcus spp. ISOLADOS DE CÃES COM PIODERMA SUPERFICIAL DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Ana Paula da Silva Santa Maria, RS, Brasil 2013

SUSCETIBILIDADE ANTIMICROBIANA DE Staphylococcus spp. ISOLADOS DE CÃES COM PIODERMA SUPERFICIAL Ana Paula da Silva Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós- Graduação em Medicina Veterinária, Área de Concentração em Clínica Médica, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária. Orientadora: Profª. Drª. Claudete Schmidt Santa Maria, RS, Brasil 2013

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertação de Mestrado SUSCETIBILIDADE ANTIMICROBIANA DE Staphylococcus spp. ISOLADOS DE CÃES COM PIODERMA SUPERFICIAL elaborada por Ana Paula da Silva como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária COMISSÃO EXAMINADORA: Claudete Schmidt, Drª. UFSM (Presidente/Orientadora) Alexandre Krause, Dr. UFSM Tatiana Mello de Souza, Drª. Santa Maria, março de 2013.

Dedico esta dissertação a todos os anjos-heróis que perderam suas vidas.

AGRADECIMENTOS À Universidade Federal de Santa Maria e ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária pela oportunidade de realização do mestrado e aos professores por todo o ensino, principalmente nesta etapa de minha formação. À minha orientadora, Prof a. Dr a. Claudete Schmidt, pelos ensinamentos, apoio e exemplo de competência profissional. Dete, sua didática é admirável, você realmente sabe compartilhar o conhecimento! Obrigada pela sua grande participação no meu crescimento pessoal e profissional! À equipe que colaborou na realização deste trabalho, mestranda Grazieli Maboni, graduandos Carine Rampelotto, Marcelo Luis Schwab e Talita Prates Escobar. Agradeço o valioso auxílio! À Profª. Dr a. Agueda Castagna de Vargas pela oportunidade concedida em desenvolver parte do estudo no LABAC e pela dedicação para com a pesquisa. À Prof a. Dr a. Anne Santos do Amaral pela realização das análises estatísticas. Aos colegas do HVU/UFSM que de alguma forma contribuíram com a execução deste trabalho. Um agradecimento especial aos pacientes e proprietários que possibilitaram a colheita de material e os registros de imagens. À minha família e amigos por todo carinho e estímulo, em especial a minha mãe Cleusa, pelo amor incondicional. Ao meu namorado, Rafael, pela grande ajuda e disponibilidade. Obrigada por compreender os momentos de ausência e por fazer parte da minha vida. A Deus por sempre iluminar o meu caminho... A todos, o meu muito obrigado!

Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota... (Madre Teresa de Calcutá)

RESUMO Dissertação de Mestrado Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária Universidade Federal de Santa Maria SUSCETIBILIDADE ANTIMICROBIANA DE Staphylococcus spp. ISOLADOS DE CÃES COM PIODERMA SUPERFICIAL AUTORA: ANA PAULA DA SILVA ORIENTADORA: CLAUDETE SCHMIDT Data e Local da Defesa: Santa Maria, 1 o de março de 2013. Pioderma superficial é a infecção bacteriana da epiderme e folículo piloso e é considerada uma das doenças de pele mais frequentes em cães. Os principais agentes etiológicos envolvidos são bactérias do gênero Staphylococcus. Essa dermatopatia representa uma das principais indicações de antimicrobianoterapia pelos clínicos de pequenos animais, procedimento habitualmente realizado de forma empírica. A emergência de espécies estafilococos multirresistentes em infecções cutâneas tem sido relatada em diversos países e implica em dificuldades no tratamento. Este estudo teve como objetivo determinar a suscetibilidade antimicrobiana e avaliar a presença de multirresistência em 154 isolados de Staphylococcus spp. oriundos de lesões cutâneas de cães com pioderma superficial atendidos no Serviço de Dermatologia Veterinária do Hospital Veterinário Universitário (HVU) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). Após cultura e identificação bacteriana, os isolados foram submetidos ao teste de sensibilidade aos antimicrobianos, cujos resultados evidenciaram elevados percentuais de resistência frente à amoxicilina (60,4%) e penicilina G (60,4%), moderada resistência às sulfonamidas potencializadas (29,9%), enrofloxacina (20,1%), ciprofloxacina (18,8%) e azitromicina (17,5%) e baixos percentuais de resistência à associação amoxicilina e ácido clavulânico (1,9%), cefalexina (1,9%), cefadroxil (1,9%) e vancomicina (0,6%). A multirresistência foi detectada em 23,4% e a resistência à meticilina em 5,8% das amostras. Pode-se concluir que os isolados de Staphylococcus spp. apresentam elevada suscetibilidade aos antimicrobianos comumente utilizados no tratamento dos piodermas superficiais em cães no HVU-UFSM, como a cefalexina e a amoxicilina associada ao ácido clavulânico, confirmando a eleição desses fármacos para o tratamento de cães com esta afecção. A suscetibilidade dos isolados frente às fluoroquinolonas, também recomendadas pela literatura como opção terapêutica nos piodermas, permite sugerir que esses fármacos não devem ser considerados na seleção empírica. A identificação de Staphylococcus spp. multirresistentes na população canina estudada justifica análises bacteriológicas periódicas e regionais de lesões cutâneas de cães com pioderma superficial, a fim de minimizar resistência bacteriana, possíveis falhas terapêuticas e também motiva a antimicrobianoterapia prudente. Palavras-chave: Doenças de cães. Dermatologia. Infecção cutânea. Antimicrobianos. Resistência bacteriana.

ABSTRACT Master s Dissertation Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária Universidade Federal de Santa Maria ANTIMICROBIAL SUSCEPTIBILITY OF Staphylococcus spp. ISOLATED FROM CANINE SUPERFICIAL PYODERMA AUTHOR: ANA PAULA DA SILVA ADVISER: CLAUDETE SCHMIDT Santa Maria, March, 2013. Superficial pyoderma is the bacterial infection of the epidermis and hair follicle and is a common skin disease in dogs. The main etiological agents involved are bacteria of the Staphylococcus genus. This skin disease represents one of the main indications for antimicrobial therapy by small animal practitioners, a procedure usually performed empirically. The emergence of multidrug-resistant staphylococci species in skin infections has been reported in many countries and implies difficulties in the treatment. This study aimed to determine the antimicrobial susceptibility and evaluate the presence of multidrug resistance in 154 isolates of Staphylococcus spp. from skin lesions of dogs with superficial pyoderma that were assisted by the Veterinary Dermatology Service at the Hospital Veterinário Universitário (HVU) of the Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). After bacterial culture and identification, the isolates were tested for antimicrobial susceptibility, and the results showed high rates of resistance to amoxicillin (60.4%) and penicillin G (60.4%), moderate resistance to potentiated sulfonamides (29.9%), enrofloxacin (20.1%), ciprofloxacin (18.8%) and azithromycin (17.5%), and low percentages of resistance to the amoxicillin and clavulanic acid association (1.9%), cephalexin (1.9 %), cefadroxil (1.9%) and vancomycin (0.6%). The multidrug resistance was detected in 23.4% (11/154) and the methicillin resistance in 5.8% (9/154) of the samples. It may be concluded that the Staphylococcus spp. isolates present high susceptibility to key antimicrobials used in the treatment of superficial pyodermas in dogs at the HVU-UFSM, such as cephalexin and the amoxicillin and clavulanic acid association, confirming the preference for these drugs when treating dogs with this disorder. The susceptibility of the isolates to fluoroquinolones, also recommended in the literature as an alternative in the treatment of pyodermas, allows suggesting that such drugs should not be considered in the empirical selection. The identification of multidrug-resistant Staphylococcus spp. in the studied canine population justifies periodic and regional bacteriological tests of skin lesions in dogs with superficial pyoderma, to minimize bacterial resistance, possible therapeutic failures and also motivates wise use of antimicrobial therapy. Key-words: Diseases of dogs. Dermatology. Skin infection. Antimicrobials. Bacterial resistance.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES CAPÍTULO I Figura 1 - Padrões de lesões cutâneas em cães com pioderma superficial: a- pústulas; b- colaretes epidérmicos; c- áreas circulares de alopecia; d- áreas circulares de alopecia e eritema; e- alopecia e hiperpigmentação; f- máculas alopécicas coalescentes.... 16 CAPÍTULO II Figura 1 - Suscetibilidade aos antimicrobianos de 154 Staphylococcus spp. isolados de cães com pioderma superficial. R = resistência (%); S = sensibilidade (%); AMO = amoxicilina; OXA = oxacilina; PEN = penicilina; AMC = amoxicilina/clavulanato de potássio; CFD = cefadroxil; CFE = cefalexina; AZI = azitromicina; ENO = enrofloxacina; CIP = ciprofloxacina; DOX = doxiciclina; POL = polimixina B; SUT = sulfametoxazol/trimetoprim; VAN = vancomicina; a,b,c,d = percentagens com letras diferentes diferem entre si pelo teste do qui-quadrado (P<0,05)...36

LISTA DE ANEXOS Anexo A - Ficha dermatológica... 45 Anexo B - Suscetibilidade antimicrobiana de Staphylococcus spp. isolados em cães com pioderma superficial e percentual de resistência dos antimicrobianos... 48

SUMÁRIO CAPÍTULO I... 11 1 INTRODUÇÃO... 11 2 REVISÃO DE LITERATURA... 13 2.1 Pioderma superficial... 13 2.2 Etiopatogenia... 14 2.3 Aspectos clínicos... 15 2.4 Diagnóstico... 16 2.5 Terapia... 18 2.6 Resistência aos antimicrobianos... 19 CAPÍTULO II... 22 3 ARTIGO... 22 Suscetibilidade antimicrobiana de Staphylococcus spp. isolados de cães com pioderma superficial... 23 ABSTRACT... 23 RESUMO... 23 INTRODUÇÃO... 24 MATERIAL E MÉTODOS... 25 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 27 CONCLUSÃO... 32 REFERÊNCIAS... 32 CONCLUSÃO... 38 REFERÊNCIAS... 39 ANEXOS... 44

CAPÍTULO I 1 INTRODUÇÃO Estima-se que 20% a 75% de todos os cães e gatos examinados na clínica de pequenos animais possuam alguma afecção cutânea (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001), o que torna a casuística dermatológica a maior entre todos os sistemas (HILL et al., 2006). Dentre as enfermidades cutâneas que afetam cães, o pioderma (também denominado piodermite ou piodermatite) é uma das mais frequentes (HILL et al., 2006; SOUZA et al., 2009; HNILICA, 2011) e os principais agentes etiológicos são bactérias do gênero Staphylococcus (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001; COX, 2006; IHRKE, 2006; MAY, 2006), sendo o Staphylococcus pseudintermedius (S. pseudintermedius) a espécie mais comumente isolada (GROSS et al., 2005; HNILIKA, 2011). De acordo com a profundidade da infecção na pele, as piodermites são classificadas clinicamente em três formas: muito superficiais, superficiais e profundas. Nesse esquema de distribuição existem variações tanto nas subdivisões como na nomenclatura dos diversos subgrupos de piodermites, conforme a literatura consultada (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001; GROSS et al., 2005; IHRKE, 2006). Contudo, é de consenso geral entre os autores supracitados que a forma superficial de piodermite é a mais frequente na espécie canina. A infecção é ainda classificada como primária ou secundária, conforme a ausência ou a presença de uma doença de base. A grande maioria das piodermites é secundária e os animais acometidos podem manifestar quadros recorrentes dessa infecção superficial como uma importante complicação da doença subjacente (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001). O pioderma representa uma das principais indicações de antimicrobianoterapia em cães, o que, geralmente, é realizado de forma empírica, sendo as cefalosporinas os fármacos de primeira escolha para o tratamento (IHRKE, 2005; COX, 2006; MAY, 2006, GUARDABASSI et al., 2008; HNILICA, 2011). A duração mínima da terapia na forma superficial da doença é de três semanas, podendo se estender por longos períodos até a completa resolução do quadro clínico. Adicionalmente, essa afecção pode ocorrer de forma crônica e recidivante, fazendo-se necessário o uso frequente ou prolongado de antimicrobianos (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001; IHRKE, 2006). Tais fatores

predispõem ao desenvolvimento de resistência bacteriana, ao surgimento de multirresistência e consequentes falhas terapêuticas, o que torna difícil o manejo da doença (GUARDABASSI et al., 2008). Diversos autores evidenciaram, nos últimos anos, significativo aumento da prevalência de Staphylococcus spp. multirresistentes e resistentes à meticilina (MRS) em medicina veterinária (JONES et al., 2007; DUIJKEREN et al., 2011a; NIENHOFF et al., 2011; BOND; LOEFFLER, 2012). A emergência desses patógenos, isolados principalmente em lesões cutâneas, otites e infecções pós-cirúrgicas, implica em um grave problema devido à dificuldade no tratamento e ao considerável potencial zoonótico (DUQUETTE; NUTTALL, 2004; GUARDABASSI et al., 2008). Estudos de suscetibilidade antimicrobiana de Staphylococcus spp. apontaram amplas variações nos resultados dependendo da área geográfica analisada, inclusive entre hospitais veterinários de uma mesma região (GUARDABASSI et al., 2008). Embora existam pesquisas relacionadas à sensibilidade antimicrobiana desses patógenos em cães com piodermas no Brasil (CAVALCANTI; COUTINHO, 2005; PIANTA et al., 2006) dados atuais referentes à prevalência de multirresistência são escassos (PENNA et al., 2009; LIMA et al., 2012). Considerando a ampla utilização de antimicrobianos na terapia da piodermite superficial canina, a emergência de cepas resistentes e as possíveis variações quanto à suscetibilidade antimicrobiana dos Staphyloccocus spp., o objetivo deste estudo foi determinar a suscetibilidade antimicrobiana e avaliar a presença de multirresistência em isolados de Staphylococcus spp. oriundos de lesões cutâneas de cães com pioderma superficial. 12

2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Pioderma superficial Conceitualmente, o pioderma (ou piodermite) superficial corresponde à infecção bacteriana da pele que envolve o folículo piloso e a epiderme adjacente (HNILICA, 2011). Dentre os piodermas superficiais encontram-se o impetigo, a piodermite mucocutânea, a foliculite bacteriana superficial e a dermatofilose (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001). Apesar de descritas outras formas clínicas, a foliculite bacteriana assume grande importância na rotina dermatológica veterinária, uma vez que representa a maioria dos diagnósticos e está frequentemente associada a recidivas. Por isso, é também referida como pioderma superficial (GROSS et al., 2005; HNILICA, 2011). A doença acomete animais de qualquer faixa etária, sexo e raça. Todavia, existe maior predisposição em determinadas raças de pelo curto como dobermann, pinscher, boxer, dinamarquês e dachshund (PATEL; FORSYTHE, 2010). A maioria das piodermites superficiais é secundária e resulta de alterações transitórias no ambiente cutâneo, como temperatura e umidade, ou de doenças de base, contudo, alguns casos são considerados idiopáticos. As principais afecções que predispõem ao desenvolvimento de pioderma são: dermatopatias alérgicas (atopia, dermatite alérgica à picada de ectoparasitas e hipersensibilidade alimentar), parasitárias (demodicose e escabiose), endocrinopatias (hipotireoidismo e hiperadrenocorticismo) e distúrbios da queratinização (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001; GROSS et al., 2005; PATEL; FORSYTHE, 2010). Dentre as doenças subjacentes, as dermatopatias alérgicas são consideradas as mais prevalentes (IHRKE, 2006), sobretudo a dermatite atópica (HNILICA, 2011). Em um elevado número de cães atópicos as lesões cutâneas surgem em média aos dois anos de idade, podendo haver manifestações ainda quando filhotes (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001). Apesar das diversas condições implicadas no desencadeamento do pioderma superficial, um restrito número de bactérias possui relevância na patogenia da doença (HNILICA, 2011).

14 2.2 Etiopatogenia Atualmente, sabe-se que o principal agente etiológico envolvido no pioderma canino é o S. pseudintermedius, descrito por Devriese et al. em 2005. Até então, tal patógeno era referido como S. intermedius (DeBOER, 1990; MASON, 1991; HILL; MORIELLO, 1994; PELLERIN et al., 1998), relatado pela primeira vez em 1976 por Hájek. Antes disso, esse estafilococo foi erroneamente identificado como S. aureus, o qual era apontado como principal causador de lesões cutâneas em cães, fato contestado por Ihrke (2005), que afirmou ser raro o isolamento de S. aureus a partir de piodermas nessa espécie. Com o avanço da biologia molecular, foram detectadas diversidades genéticas nos S. intermedius que resultaram na reclassificação de cepas previamente identificadas como S. intermedius em três diferentes espécies: S. intermedius, S. pseudintermedius e S. delphini, denominados de forma coletiva como Staphylococcus intermedius species group (SIG) (BANNOEHR et al., 2009; DEVRIESE et al., 2009; FITZGERALD, 2009). A despeito das constantes descobertas taxonômicas permanece o consenso de que o S. pseudintermedius seja o principal agente etiológico das piodermites superficiais em cães (FITZGERALD, 2009; DUIJKEREN et al., 2011a; BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012; BOND; LOEFFLER, 2012). A grande maioria dos casos de pioderma canino é atribuído à infecção por S. pseudintermedius. Outras espécies de estafilococos, como S. intermedius e S. schleiferi também podem estar envolvidas, porém, menos frequentemente (HNILICA; MAY, 2004). O S. pseudintermedius é considerado um patógeno comensal e oportunista na espécie canina (BANNOEHR; GUARDABASSI, 2012). A espécie constitui parte da microbiota cutânea e superfícies mucosas de cães hígidos (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001; COX, 2006). De acordo com Saijonmaa-Koulumies e Lloyd (2002), a frequência de isolamento dessas bactérias é de 45% a 100% na pele e pelos de cães desprovidos de qualquer lesão cutânea. Os mesmos autores sugeriram que a flora estafilocócica residente dos cães parece ser adquirida da mãe no período neonatal, já nos primeiros sete dias de vida, contudo, mecanismos de defesa da pele (físicos, químicos e imunológicos) limitam a multiplicação dessas bactérias e impedem o surgimento de infecções cutâneas (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001).

15 As dermatopatias bacterianas são vistas com maior frequência em cães quando comparadas aos demais mamíferos domésticos. A suscetibilidade à piodermite é atribuída principalmente às características anatomofisiológicas da pele canina. Evidências morfológicas indicam que o estrato córneo é delgado e compacto, a quantidade de emulsão de gordura intercelular é pequena, o infundíbulo do folículo piloso é aberto, ou seja, não apresenta um epitélio lipídico escamoso (tampão sebáceo) e o ph da pele é relativamente alto. Tais particularidades tornam a barreira epidérmica pouco eficiente contra a invasão bacteriana entre os folículos pilosos (IHRKE, 2006). Segundo Scott, Miller e Griffin (2001), algumas cepas de Staphylococcus spp. produzem fatores de virulência que contribuem na patogênese do pioderma, tais como: hemolisinas, enterotoxinas, toxinas epidermolíticas e proteína A. Essa última age como molécula de adesão, ligando-se a um receptor específico na parede celular da epiderme fixando-se, assim, no hospedeiro. Esse mecanismo de aderência é considerado um prérequisito para colonização e infecção bacteriana. Outros autores demonstraram que os estafilococos são capazes de produzir superantígenos (toxinas com propriedades antigênicas) que induzem reações de hipersensibilidade e determinam o agravamento de certos quadros de piodermite (HENDRICKS et al., 2002). 2.3 Aspectos clínicos A principal característica clínica do pioderma superficial é a formação de pápulas e pústulas foliculares (Figura 1a). Entretanto, tais lesões primárias são habitualmente transitórias, pois se rompem espontaneamente resultando em lesões secundárias, representadas pelas crostas e colaretes epidérmicos (Figura 1b), as quais são comumente evidenciadas ao exame físico dos pacientes (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001; GROSS, et al., 2005; IHRKE, 2006). A evolução do quadro clínico tende a gerar áreas anulares de alopecia, acompanhadas ou não de eritema (Figura 1c e 1d), que progride para hiperpigmentação (Figura 1e). Cães de pelagem curta usualmente apresentam alopecia irregular ou pequenos tufos de pelos eriçados, às vezes confundidos com urticária (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001). Quando há acometimento da pele do tronco, máculas

16 alopécicas mal delimitadas coalescem (Figura 1f) e a pelagem costuma adquirir aspecto de roído de traça (IHRKE, 2006). Quanto à topografia lesional, não há um padrão específico de distribuição das lesões, que podem variar de focais até generalizadas. Considerando que a maioria das piodermites superficiais é secundária, a localização da infecção depende da causa predisponente, da raça, da resposta individual do paciente e de fatores intrínsecos do agente etiológico (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001). De acordo com Ihrke (2006) as regiões axilar, inguinal e abdominal são acometidas com maior frequência. c c f Figura 1 - Padrões de lesões cutâneas em cães com pioderma superficial: a- pústulas; b- colaretes epidérmicos; c- áreas circulares de alopecia; d- áreas circulares de alopecia e eritema; e- alopecia e hiperpigmentação; f- máculas alopécicas coalescentes. Fonte: SCHMIDT, C., UFSM, RS. 2.4 Diagnóstico O diagnóstico do pioderma é firmado através de detalhada anamnese dermatológica (Anexo A), presença de lesões características ao exame físico e resultado de exames complementares. Para Scott, Miller e Griffin (2001), a citologia cutânea é o exame de primeira escolha. Amostras citológicas são fáceis de ser obtidas, pois as

17 formas de colheita são minimamente invasivas. O material pode ser coletado de forma esfoliativa, por impressão direta da pele ou com auxílio de swab, preferencialmente de pústulas intactas (IHRKE, 2006). Ao exame citológico, a visualização de neutrófilos íntegros ou degenerados e bactérias fagocitadas ou extracelulares é compatível com infecção. A identificação bacteriana não é possível, mas podem-se diferenciar cocos de bastonetes e, a partir daí, instituir terapia apropriada. É aceito de forma geral, que a presença de cocos na citologia permite definir que o organismo envolvido seja o S. pseudintermedius (IHRKE, 2006; HINILIKA, 2011), porém, a ausência de bactérias não exclui o diagnóstico de pioderma e a cultura bacteriana deve ser realizada (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001). Existem divergências entre autores quanto à realização de cultura bacteriana e teste de suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA) de lesões cutâneas em cães. Conforme Scott; Miller; Griffin (2001) há dificuldade em separar a colonização bacteriana da infecção secundária, o que prejudica a interpretação da cultura de amostras de pele. Em virtude disso, os autores propuseram cultura bacteriana e subsequente TSA quando: microrganismos não usuais forem identificados na citologia cutânea, houver histórico prévio de resposta terapêutica fraca ou ausente ou em casos recorrentes. Por outro lado, Patel e Forsythe (2010) afirmaram que as análises bacteriológicas não eram realizadas de forma rotineira em casos de pioderma canino, pelo fato de o perfil de sensibilidade do S. pseudintermedius ser considerado previsível e estável. No entanto, os mesmos autores salientaram que a emergência de cepas bacterianas multirresistentes, resistentes aos principais antimicrobianos utilizados na rotina dermatológica, implica na necessidade de realização de cultura bacteriana para fins diagnósticos e, sobretudo, terapêuticos. Os principais diagnósticos diferenciais para o pioderma superficial são: demodicose, dermatofitose, urticária e pênfigo foliáceo (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001; PATEL; FORSYTHE, 2010). Outras condições que podem mimetizar a doença incluem: dermatite por Malassezia, erupção por droga, eritema multiforme, dermatite necrolítica superficial, piogranuloma estéril e dermatite pustulosa subcorneal (IHRKE, 2005). O prognóstico da piodermite superficial geralmente é bom. Contudo, uma vez estabelecido o diagnóstico, a pesquisa e subsequente tratamento de doenças ou causas predisponentes tornam-se imprescindíveis para a obtenção de resposta clínica

18 satisfatória. Caso não seja instituído um protocolo terapêutico adequado, existe possibilidade de recidiva da infecção (PATEL; FORSYTHE, 2010). 2.5 Terapia O tratamento do pioderma superficial em cães requer o uso de antimicrobianos sistêmicos associado à terapia tópica (IHRKE, 2006; PATEL; FORSYTHE, 2010). No geral, a eleição do antimicrobiano é realizada empiricamente, fundamentada em estudos prévios acerca da sensibilidade de estaficolocos oriundos de cães com piodermite (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001). Hnilica e May (2004) ratificaram que os padrões de sensibilidade evidenciados pelos estafilococos eram constantes, o que permitia a seleção empírica do antimicrobiano. Tal conduta é empregada de forma ampla na rotina clínica dermatológica e preconizada pela literatura nas últimas décadas (MASON, 1991; SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001; HNILICA, 2011). Os principais antimicrobianos indicados no tratamento do pioderma englobam as cefalosporinas de primeira geração (cefalexina e cefadroxil), a associação amoxicilinaácido clavulânico e as fluorquinolonas (enrofloxaxina, ciprofloxacina e difloxacina) (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001; IHRKE, 2006; GUARDABASSI et al., 2008). Esses fármacos possuem ação bactericida, restrito espectro de ação e adequada distribuição na pele (HNILICA; MAY, 2004). Para muitos dermatologistas, a cefalexina é considerada a primeira escolha no tratamento de piodermas superficiais por ser eficiente e segura (LARSSON, 2012). Como exemplos de outros antimicrobianos recomendados nas infecções cutâneas, tem-se: clindamicina, sulfonamidas potencializadas e eritromicina, porém, a resistência a esses fármacos é frequentemente relatada (HNILICA; MAY, 2004; IHRKE, 2006). Quanto à suscetibilidade antimicrobiana, é referido pela literatura que o S. pseudintermedius é muito suscetível (> 95%) às cefalosporinas de primeira geração, às fluoroquinolonas e à associação amoxicilina-ácido clavulânico. É descrita boa eficácia (>75%) para a lincomicina, clindamicina, tilosina e eritromicina Em contrapartida, antimicrobianos betalactâmicos da família das penicilinas, como penicilina, amoxicilina e ampicilina não proporcionam bom efeito terapêutico, pois são inativados pelas betalactamases produzidas pela maioria dos isolados de S. pseudintermedius (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001).

19 A terapia tópica deve ser simultaneamente associada aos antimicrobianos sistêmicos, pois promove resposta clínica mais rápida e eficaz. A utilização de xampus antissépticos é benéfica, visto que favorece a remoção de crostas e reduz a carga bacteriana na superfície cutânea (PATEL; FORSYTHE, 2010), além de auxiliar na prevenção de recidivas (IHRKE, 2006). Xampus contendo clorexidine, peróxido de benzoíla, etil-lactato, triclosan e iodo povidine são indicados para banhos, na frequência de três vezes por semana, por um período médio de seis semanas (HNILICA; MAY, 2004) De acordo com Ihrke (2006), falhas terapêuticas ocorrem, principalmente, devido a erros no estabelecimento da dose ideal e a falta de manutenção da terapia por tempo suficiente. A duração do tratamento para as piodermites superficiais é de no mínimo 21 dias e o protocolo deve ser mantido por uma semana após atingir-se a cura clínica Alguns casos idiopáticos ou de infecções de caráter crônico recidivante demandam tratamentos prolongados e/ou durante toda a vida (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001). Nesses pacientes, que exibem altos índices de recorrência, a manutenção terapêutica pode ser obtida através de terapia antimicrobiana de pulso (pulsoterapia) (HORVATH; NEUBER, 2007). No entanto, a utilização de antimicrobianos em sistema de pulso predispõe ao surgimento de resistência bacteriana (IHRKE, 2006). Afora a pulsoterapia, o uso de antimicrobianos durante períodos extensos ou inferiores ao recomendado, assim como o emprego de subdosagens, podem, igualmente, determinar a seleção de cepas resistentes (HNILICA; MAY, 2004). 2.6 Resistência aos antimicrobianos A resistência bacteriana pode resultar da pressão seletiva induzida pelo emprego frequente ou empírico de antimicrobianos. Esses fármacos atuam como selecionadores de patógenos resistentes, ou seja, agem sobre bactérias sensíveis, observando-se, consequentemente, proliferação das resistentes. A resistência envolve ainda, diversos mecanismos bioquímicos codificados por genes bacterianos que impedem a ação dos fármacos (SPINOSA et al., 2002). Os estafilococos tendem a desenvolver resistência aos antimicrobianos, especialmente se a dose ou a duração da terapia for inadequada (HNILICA; MAY, 2004).

20 Em medicina humana, as infecções estafilocócicas representam um desafio terapêutico, especialmente casos relacionados aos Staphylococcus aureus resistentes à meticilina (MRSA). A crescente prevalência de MRSA é um fenômeno mundial, tanto em infecções nosocomiais como em comunitárias (DUQUETTE; NUTTALL, 2004) e preocupante devido à elevada mortalidade e morbidade (GUARDABASSI et al., 2008). A meticilina é uma penicilina resistente à ação inativadora das betalactamases produzidas pelos estafilococos. O mecanismo de resistência ocorre através da produção de uma proteína que se liga à penicilina (penicillin-binding protein- PBP2a ou PBP2 ) codificada pelo gene MecA. As bactérias resistentes à meticilina não apresentam resposta terapêutica à oxacilina e às cefalosporinas, devido à resistência cruzada com os antibióticos beta-lactâmicos (ONUMA; TANABE; SATO, 2011), que são antimicrobianos comumente indicados para infecções bacterianas de pele em cães (SCOTT; MILLER; GRIFFIN, 2001). Estudos demonstraram que Staphylococcus multirresistentes, especialmente Staphylococcus pseudintermedius resistentes à meticilina (MRSP), estão cada vez mais presentes em diversas infecções caninas (JONES et al., 2007; LUCIA et al., 2011; NIENHOFF et al., 2011), incluindo as piodermites (LOEFFLER et al., 2007). Como citado anteriormente, as cefalosporinas são os antimicrobianos mais eficazes e utilizados com maior frequência no tratamento empírico desta afecção, entretanto, frente a infecções cutâneas por MRSP, cefalosporinas e penicilinas, como amoxicilina, por exemplo, deixam de constituir opções terapêuticas, o que restringe a seleção dos fármacos. Outro aspecto a ser ressaltado é o potencial zoonótico desses estafilococos, evidenciado pela transmissão de MRSA e MRSP entre os animais e o homem (GUARDABASSI; LOEBER; JACOBSON, 2004; DUIJKEREN et al., 2011b). Sugerese, ainda, a transferência de genes de virulência e de resistência de cepas humanas de S. aureus para patógenos caninos (DUQUETTE; NUTTALL, 2004). O tratamento de infecções por Staphylococcus spp. multirresistentes representa um sério desafio em dermatologia veterinária. Pesquisadores europeus averiguaram que cepas clínicas foram comumente resistentes a todas as formulações orais de antimicrobianos disponíveis para o tratamento de pioderma e otites (LOEFFLER et al., 2007). A terapia antimicrobiana contra esses isolados em animais é mais crítica do que nos seres humanos, uma vez que alguns compostos empregados na medicina humana (por exemplo, vancomicina, linezolida, estreptograminas e tigeciclina) são caros e todos,

21 exceto linezolida, devem ser administrados por via intravenosa. Esses fármacos têm extrema importância em medicina humana e não se recomenda o uso em animais, a menos que a infecção traga risco de vida ou for constatada resistência a outros antimicrobianos (GUARDABASSI et al., 2008). Nesse contexto, insere-se a relevância clínica da avaliação periódica da suscetibilidade de Staphylococcus spp. provenientes de cães com piodermite. O conhecimento prévio do perfil desses patógenos em âmbito local auxilia na escolha prudente do antimicrobiano, o que pode evitar o surgimento de resistência bacteriana e, consequentemente, reduzir falhas terapêuticas na rotina dermatológica.

CAPÍTULO II 3 ARTIGO Os resultados desta dissertação são apresentados na forma de artigo científico, com formatação de acordo com as normas da revista a que será submetido: Suscetibilidade antimicrobiana de Staphylococcus spp. isolados de cães com pioderma superficial De acordo com normas para publicação em: Pesquisa Veterinária Brasileira

Suscetibilidade antimicrobiana de Staphylococcus spp. isolados de cães com pioderma superficial 1 Ana Paula da Silva 2*, Claudete Schmidt 3 ABSTRACT.- Silva A.P., Schmidt C. 2013. [Antimicrobial susceptibility of Staphylococcus spp isolated from canine superficial pyoderma.] Suscetibilidade antimicrobiana de Staphylococcus spp. isolados de cães com pioderma superficial. Pesquisa Veterinária Brasileira 00(0):00-00. Departamento de Clínica de Pequenos Animais, Centro de Ciências Rurais, Universidade Federal de Santa Maria, Hospital Veterinário, Avenida Roraima, n o 1000, Prédio 97, Camobi, Santa Maria, RS, 97105-100, Brasil. E-mail: apsvet@hotmail.com A total of 154 samples of skin lesions were obtained from dogs with superficial pyoderma that were assisted by the Veterinary Dermatology Service at the University Veterinary Hospital (HVU), Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), aiming to determine the antimicrobial susceptibility of Staphylococcus spp. isolates and evaluate the presence of multidrug resistance. After bacterial culture and identification, the isolates were tested for antimicrobial susceptibility, and the results showed lower percentages of resistance to the amoxicillin and clavulanic acid association (1.9%), cefadroxil (1.9%), cephalexin (1.9%) and vancomycin (0.6 %). The highest percentages were towards amoxicillin (60.4%) and penicillin G (60.4%). The multidrug resistance was detected in 23.4% and the methicillin resistance in 5.8% of the samples. It may be concluded that the Staphylococcus spp. isolates present high susceptibility to key antimicrobials used in the treatment of superficial pyodermas in dogs at the HVU- UFSM, such as cephalexin and the amoxicillin and clavulanic acid association, confirming the preference for these drugs when treating dogs with this disorder. The susceptibility of the isolates to fluoroquinolones, also recommended in the literature for the treatment of pyodermas, allows suggesting that such drugs should not be considered in the empirical selection. The identification of multidrug-resistant Staphylococcus spp. in the studied canine population justifies periodic and regional bacteriological tests of skin lesions in dogs with superficial pyoderma, to minimize bacterial resistance, possible therapeutic failures and also motivates wise use of antimicrobial therapy. INDEX TERMS: Diseases of dogs, dermatology, skin infection, antimicrobials, bacterial resistance. RESUMO.- Foram obtidas 154 amostras de lesões cutâneas de cães com pioderma superficial atendidos no Serviço de Dermatologia Veterinária do Hospital Veterinário Universitário (HVU) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), com o objetivo de determinar a suscetibilidade antimicrobiana de isolados de Staphylococcus spp. e avaliar a presença de multirresistência. Após cultura e identificação, os isolados foram 1 Recebido em... Aceito para publicação em... 2 Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária (PPGMV), Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Camobi, Santa Maria, RS, 97105-100, Brasil. * Autor para correspondência: apsvet@hotmail.com 3 Departamento de Clínica de Pequenos Animais (DCPA), Hospital Veterinário Universitário (HVU), UFSM, Santa Maria, RS, 97105-100, Brasil.

24 submetidos ao teste de sensibilidade aos antimicrobianos, cujos resultados evidenciaram menores percentuais de resistência à associação amoxicilina e ácido clavulânico (1,9%), cefadroxil (1,9%), cefalexina (1,9%) e vancomicina (0,6%). Os maiores percentuais foram frente à amoxicilina (60,4%) e penicilina G (60,4%). A multirresistência foi detectada em 23,4% e a resistência à meticilina em 5,8% das amostras. Pode-se concluir que os isolados de Staphylococcus spp. apresentam elevada suscetibilidade aos antimicrobianos comumente utilizados no tratamento dos piodermas superficiais em cães atendidos no HVU-UFSM, como a cefalexina e a amoxicilina associada ao ácido clavulânico, confirmando a eleição desses fármacos para o tratamento de cães com esta afecção. A suscetibilidade dos isolados frente às fluoroquinolonas, também recomendadas pela literatura para o tratamento, permite sugerir que estes fármacos não devem mais ser considerados na seleção empírica. A identificação de Staphylococcus spp. multirresistentes na população canina estudada justifica análises bacteriológicas periódicas e regionais de lesões cutâneas de cães com pioderma superficial, a fim de minimizar resistência bacteriana, possíveis falhas terapêuticas e também motiva a antimicrobianoterapia prudente. TERMOS DE INDEXAÇÃO: Doenças de cães, dermatologia, infecção cutânea, antimicrobianos, resistência bacteriana. INTRODUÇÃO Pioderma (ou piodermite) superficial é definido como a infecção bacteriana do tegumento que envolve o folículo piloso e a epiderme adjacente (Scott et al. 2001) e representa uma das dermatopatias mais frequentes em cães (Hill et al. 2006, Souza et al. 2009, Hnilica 2011). Os principais agentes etiológicos são bactérias do gênero Staphylococcus (Cox 2006, Ihrke 2006), sendo Staphylococcus pseudintermedius (S. pseudintermedius) anteriormente referido como S. intermedius (Mason 1991, Hill & Moriello 1994, Scott et al. 2001), a espécie mais comumente isolada (Gross et al. 2005, Devriese et al. 2009, Hnilica, 2011). Na maioria dos casos, a piodermite superficial é considerada uma manifestação secundária de outras alterações cutâneas ou sistêmicas e os animais acometidos podem apresentar quadros recorrentes dessa infecção como uma importante complicação da doença subjacente (Scott et al. 2001). Pioderma constitui uma das principais indicações de antimicrobianoterapia em cães, o que, geralmente, é realizado de forma empírica, sendo as cefalosporinas os fármacos de primeira escolha para o tratamento (Ihrke 2005, May 2006, Guardabassi et al. 2008, Hnilica 2011). Adicionalmente, o pioderma superficial pode ocorrer de forma crônica e recidivante, fazendo-se necessário o uso frequente ou prolongado de antimicrobianos (Scott et al. 2001, Ihrke 2006). Tais fatores predispõem ao desenvolvimento de resistência bacteriana, ao surgimento de multirresistência e

25 consequentes falhas terapêuticas, o que torna difícil o manejo dessa afecção (Guardabassi et al. 2008). Diversos autores evidenciaram, nos últimos anos, significativo aumento da prevalência de Staphylococcus spp. multirresistentes e resistentes à meticilina (MRS) em medicina veterinária (Jones et al. 2007, Duijkeren et al. 2011, Nienhoff et al. 2011, Bond & Loeffler 2012). A emergência desses patógenos, isolados principalmente de lesões cutâneas, otites e infecções pós-cirúrgicas, implica em um grave problema devido à dificuldade no tratamento e ao considerável potencial zoonótico (Duquette & Nuttall 2004, Guardabassi et al. 2008). Estudos de suscetibilidade antimicrobiana de Staphylococcus spp. apontaram amplas variações nos resultados dependendo da área geográfica analisada (Guardabassi et al. 2008). Embora existam pesquisas relacionadas ao perfil antimicrobiano desses patógenos em cães com piodermas no Brasil (Cavalcanti & Coutinho 2005, Pianta et al. 2006), dados atuais referentes à prevalência de multirresistência são escassos (Penna et al. 2009, Lima et al. 2012). Considerando a ampla utilização de antimicrobianos na terapia da piodermite superficial canina, a emergência de cepas resistentes e as possíveis variações quanto à suscetibilidade antimicrobiana dos Staphyloccocus spp., o objetivo deste estudo foi determinar a suscetibilidade antimicrobiana e avaliar a presença de multirresistência em isolados de Staphylococcus spp. oriundos de lesões cutâneas de cães com pioderma superficial. MATERIAL E MÉTODOS Foram avaliados 154 isolados bacterianos provenientes de lesões cutâneas em cães com pioderma superficial, atendidos pelo Serviço de Dermatologia do Hospital Veterinário Universitário (HVU) da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), durante o ano de 2012. Cães apresentando colaretes epidérmicos, com diagnóstico firmado pelo mesmo clínico e que não haviam sido submetidos à antimicrobianoterapia prévia (no mínimo 30 dias antes da avaliação clínica) foram incluídos no estudo, independente da idade, sexo ou raça. As amostras foram acondicionadas em frascos estéreis contendo meio de transporte de Stuart e imediatamente encaminhadas para análise no Laboratório de Bacteriologia (LABAC) da mesma instituição. O cultivo bacteriano foi realizado pela técnica de semeadura por esgotamento, em ágar sangue ovino a 5%, seguido de incubação a 37 C por 24 horas. Na sequência, foi

26 realizada a identificação das colônias segundo as características morfo-tintoriais e bioquímicas (Carter 1988). A análise bacteriológica baseou-se na morfologia, pigmentação das colônias, tipo de hemólise, coloração de Gram, reação da catalase, coagulase (em lâmina e em tubo), comportamento frente à polimixina B, além de testes bioquímicos de ONPG (orto-nitrofenil-galactopiranosídeo) e fermentação da maltose. Como não foram utilizados métodos moleculares para diferenciação das espécies de Staphylococcus e as análises bioquímicas tradicionais podem apresentar falhas, aqueles foram referidos como Staphylococcus spp. Após a identificação dos isolados, esses foram submetidos ao teste de suscetibilidade aos antimicrobianos (TSA) através do método de disco-difusão em ágar, descrito por Bauer et al. (1966). Para tanto, foi realizado um inóculo de suspensão direta de colônias bacterianas oriundas de ágar sangue ovino 5%, obtendo-se turbidez de 0,5 na escala de McFarland. O inóculo foi semeado em ágar Mueller-Hinton e discos de antimicrobianos foram depositados em sua superfície, com as placas incubadas a 35 C, por 24 horas. Foram testados os seguintes antimicrobianos pertencentes às classes: 1) betalactâmicos: a) família das penicilinas - amoxacilina (10 µg), oxacilina (1 µg), penicilina G (10U), amoxicilina com ácido clavulânico (30 µg), b) família das cefalosporinas - cefadroxil (30 µg), cefalexina (30 µg); 2) macrolídeos - azitromicina (15 µg); 3) fluoroquinolonas - enrofloxacina (5 µg), ciprofloxacina (5 µg); 4) tetraciclinas - doxiciclina (30 µg); 5) polimixinas - polimixina B (300UI); 6) sulfamidas - sulfametoxazol com trimetoprim (25 µg); 7) glicopeptídeos - vancomicina (30 µg). A escolha dos antimicrobianos baseou-se em indicações terapêuticas de May (2006) e Hnilica (2011), com exceção da polimixina B, usada na diferenciação fenotípica de espécies e da oxacilina, testada para avaliar a suscetibilidade à meticilina. Cepas de referência de Staphylococcus aureus ATCC 25923 foram utilizadas no controle de qualidade do método de disco-difusão e os resultados dos testes interpretados segundo as normas do Clinical Laboratory Standards Institute" (CLSI 2003). Os isolados foram classificados em sensíveis, intermediários ou resistentes aos antimicrobianos (considerando os intermediários como resistentes), mediante a leitura da medida dos halos de inibição de crescimento bacteriano e, ao final dos procedimentos, liofilizados e estocados a -20 C. A multirresistência foi definida como resistência a três ou mais classes de antimicrobianos, conforme Youn et al. (2011). A resistência à meticilina foi avaliada pelo método de suscetibilidade em disco-difusão utilizando-se oxacilina. Para comparar

27 a resistência entre os antimicrobianos testados foi realizada análise estatística dos dados através do teste Qui-quadrado com nível de significância P<0,05, utilizando-se o programa SAS. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os percentuais de sensibilidade e resistência dos 154 isolados de Staphylococcus spp. aos 13 antimicrobianos, testados neste estudo, podem ser visualizados na Figura 1. Pode-se verificar que, na classe dos betalactâmicos, mais de 50% dos isolados demonstraram resistência à família das penicilinas, com 60,4% (93/154) resistentes à amoxicilina e também à penicilina G, enquanto que, menos de 2% dos isolados foram resistentes à cefalexina e cefadroxil, representantes da família das cefalosporinas, ambos com percentual de resistência de 1,9% (3/154). O mesmo percentual de resistência, 1,9% (3/154), foi observado frente à associação amoxicilina e ácido clavulânico. A alta resistência às penicilinas detectada neste estudo já havia sido citada em diversas pesquisas (Ganiere et al. 2005, Pedersen et al. 2007, Penna et al. 2009, Onuma et al. 2011, Proietti et al. 2012). Este resultado era esperado devido à produção de β- lactamases por grande parte dos Staphylococcus spp., as quais hidrolisam o núcleo ativo desses fármacos. Tal mecanismo de resistência às penicilinas explica a diferença entre os valores detectados frente à amoxicilina isoladamente (60,4%) e, quando associada ao ácido clavulânico (1,9%), uma vez que este ácido é um inibidor das β-lactamases produzidas pelos estafilococos (Spinosa et al. 2002). Apesar de pertencer à classe dos betalactâmicos, as cefalosporinas são antimicrobianos estáveis às β-lactamases e, dessa forma, eficazes contra Staphylococos spp. (Spinosa et al. 2002). Toma et al. (2008) consideraram incomum a resistência à cefalexina, antimicrobiano de primeira escolha para o tratamento do pioderma superficial em cães, fato confirmado neste estudo, no qual 98% (151/154) dos isolados demonstraram sensibilidade à cefalexina e cefadroxil. Resultados semelhantes foram observados em estudos conduzidos na França (Ganiere et al. 2005), Estados Unidos (White et al. 2005) e Itália (Vanni et al. 2009), onde os pesquisadores não detectaram resistência à cefalexina ao avaliar amostras de cães acometidos por pioderma. No Brasil, Cavalcanti & Coutinho (2005) também encontraram 100% de isolados sensíveis à cefalexina, enquanto Pianta et al. (2006) averiguaram 93% de sensibilidade a esse antimicrobiano. Por outro lado, em um recente estudo italiano, 54,3% e 50% dos

28 S.pseudintermedius foram resistentes à cefalexina e cefadroxil, respectivamente (Proietti et al. 2012). Onnuma et al. (2011) compararam o perfil de resistência de S. pseudintermedius oriundos da pele de cães no Japão, em dois períodos distintos. Dos isolados obtidos entre 2000-2002, todos foram sensíveis à cefalexina, outras cefalosporinas e à oxacilina ao passo que, nas amostras coletadas em 2009, obtiveram 12,5% de resistência às cefalosporinas e 11,4% à oxacilina. Esses resultados são um alerta da possibilidade de mudança dos perfis de suscetibilidade, especialmente pela emergência de bactérias resistentes à meticilina, as quais frequentemente desenvolvem resistência cruzada às cefalosporinas. A resistência à meticilina, que é utilizada para avaliar a multirresistência aos betalactâmicos, foi pesquisada neste estudo pelo método de disco-difusão e detectada em 5,8% (9/154) dos isolados, resultado inferior aos de Jones et al. (2007), Nienhoff et al. (2011), Youn et al. (2011) e Proietti et al. (2012), nos quais a frequência de S. pseudintermedius resistentes à meticilina (MRSP) variou de 7,4% a 41,4% das amostras avaliadas. Como o aumento da prevalência de MRSP em cães com pioderma superficial é um acontecimento relativamente recente (Jones et al. 2007, Loeffler et al. 2007, Lucia et al. 2011), torna-se importante a avaliação local e periódica dos perfis de suscetibilidade. Como já mencionado, as cefalosporinas são os antimicrobianos de primeira escolha e utilizados com maior frequência no tratamento dessa dermatopatia, entretanto, frente a infecções cutâneas por MRSP, as cefalosporinas deixam de constituir opções terapêuticas, o que restringe a seleção dos fármacos. Quanto à associação sulfametoxazol e trimetoprim, alguns estudos revelaram baixa resistência à essa combinação, como o realizado por Pedersen et al. (2007) que identificaram apenas 3,6% de isolados de estafilococos resistentes às sulfonamidas potencializadas em cães com pioderma na Dinamarca. Ganiere et al. (2005) não observaram isolados resistentes na mesma situação na França. Em contrapartida, em pesquisas conduzidas na Coreia (Youn et al. 2011) e na Itália (Proietti et al. 2012) foram detectadas 62,6% e 97,1% de amostras resistentes, respectivamente. Neste trabalho, a resistência frente à associação sulfametoxazol e trimetoprim foi de 29,9% (46/154). Tais resultados se justificam, provavelmente, aos diferentes níveis de exposição da população canina aos antimicrobianos, conforme cada região. O emprego habitual desse fármaco no tratamento de cães acometidos por pioderma pela primeira vez pode ter induzido ao surgimento de bactérias resistentes às sulfonamidas ao longo dos anos (Ganiere et al. 2005). May (2006) caracterizou as sulfonamidas potencializadas como uma razoável

29 opção terapêutica contra infecções causadas por estafilococos em pequenos animais, contudo, salientou que isolados resistentes à meticilina tendem a permanecer sensíveis a esta associação. Em virtude disso, deve haver prudência na sua utilização em dermatologia veterinária, pois podem constituir uma das poucas opções para o tratamento frente a cepas resistentes à meticilina. Segundo May (2006), antimicrobianos da classe das fluoroquinolonas constituem boas escolhas no tratamento do pioderma canino o que está de acordo com os resultados de Pedersen et al. (2007), que obtiveram somente 1,2% de resistência à enrofloxacina em 84 amostras de Staphylococcus spp. avaliadas. Os mesmos autores citaram o uso da ciprofloxacina, no entanto, pelo fato de não ser licenciado para uso em animais na Dinamarca, assim como em outros países, esse fármaco não é incluso nos testes. No mesmo estudo comparativo realizado por Onuma et al. (2011), todas as cepas isoladas de cães com pioderma foram suscetíveis às fluoroquinolonas no primeiro período avaliado, ao passo que, na década seguinte, 50% das cepas analisadas foram resistentes a tais fármacos. Ainda mais alarmantes foram os resultados de Proietti et al. (2012), que detectaram resistência à enrofloxacina em 94,3% dos isolados. Neste estudo foram observados 20,1% (31/154) e 18,8% (29/154) de isolados resistentes à enrofloxacina e ciprofloxacina, respectivamente. Estes achados podem ser atribuídos à utilização frequente e indiscriminada dessa classe de antimicrobianos tanto na terapia de dermatopatias, como de outras infecções, principalmente enrofloxacina, a qual, no Brasil, é facilmente adquirida em estabelecimentos veterinários, sem necessidade de receituário. Para alguns autores, as fluoroquinolonas somente devem ser utilizadas em casos de piodermites por Staphylococcus spp. quando outros antimicrobianos tenham sido contraindicados ou ineficientes (Guardabassi et al. 2008, Patel & Forsythe 2010), além de seu uso estar provavelmente relacionado ao aumento do risco de resistência à meticilina (Hnilica 2011). Os antimicrobianos da classe dos macrolídeos podem ser empregados no tratamento de cães com pioderma superficial (Ihrke 2006) e foram considerados como primeira opção terapêutica por Patel e Forsythe (2010). Já Hnilica (2011) recomendou o seu uso somente quando a resposta aos antimicrobianos de primeira opção tenha sido insatisfatória. Entre os macrolídeos utilizados nas doenças bacterianas da pele em cães, existem poucos dados a respeito da eficácia da azitromicina (May 2006). Neste estudo, 17,5% (27/154) dos isolados foram resistentes a este antimicrobiano. Pesquisas semelhantes, investigando a suscetibilidade à eritromicina apontaram índices de

30 resistência superiores a 30% (Ganiere et al. 2005, Pedersen et al. 2007). No Brasil, o maior percentual de resistência dos estafilococos isolados de cães com piodermite foi à eritromicina (55%) (Cavalcanti e Coutinho 2005) e à azitromicina (84%) (Pianta et al. 2006), corroborando com Ihrke (2006) que considerou a resistência bacteriana aos macrolídeos relativamente comum. A resistência antimicrobiana do S. pseudintermedius às tetraciclinas tem sido documentada na literatura entre as mais prevalentes. Em virtude disso, tais compostos tornaram-se, praticamente, sem valor terapêutico nos piodermas (Scott et al. 2001). Proietti et al. (2012) relataram 95,7% de S. pseudintermedius resistentes à doxiciclina em um total de 70 amostras e Lima et al. (2012) detectaram 46,4% de resistência à tetracilina, a qual, juntamente com as penicilinas, foi apontada entre as maiores taxas de resistência. Diferente dos resultados acima citados, neste estudo, o percentual de isolados resistentes à doxiciclina foi foi de apenas 4,5% (7/154), coincidindo com os resultados de Ganiere et al. (2005) e Ghidini et al. (2011) que encontraram 6% e 10% de resistência a este fármaco, respectivamente. Os primeiros observaram ainda 48% dos isolados resistentes à oxitetraciclina e salientaram que, mesmo comprovando a resistência cruzada entre oxitetraciclina e doxiciclina, obtiveram baixa resistência à doxiciclina. Apesar do uso das tetraciclinas não ser preconizado no tratamento do pioderma canino (Scott et al. 2001, Hnilica & May 2004, Hnilica 2011), Horvath & Neuber (2007) e Guardabassi et al. (2008) incluíram a doxiciclina entre as opções de antimicrobianos sistêmicos para uso em cães com a doença, o que também pode ser recomendado após este estudo, levando em consideração o baixo percentual de resistência (Fig.1). A vancomicina é um fármaco de importância terapêutica na medicina humana, especialmente em infecções por estafilococos multirresistentes. Já em medicina veterinária, seu uso além de não ser comum, somente é recomendado caso a infecção traga risco de vida e os testes de suscetibilidade tenham mostrado resistência a todos os outros antimicrobianos disponíveis (Guardabassi et al. 2008). Apenas uma das 154 amostras deste estudo foi resistente à vancomicina. A elevada sensibilidade (99,4%) pode ser explicada pela utilização restrita desse antimicrobiano em animais de companhia e foi semelhante aos resultados de Youn et al. (2011) que não evidenciaram resistência à vancomicina entre 230 isolados de Staphylococcus spp. Entretanto, existem relatos de cepas clínicas de Staphylococcus spp. resistentes a todas as formulações orais de antimicrobianos disponíveis para o tratamento de pioderma e otites (Loeffler et al.

31 2007). A terapia antimicrobiana contra esses isolados torna-se crítica em animais, uma vez que, além da vancomicina, outros compostos empregados em humanos como linezolida, estreptograminas e tigeciclina são caros e todos, exceto linezolida, devem ser administrados por via intravenosa (Guardabassi et al. 2008). Levando em consideração as classes de antimicrobianos, ocorreu maior resistência ao grupo das sulfamidas 29,9% (46/154), seguido pelos betalactâmicos 23,76% (13/154), fluoroquinolonas 22,34% (12/154) e macrolídeos 17,5% (27/154). Os menores percentuais de resistência foram detectados às tetraciclinas 4,5% (7/154), polimixinas 1,9% (3/154) e glicopeptídeos 0,6% (1/154). Entretanto, quando se avalia separadamente a família das penicilinas e cefalosporinas, ambas pertencentes à classe dos betalactâmicos, na primeira evidenciaram-se os maiores percentuais de resistência enquanto na segunda, os menores (Fig.1). A análise estatística comprovou que os valores de resistência antimicrobiana diferiram entre os grupos das penicilinas e cefalosporinas (P<0,05). Dessa forma, a comparação da suscetibilidade entre classes torna-se arriscada, devido ao diferente número de antimicrobianos testados em cada classe e à ausência de homogeneidade dentro de uma mesma classe, como supracitado no caso dos betalactâmicos, em que há uma subdivisão em famílias de acordo com as suas propriedades farmacológicas. Portanto, neste estudo, o agrupamento dos antimicrobianos em classes, teve como principal objetivo identificar os isolados multirresistentes, sendo considerados aqueles resistentes a três ou mais classes de antimicrobianos. Quanto à multirresistência, 23,4% (36/154) dos Staphylococcus spp. analisados apresentaram esse padrão. Esses resultados foram semelhantes aos obtidos no estudo de Lima et al. (2012), cujo percentual de cepas multirresistentes foi de 34,2% e, contrastaram com 77,1% de multirresistência averiguada por Penna et al. (2009) e 73,0% por Youn et al. (2011). Dentre os multirresistentes, em 24 verificou-se resistência a três classes de antimicrobianos, em 11 a quatro classes e um isolado frente a cinco classes (Quadro 1). Embora a multirresistência tenha íntima associação com estafilococos resistentes à meticilina em humanos e animais, esse padrão pode ocorrer na ausência de resistência à oxacilina (Jones et al. 2007), fato observado neste estudo, no qual cinco dos 36 isolados multirresistentes, também foram resistentes à oxacilina. Onnuma et al. (2011) relataram expressiva elevação na prevalência de multirresistência entre S. pseudintermedius isolados de cães com pioderma no Japão, entre 1999 e 2009. Os autores atribuíram esse aumento ao uso indiscriminado de antimicrobianos e relataram

32 ter sido mais marcado em cães submetidos à antimicrobianoterapia prévia. Neste estudo, dos 36 isolados de Staphylococcus spp. multirresistentes, em 29 casos os cães haviam recebido terapia antimicrobiana, todos com histórico de pioderma superficial recidivante. A identificação de aproximadamente um quarto de isolados multirresistentes sugere a realização de testes de suscetibilidade em todos os casos de pioderma superficial recidivante, pois futuramente, muitos antimicrobianos poderão apresentar-se ineficazes no tratamento das piodermites, assim como de outras doenças que acometem cães. Adicionalmente, as análises bacteriológicas promovem informações que subsidiam a eleição dos antimicrobianos e podem minimizar a ocorrência de resistência bacteriana visto que, conforme exposto, esta tem aumentado nos últimos anos. CONCLUSÃO Pode-se concluir que os isolados de Staphylococcus spp. apresentaram elevada suscetibilidade frente aos antimicrobianos comumente utilizados no tratamento dos piodermas superficiais em cães atendidos no HVU-UFSM, como cefalexina e amoxicilina associada ao ácido clavulânico, confirmando a eleição desses fármacos para o tratamento desta afecção. A suscetibilidade dos isolados frente às fluoroquinolonas, também recomendadas pela literatura como opção terapêutica nos piodermas, permite sugerir que estes fármacos não devem ser considerados na seleção empírica. A identificação de Staphylococcus spp. multirresistentes na população canina estudada justifica análises bacteriológicas periódicas e regionais de lesões cutâneas de cães com pioderma superficial, a fim de minimizar resistência bacteriana, possíveis falhas terapêuticas e também motiva a antimicrobianoterapia prudente. REFERÊNCIAS Bauer A.W., Kirby W.M., Sherris J.C., Turck M. 1966. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45:493-496. Bond R., Loeffler A. 2012. What`s happened to Staphylococcus intermedius? Taxonomic revision and emergence of multi-drug resistence. J. Small Anim. Pract. 56:147-154. Carter G.R. 1988. Fundamentos de Bacteriologia e Microbiologia Veterinária. 3 a ed. Roca, São Paulo. 249p. Cavalcanti S.N., Coutinho S.D. 2005. Identificação e perfil de sensibilidade bacteriana de Staphylococcus spp isolados da pele de cães sadios e com piodermite. Clin. Vet. 58:60-66.

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36 a b a b b b c c c b b d b Fig.1. Suscetibilidade aos antimicrobianos de 154 Staphylococcus spp. isolados de cães com pioderma superficial. R = resistência (%); S = sensibilidade (%); AMO = amoxicilina; OXA = oxacilina; PEN = penicilina; AMC = amocixilina/clavulanato de potássio; CFD = cefadroxil; CFE = cefalexina; AZI = azitromicina; ENO = enrofloxacina; CIP = ciprofloxacina; DOX = doxiciclina; POL = polimixina B; SUT = sulfametoxazol/trimetoprim; VAN = vancomicina; a,b,c,d = percentagens com letras diferentes diferem entre si pelo teste do qui-quadrado (P<0,05).

37 Quadro 1. Suscetibilidade aos antimicrobianos de 154 Staphylococcus spp. isolados de cães com pioderma superficial Perfil de Resistência Total (%) AMO 1 1 0,65% CIP 1 1 0,65% ENO 1 1 0,65% PEN 1 2 1,30% SUT 1 2 1,30% AMO+AMC 1 1 0,65% AMO+PEN 1 32 20,78% CEF+AZI 2 1 0,65% DOX+SUT 2 2 1,30% ENO+CIP 1 1 0,65% OXA+AZI 2 1 0,65% PEN+AMC 1 1 0,65% AMO+ENO+CIP 2 1 0,65% AMO+OXA+PEN 1 2 1,30% AMO+PEN+AZI 2 5 3,25% AMO+PEN+CFE 1 1 0,65% AMO+PEN+DOX 2 3 1,95% AMO+PEN+ENO 2 1 0,65% AMO+PEN+POL 2 1 0,65% AMO+PEN+SUT 2 8 5,19% OXA+ENO+POL 3* 1 0,65% AMO+OXA+PEN+AZI 2 1 0,65% AMO+PEN+AZI+SUT 3* 7 4,55% AMO+PEN+CIP+SUT 3* 2 1,30% AMO+PEN+DOX+SUT 3* 1 0,65% AMO+PEN+ENO+POL 3* 1 0,65% AMO+PEN+OXA+VAN 2 1 0,65% AMO+PEN+ENO+CIP+SUT 3* 12 7,79% AMO+PEN+AZI+ENO+CIP+SUT 4* 6 3,90% AMO+PEN+AZI+ENO+CIP+DOX+SUT 5* 1 0,65% AMO+OXA+PEN+CEF+AZI+ENO+CIP+SUT 4* 4 2,60% AMO+OXA+PEN+AMC+CFD+CFE+AZI+ENO+CIP+SUT 4* 1 0,65% Sem resistência 48 31,17% Total 154 100% AMO = amoxicilina; OXA = oxacilina; PEN = penicilina; AMC = amocixilina/clavulanato de potássio; CFD = cefadroxil; CFE = cefalexina; AZI = azitromicina; ENO = enrofloxacina; CIP = ciprofloxacina; DOX = doxiciclina; POL = polimixina B; SUT = sulfametoxazol/trimetoprim; VAN = vancomicina; 1 = resistência a uma classe; 2 = resistência a duas classes; 3 = resistência a três classes; 4 = resistência a quatro classes; 5 = resistência a cinco classes; *multirresistentes.

CONCLUSÃO Pode-se concluir que os isolados de Staphylococcus spp. apresentam elevada suscetibilidade frente aos antimicrobianos comumente utilizados no tratamento dos piodermas superficiais em cães atendidos no HVU-UFSM, como cefalexina e amoxicilina associada ao ácido clavulânico, o que confirma a eleição desses fármacos para o tratamento de cães com esta afecção. A suscetibilidade dos isolados frente às fluoroquinolonas, também recomendadas pela literatura como opção terapêutica nos piodermas, permite sugerir que estes fármacos não devem mais ser considerados na seleção empírica. A identificação de Staphylococcus spp. multirresistentes na população canina estudada justifica análises bacteriológicas periódicas e regionais de lesões cutâneas de cães com pioderma superficial a fim de minimizar resistência bacteriana, possíveis falhas terapêuticas e também motiva a antimicrobianoterapia prudente.

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ANEXOS

45 ANEXO A Ficha dermatológica Nome Proprietário Raça Idade Sexo Peso E. nutricional Idade da aquisição: < 2 meses 2 a 6 meses 6 a 12 meses Adulto Local da aquisição: Canil Particular Loja/Feira Rua ou abrigo Cidade Vacinas: Não Anuais/polivalente Gripe Giárdia Atrasadas Raiva Vermífugo: Plus a cada 3 meses Plus a cada 6 meses Atrasado Há quanto tempo com problema de pele: < 1 mês 1 a 6 meses 6 a 12 meses > 1 ano Anos Que idade tinha quando os problemas começaram: < 6 meses 6 a 12 meses 1 a 3 anos 4 a 6 anos Acima de 7 anos Qual o primeiro sinal apresentado: Prurido Perda de pelos Lesões Se há prurido, qual o grau: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Quais as áreas que coça, lambe ou morde: Face Orelhas Pescoço Axilas/virilhas Dorso Patas Períneo Laterais Se tem lesões, qual o aspecto: Eritema Descamação Pápulas Pústulas Crostas Lesões hemorrágicas Mudança na coloração da pele Existe sazonalidade no problema: Não Piora no verão Piora no inverno Existe horário do dia em que fica pior: Não Sim / Manhã Tarde Noite Apresenta ectoparasitas: Não Sim / Pulgas Carrapatos Quando vistos pela última vez: < 1 mês > 1 mês Mais de 3 meses Produto utilizado para controle: Banhos Pós Pour on Nenhum Em que ambiente vive: Casa / Interno Externo Apartamento Tem acesso a: Rua Praças Chácara Casas de parentes Praia Tem contato com: Tapetes Aerossóis Plantas Cimento Terra Onde dorme: C/ o dono Sofá Cama própria Área de serviço Canil Posições que dorme: Decúbito ventral Decúbito dorsal Decúbito lateral Produtos de limpeza: Multiuso Alvejante Cera Desinfetante Tem contato com o sol: Alto Normal Baixo Convive com outros: Cães Gatos / Em casa Na rua Parentes Alguém mais afetado: Pessoas Cães Gatos Viagem recente: Sim Não Frequência do Banho: Semanal Quinzenal Mensal Raro Produto usado: Shampoo canino Sabonete Terapêutico Ambiente do banho: Pet shop Casa Tosado Sim Não