PROCEDIMENTO OPERACIONAL PADRÃO NAS PROVAS PRÉ - TRANSFUSIONAIS Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 1 de 39
Elaborado: Hildenete Monteiro Fortes Assinatura: Data da Elaboração: 02.02.2003 Aprovado e liberado por: Hildenete Monteiro Fortes Data da implantação: 10 de fevereiro de 2003 Data da revisão: 12/10/2011 Revisada por: Hildenete Monteiro Fortes Marcia Beatriz Cattini Melo Periodicidade da Revisão: anual Tempo de arquivo: 05 anos Setor: Imunohematologia da Agência Transfusional do HUJM Código do documento: PPT 06 Número da versão atual: 06 Número total de Páginas: 39 Número de cópias - distribuição: 02 Original para a direção arquivo; Setor de Imunohematologia da Agência Transfusional. ESTE É UM DOCUMENTO CONTROLADO Não deve ser copiado ou distribuído sem a autorização da chefia da Agência Transfusional do HUJM. Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 2 de 39
I - OBJETIVO: Liberação de hemocomponentes com qualidade para transfusão aos pacientes internados ou no ambulatório do HUJM, após realização de provas pré-transfusionais na Agência Transfusional de acordo com a PORTARIA N o 1353 de 13 de junho de 2011. II - PRINCÍPIO: Determinar o Grupo ABO: Sistema ABO é o mais importante para a prática transfusional. A tipagem sangüínea direta pesquisa a presença de antígenos ABO nas hemácias teste e a reversa seus anticorpos correspondentes utilizando hemácias conhecidas A1 e B. Nunca liberar uma unidade de sangue para transfusão até que a discrepância entre tipagem direta e reversa tenha sido resolvida. Determinar o Fator Rh: O antígeno D (Rh) é considerado o mais imunogênico e o mais importante na transfusão. Na determinação do tipo Rho (D), é obrigatório o uso do soro anti-d e do controle Rh (do mesmo fabricante e marca do soro Anti-D em uso, este último pela possibilidade da presença de auto-anticorpos e / ou proteínas séricas anormais. Pesquisar Anticorpos Irregulares: Visa detectar anticorpos irregulares clinicamente significantes no soro/plasma do receptor, consiste em testar o soro do receptor com hemácias de triagem conhecidas. É importante que se utilize SEMPRE um autocontrole nas mesmas fases e temperaturas em que foram utilizadas as hemácias de triagem. Realizar Prova de compatibilidade: Exceto para as solicitações de extrema urgência é realizada antes da transfusão de sangue total ou de hemácias, verifica a compatibilidade ABO e /ou presença de anticorpos no receptor (soro) contra antígenos (hemácias) do doador que se encontra no tubo coletor da bolsa a ser transfundida. É desnecessária a realização de prova de compatibilidade antes da transfusão de plasma, crioprecipitado e concentrado de plaquetas. Retipificar Grupo ABO/Rh dos doadores: Em todos os hemocomponentes com hemácias a serem cruzados. Realizar de uma amostra do tubo coletor da bolsa de sangue a retipagem ABO enquanto que a retipagem do Fator Rh só precisa ser feita em bolsas de sangue Rh negativas. Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 3 de 39
Realizar em todas as provas antiglobulina que deram resultados negativos um controle de hemácias sensibilizadas com IgG Controle de Coombs, para evitar resultados falsos negativos. Segurança Transfusional: Toda transfusão sanguínea ou componente sanguíneo deverá ser prescrita por um médico de acordo com a PORTARIA N o 1353 de 13 de junho de 2011. Seleção de Hemocomponentes para transfusão e as provas de compatibilidade são baseadas na resolução da diretoria colegiada PORTARIA N o 1353 de 13 de junho de 2011. Quaisquer sintomas ou sinais ocorridos durante a transfusão devem ser considerados como sugestivos de possível reação transfusional, devendo ser investigado para tal utilizando a FIT ficha de investigação transfusional anexo. III - APLICAÇÃO CLÍNICA: Atendimento com qualidade de todas as solicitações de transfusão de hemocomponentes aos pacientes internados ou atendidos no ambulatório do Hospital Universitário Júlio Müller. FLUXOGRAMA na rotina transfusional: Receber requisição de transfusão devidamente preenchida e assinada pelo médico solicitante. Nunca esquecer de anotar hora recebimento. Conferir os dados da requisição da transfusão (APAC) se não estiverem corretamente preenchidos, devolver ao portador. Caso a requisição de transfusão esteja corretamente preenchida, verificar se o paciente já é cadastrado no Serviço de Hemoterapia Ficha transfusional ou no computador. Colher amostra de sangue do receptor se for a primeira vez que tomará sangue no hospital, em casos de já ter recebido transfusão colher nova amostra após 72 horas da realização da transfusão. A identificação dos tubos para coleta das amostras deve ser com nome do receptor, registro, Clínica, data coleta, assinatura de quem colheu. Caso o paciente já tenha a classificação ABO/Rh anterior fazer a comparação com o resultado atual, realizar também pesquisa de anticorpos. Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 4 de 39
Ambas as classificações estão conformes? IGUAIS? Se NÃO colher nova amostra. Se SIM selecionar o hemocomponente a ser transfundido. Retipar o hemocomponente (com HEMÁCIAS), se NÃO houver concordância na classificação anotar o resultado e pegar nova bolsa para realizar a reclassificação. Comunicar ao responsável pelo setor que tomará as providências cabíveis. Se a retipagem confere, realizar a PROVA DE COMPATIBILIDADE (PC) e a PESQUISA DE ANTICORPOS IRREGULARES DO PACIENTE (PAI). PC compatível e PAI negativo anotar o resultado, identificar e liberar a bolsa para transfusão. PC Incompatível anotar o resultado, selecionar outra bolsa e repetir o PAI. PAI positivo, anotar o resultado e ENVIAR AMOSTRA para o MT-Hemocentro para identificação de anticorpos e provas de compatibilidade até encontrar sangue compatível com o receptor para realizar a transfusão. Quando os resultados das provas pré-transfusionais demonstrarem que não há sangue compatível para o receptor o Serviço de Hemoterapia deve comunicar este fato ao médico solicitante. Provas pré-transfusionais de rotina: Determinação do grupo ABO, do fator Rh e a pesquisa de anticorpos irregulares no sangue do receptor. Retipagem ABO de todas as bolsas de sangue e Rh da bolsa de sangue tipada como Rh negativo (CASO NÃO TENHA SIDO AINDA REALIZADA). Realização de uma prova de compatibilidade entre as hemácias do doador e o soro do receptor. 1. Exames no sangue do RECEPTOR adulto e crianças com mais de 4 meses de idade: ROTINA Classificações dos sistemas ABO e Rh, pesquisa de anticorpos irregulares, Coombs direto e prova de compatibilidade na rotina serão realizadas pelos métodos em tubo ou Gel. Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 5 de 39
Classificação em tubo dos sistemas ABO e Rh Prova de hemácias = Direta Prova de soro = Reversa Determinação do Fator Rh (D), caso negativo realizar técnica de exclusão de D-fraco. Pesquisa de Anticorpos Irregulares clinicamente significantes Técnicas: Salina/ Albumina /AGH ou Gel Prova de Compatibilidade em Tubo Técnicas: Salina/albumina/AGH ou Gel 2. Repetição de exames no sangue do DOADOR: Quando for realizar transfusão de sangue total ou concentrado de hemácias realizar: Retipagem do grupo ABO Retipagem do fator Rh em bolsas de sangue rotuladas de Rh Negativo 3. Provas de compatibilidade Realizar quando for usar componentes sangüíneos que contenha hemácias. Utilizam-se hemácias do tubo coletor da bolsa a ser transfundida e o soro do receptor. Inspecionar o aspecto do sangue antes de realizar a prova de compatibilidade. Caso haja qualquer discrepância nas provas pré-transfusionais, chamar profissional responsável pelo setor para esclarecimento. IV. AMOSTRAS: Hemácias / soro do receptor e Hemácias do doador O técnico do serviço de Hemoterapia deverá colher às amostras 1. Identificar os tubos de hemólise da amostra do receptor no momento da coleta com nome completo, registro, data da coleta, nome do coletor. 2. Colher em tubo de hemólise 12x75 mm com EDTA - de 04 ml de sangue (ABO, Rh, CRh= controle de Rh e Coombs direto) Se técnica em GEL / TUBO Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 6 de 39
3. Colher em tubo de hemólise seco 12x75 mm - 5 ml de sangue sem anticoagulante para realização de PAI e prova de compatibilidade Se técnica em TUBO. 4. As amostras devem ser devidamente transportadas em caixas térmicas. 5. As amostras hemolisadas ou lipêmicas devem ser desprezadas. 6. Armazenar os soros do receptor e amostra do sangue da bolsa transfundida por 03 dias na geladeira entre 4 +/- 2 o C. OBSERVAÇÃO: Em paciente pediátrico colher apenas um tubo sem anticoagulante com 03 ml de sangue. Quando necessário enviar amostras para o MT-HEMOCENTRO estas deverão ser colhidas com e sem anticoagulante. V. MATERIAIS: Método em Tubo 1. Centrífuga sorológica de mesa 2. Estante de metal porta tubos 3. Banho Maria 37ºC 4. Micropipetas 50 l e 100 l 5. Tubos de ensaio 10 x 75 mm. Método em Gel 1. Centrífuga para cartões 2. Incubadora para cartões 37 C 3. Micropipetas de 10, 25, 50 e 100 l 4. Cartões em gel. Reagentes para método em Gel 1. Diluente 1 (Bromelina) 2. Diluente 2 (LISS) 3. Cartões de gel ID-ABD, ID-ABO/Rh, ID-confirmação D (Rh), ID-Liss/Coombs. Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 7 de 39
VI. REAGENTES: Soro mono ou policlonais anti A, anti B, anti A,B. Caso seja utilizado anti-soros MONOCLONAIS, a utilização do soro anti A,B não é necessária. Soro anti D albuminoso (Rh), mono ou policlonais Soro anti gama globulina = Coombs = Monoespecífico. Soro poliespecífico = Anti Humano. Controle de Rh, da mesma procedência do soro anti D. Hemácias conhecidas de grupo A 1 e B em suspensão salina 3 5%. Hemácias comerciais para triagem de anticorpos. Hemácias teste suspensão LISS Controle de Coombs - Hemácias controle, cobertas por anticorpos IgG. Solução fisiológica. Diluente 2 LISS VII. PROCEDIMENTOS: MÉTODO EM TUBO - PREPARAR SUSPENSÃO HEMÁCIAS: Receptor Doador Identificar um tubo de hemólise 12x75 mm com letra R Receptor Identificar um tubo de hemólise 12x75mm com letra D Doador Lavar hemácias do Doador e Receptor 1. Colocar nos respectivos tubos de hemólise - 200 ul de concentrado de hemácias do Doador e Receptor (1 min / 3400 rpm) 2. Colocar soro fisiológico em cada tubo 3. Centrifugar a 3400 rpm por 1 minuto 4. Desprezar o sobrenadante e repetir mais 02 vezes os itens 02 e 03. Hemácias suspensa em SALINA 3 a 5% 1. Identificar 02 tubos de hemólise 12x75 doador e receptor 2. Colocar - 1000 ul Salina soro fisiológico (salina 3. Colocar - 75 ul Hemácias do Doador no tubo D 4. Colocar - 75 l Hemácias do Receptor no tubo R Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 8 de 39
SEPARAÇÃO DO SORO RECEPTOR Centrifugar o tubo sem anticoagulante 3 min / 3400 rpm. Separar o soro do receptor em um tubo de hemólise já identificado. Doador: Hemácias suspensa Salina Receptor: Hemácias suspensa Salina Soro Procedimento técnico para: CLASSIFICAÇÃO SANGUÍNEA ABO/Rh O sistema ABO primeiro sistema de grupo sangüíneo descoberto, é o único onde anticorpos estarão certamente presentes no soro de indivíduos que não possuam o(s) antígeno(s) correspondente(s). É o sistema mais importante para a prática transfusional. A classificação direta pesquisa a presença dos antígenos ABO nas hemácias testes, enquanto a reversa pesquisa seus anticorpos correspondentes no soro, utilizando hemácias comerciais (hemácias de triagem conhecidas). 1. Identificar os tubos de hemólise 12 x 75 mm com caneta de retroprojetor A B AB Rh CR HA HB DIRETA REVERSA 2. Colocar tubos de A-CR Anti soro / controle / soro do receptor 50 ul Soro Anti A no tubo A 50 ul Soro Anti B no tubo B 50 ul Soro Anti A,B no tubo AB 50 ul Soro Anti Rh (D) no tubo Rh Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 9 de 39
50 ul Controle Rh no tubo CR - Controle de Rh 100 ul Soro teste (Receptor) nos tubos de HA e HB 3. Colocar hemácias conhecidas e do receptor 50 ul hemácias A1 no tubo HA 50 ul hemácias B no tubo HB 50 ul Suspensão Hemácias do Receptor nos tubos de A a CR 4. Homogeneizar bem os tubos 1. Colocar para centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos ou 1000 rpm por 1 minuto 2. Ressuspender o botão de hemácias formado agitando levemente 3. Ler para aglutinação e hemólise, usando auxiliar ótico. 4. Anotar os resultados em cruzes ou escore de acordo com a graduação apropriada MÉTODO EM GEL Tipagem ABD/ABD (monoclonal) DIRETA dois pacientes por cartão Cartão ID-Dia Clon Conf.ABD/ABD Diluente Diluente 2 (LISS) Amostra Hemácias (sedimento) Suspensão 500 ul de Diluente 2 + 25 ul de hemácias (sedimento) Técnica* -- (Resumo prático, não substituir pelas instruções de uso contidas na caixa do produto) 1. Preparar a estação de trabalho colocando nos respectivos furos os tubos das amostras bem centrifugadas ao lado de um tubo já contendo 500ul de diluente 2 (LISS) em direção a um cartão de DiaClon ABD/ABD. 2. Identificar, de cima para baixo, os cartões em relação aos respectivos tubos de amostras. Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 10 de 39
3. Começando da amostra do primeiro paciente, pipetar exatamente 25 ul de hemácias (sedimento) nos tubos contendo 500ul de diluente 2 liberando a ponteira dentro do tubo de suspensão e passando à segunda amostra e assim sucessivamente. 4. Abrir os cartões devidamente identificados e pipetar 12,5 ul, desta suspensão de hemácias acima, nos micro tubos A,B,D/A,B,D (dois pacientes por cartão). 5. Centrifugar e Ler. Tipagem REVERSA (Prova de Simonin) em cartão de gel neutro Cartão ID-NaCI/Cinza./AF Hemácias ID-DiaCell A1,B Amostras Soro ou Plasma Técnica -- (Resumo prático, não substituir pelas instruções de uso contidas na caixa do produto). 1. Prepara a estação de trabalho colocando os tubos das amostras bem centrifugadas em direção a um cartão ID-NaCI/Enz./AF e, na parte superior da estação, identificar e colocar dois tubos contendo uma quantidade de hemácias A1 e B (do ID-DiaCell a1 B). 2. Identificar os cartões em relação aos respectivos tubos de amostras dividindo e isolando dois micros tubos para cada prova reversa, identificando como A1 e B cada micro tubo e no corpo do cartão o nome do respectivo paciente. 3. Abrir os cartões e pipetar 50 ul de todas as hemácias A 1 e B nos respectivos micros tubos de cada cartão devidamente identificados. 4. Pipetar 50 ul do plasma ou soro sobre as hemácias A 1 e B, descartando a ponteira. 5. Centrifugar e Ler. Tipagem Rh (Enzimática com soro Policlonal de origem Humana) Cartão ID-Anti-D (Humano) Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 11 de 39
Diluente ID-Diluente 1 (Bromelina) Amostra Hemácias (sedimento) Suspensão 500 ul de Diluente 1 + 25 ul de hemácias (sedimento) Técnica* -- (Resumo prático, não substituir pelas instruções de uso contidas na caixa do produto) 1. Preparar a estação de trabalho colocando nos respectivos tubos das amostras bem centrifugadas ao lado de um tubo contendo 500ul de ID-Diluente 1 (bromelina) em direção a um cartão ID-Anti-D. 2. Identificar os cartões em relação aos respectivos tubos de amostras. 3. Pipetar 25 ul de hemácias (sedimento) nos tubos contendo 500ul de ID-diluente 1 4. Incubar 10 minutos a T.A. 5. Abrir os cartões e pipetar 12,5 ul dessa suspensão de hemácias nos micro tubos respectivamente identificados. 6. Centrifugar e Ler Obs.: Para se realizar concomitantemente o controle do teste, pipetar 12,5 ul da mesma suspensão no cartão NaCl/Enz/AF (Neutro) juntamente com prova. INTERPRETAÇÃO: DIRETA REVERSA Reagentes / Soro Soro Soro Hemácias Hemácias Grupo ABO Anti-A Anti-B Anti-AB A 1 B A + - + - + B - + + + - AB + + + - - O - - - + + As reações esperadas para testes positivos são 3+ e 4+. A presença de aglutinação nos tubos de hemácias teste e presença de hemólise nos tubos de soro teste indicam reações positivas. Hemácias suspensas, após leitura do botão de hemácias, correspondem a resultado negativo. Discrepâncias entre a classificação direta e reversa devem ser resolvidas antes da interpretação do grupo sanguíneo da amostra teste. Não deverão ser Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 12 de 39
liberados antes da realização de testes adicionais necessários, incluindo-se testes com lecitinas anti-a 1 e anti-h. Qualquer discrepância entre a tipagem DIRETA e REVERSA deverá ser resolvida pelo responsável técnico do serviço que será informado imediatamente. Rh Positivo e Rh Negativo O termo Rh positivo e Rh negativo, refere-se à presença (Rh positivo) ou ausência (Rh negativo) na membrana da hemácia do antígeno D, que é, após os antígenos A e B, o mais importante em transfusão de sangue. O anticorpo anti-d não esta normalmente presente no soro/plasma dos pacientes Rh negativos. Seu desenvolvimento depende de uma exposição prévia ao antígeno. 80 % das pessoas Rh negativo que recebem pelo menos uma transfusão Rh positivo, poderão desenvolver o anticorpo anti-d. O antígeno é muito imunogênico determinando que grande parte das pessoas expostas ao antígeno desenvolva o anticorpo. Os mecanismos comuns de imunização são gestações e/ou transfusão anterior. Outros antígenos do sistema Rh tem também importância clínica, entre eles C (grande) e c (pequeno), E (grande) e e (pequeno). A combinação dos 05 principais antígenos do sistema Rh, avaliando-se a partir da nomenclatura de Fisher e Race oferecem ferramentas para a resolução de problemas diários. INTERPRETAÇÃO para tipagem Rh e Pesquisa de D-fraco: 1. Quando a prova para tipagem do fator Rh(D) ou a prova para D-fraco resultar POSITIVOS a tipagem será considerada Fator Rh positivo. 2. Quando a prova para tipagem do fator Rh(D) ou a prova para D-fraco resultar NEGATIVOS a tipagem será considerada NEGATIVA, ou seja, Fator Rh negativo. 3. Para que a tipagem do fator Rh possa ser considerado como válido o resultado do controle de Rh é sempre NEGATIVO. 4. Caso o controle de Rh (tubo CR) seja POSITIVO não considerar o seu Rh e proceder da seguinte maneira: Considerar INVÁLIDA a tipagem Rh. Utilizar antissoro anti-d da classe IgM. Chamar o responsável para resolver o caso. Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 13 de 39
Se houver URGÊNCIA considere o paciente como Rh negativo e fizer a prova de compatibilidade com sangue Rh negativo. 5. Todos os resultados Rh Negativo fazer a pesquisa de D-fraco Procedimento técnico para PESQUISA de D-fraco em TUBO: 1. Pegar os 02 tubos de hemólise identificados Rh e CR que deram negativos 2. Incubar os 02 tubos - Rh e CR em Banho Maria a 37ºC durante 15 minutos 3. Retirar os tubos do BM e centrifuga-los a 3400 rpm por 15 segundos 4. Fazer a leitura para presença ou ausência de aglutinação 5. Quando negativo realizar a lavagem 03 x com soro fisiológico 6. Desprezar o sobrenadante e secar bem os tubos 7. Adicionar soro de Coombs (Anti IgG) 100 ul, homogeneizar bem os tubos 8. Centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos 9. Fazer a leitura 10. Se houver ausência de aglutinação nos 02 tubos: Pingar Controle de Coombs 50 ul cada tubo Homogeneizar, centrifugar a 3400 rpm por 15 segundos e fazer a leitura Para que o teste seja validado os tubos devem dar positivos, caso contrário reiniciar todos os procedimentos. Interpretação: Se o tubo Rh der positivo com o tubo CR negativo você tem um paciente D fraco positivo, ou seja, Rh negativo D-fraco positivo, ideal usar sangue Rh negativo, principalmente para crianças e mulheres em idade fértil. Se o tubo Rh der negativo o paciente é D fraco negativo e só poderá receber sangue Rh negativo. D fraco A característica de reagir de modo atípico com anti-d apresentada por algumas células foi descrita por Stratton, em 1946, como sendo tais células portadoras do fenótipo Dfraco. De acordo com a descrição original, esse fenótipo não reagia ao método de aglutinação direta, mas podiam ser expressos com o uso da técnica de AGH indireto. (Coombs Indireto). Atualmente sabemos que a diferença entre D+ e Dfraco é quantitativa, não qualitativa. A maioria dos soros monoclonais utilizados regularmente nas rotinas, são capazes de detectar a maioria das amostras que foram até então classificadas como Dfraco. Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 14 de 39
D Parcial As hemácias que ao serem testadas com antisoros monoclonal apresentar resultados negativos para o antígeno D, ou seja, Rh negativo deverão ser testadas novamente utilizando-se reagentes de origem humana, policlonais para determinação da possibilidade de tratar-se de um D categoria. Sabe-se que a presença de epitopos de um antígeno D parcial é capaz de determinar a formação de um anticorpo correspondente. Os D parciais, fenótipos raros de antígeno D positivos, foram divididos em categorias numeradas de I a VII. As categorias III, IV e V, em face de algumas outras evidências sorológicas foram subdivididas. RECOMENDAÇÕES: 1. Utilizar um antissoro monoclonal que detecta o antígeno D parcial categoria VI (DVI- ou IgG) e um antissoro que não detecta o antígeno D parcial categoria VI (DVI- ou Ig M), quando houver discrepância nos resultados entre os dois antissoros utilizados deve-se investigar a presença de D fraco e D parcial na amostra. 2. Em pacientes RhD-negativo recomenda-se a pesquisa de antígeno C e E PESQUISA ANTICORPOS Irregulares: PRINCÍPIO: Anticorpos ditos irregulares são aqueles formados por imunização devido a transfusões, gestação ou ingestão constante de material imunogênico, sendo de classe IgG ou IgM. Em teste pré-transfusionais, além da determinação ABO e Rh é obrigatória também a realização da pesquisa de anticorpos irregulares em receptores de hemocomponentes (R.D.C N o 343 de 13/12/02). É um teste de triagem onde em casos de pesquisa positiva, deve-se identificar a classe e especificidade do anticorpo responsável, para a seleção de sangue compatível, antígeno negativo para a transfusão. O teste emprega um KIT contendo no mínimo duas suspensões de hemácias O (hemácias de triagem), as quais possuem a maioria dos antígenos estudados em rotina de banco de sangue. Havendo presença de anticorpos irregulares no soro a ser testado, estes reagirão com os antígenos correspondentes, presentes nas hemácias de triagem. Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 15 de 39
Anticorpos da classe IgM são normalmente detectados em meio salino e temperatura ambiente, enquanto que anticorpos da classe IgG são detectados através da utilização do soro antiglobulina humana após a incubação a 37ºC. Quanto às enzimas proteolíticas, sabe-se que modificam os antígenos presentes na membrana eritrocitária, podendo retirá-los ou torná-los aglutináveis em suspensões salinas. Os antígenos sensíveis à ação enzimática são os dos sistemas MNS Duffy Xg a os anticorpos cuja reatividade é aumentada pela ação de enzimas são os dos sistemas Rh, Kidd, Lewis e P. A ação enzimática inclui ainda modificações nas propriedades físicas da suspensão de hemácias, podendo causar auto-aglutinação sem presença de processos auto-imunes. As técnicas enzimáticas podem ser associadas ao soro anti-gama globulina humana (soro anti IgG) e podem ser utilizadas em técnicas de 1 ou 2 estágios. Na primeira adiciona-se a enzima diretamente a mistura soro + hemácias, sendo mais bem indicada para testes de triagem enquanto que no segundo procedimento as hemácias são previamente tratadas com enzimas e depois misturadas ao soro teste, sendo melhor indicado para identificação de anticorpos. As principais enzimas utilizadas em testes imunohematológicos são: BROMELINA (abacaxi), PAPAINA (mamão), TRIPSINA (estômago de porco) e FICINA (ficus). As alíquotas de solução enzimáticas devem ser mantidas em freezer, devendo-se desprezá-las após o descongelamento e utilização. Não utilizaremos as técnicas enzimáticas. Procedimento técnico em TUBO para pesquisa de ANTICORPOS IRREGULARES: SALINA / ALBUMINA / A.G.H. Identificar 2 Tubos I II 1. Soro do receptor colocar 100 ul em cada tubo 2. Hemácias triagem I Pingar 50 ul no tubo I 3. Hemácias de triagem II Pingar 50 ul no tubo II 4. Centrifugar 3400 rpm por 15 segundos ou 1000 rpm por 1 minuto Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 16 de 39
5. Ressuspender o botão de hemácias formado agitando levemente 6. Ler para aglutinação e hemólise, usando um auxiliar ótico. Interpretar 7. Anotar os resultados em cruzes ou escore de acordo com a graduação apropriada CASO os tubos I e II sejam: I II A. Negativo REALIZAR A SEGUINTE Técnica 1. Albumina Bovina 22% acrescentar 100 ul cada tubo 2. Incubar em Banho-maria à 37ºC por período variando entre 15 minutos e 1 hora de acordo com a orientação do fabricante. 3. Centrifugar 3400 rpm por 15 segundos, ler e anotar os resultados. 4. Lavar 03 vezes com soro fisiológico, desprezar o sobrenadante e secar os tubos. 5. Soro Anti Humano (Poli específico) acrescentar 100 ul em cada tubo 6. Homogeneizar e centrifugar 3400 rpm por 15 segundos, ler e anotar os resultados. 7. POSITIVO = presença de anticorpos irregulares encaminharem amostra ao MT HEMOCENTRO para identificação de anticorpos e comunicar ao responsável pelo Serviço. 8. NEGATIVO = Ausência de anticorpos irregulares neste caso: 9. Acrescentar Controle Coombs 1 gota em cada tubo, 10. Homogeneizar e centrifugar os tubos a 3400 rpm por 15 segundos e ler, resultará POSITIVO após usar o controle de Coombs para poder validar o teste, se for negativo refazer todo o teste desde o inicio usar soro poli específico de outro lote e o mesmo. B. Positivo: I II Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 17 de 39
1. Colocar no Banho Maria - Soro do receptor por 15 minutos 2. Identificar 02 tubos de hemólise I e II deixar no BM por 15 minutos 3. Soro receptor aquecido previamente - acrescentar 100 ul em cada tubo 4. Hemácias I acrescentar 50 ul no tubo I 5. Hemácias II acrescentar 50 ul no tubo II 6. Incubar Banho Maria a (37ºC) durante 1 hora 7. Centrifugar 3400 rpm por 15 segundos, ler e anotar os resultados. 8. Lavar 03 vezes com soro fisiológico (salina) 9. Soro Poli específico = anti globulina Humana (AGH) - acrescentar 100 ul cada tubo 10. Centrifugar 3400 rpm por 15 segundos, ler e anotar os resultados. 11. Positivo = presença de anticorpos irregulares na amostra do receptor Encaminhar para o MT-HEMOCENTRO para identificação de anticorpos 12. Negativo = ausência de anticorpos irregulares neste caso: Acrescentar Controle Coombs 1 gota em cada tubo Homogeneizar e centrifugar os tubos a 3400 rpm por 15 segundos e ler, resultará POSITIVO após usar o controle de Coombs para poder validar o teste, se for negativo refazer todo o teste desde o inicio usar soro poli específico de outro lote e o mesmo. INTERPRETAÇÃO: Ausência de aglutinação em todas as etapas do teste indica ausência de anticorpos irregulares contra antígenos presentes nas hemácias de triagem. Presença de aglutinação em fase de anti-gamaglobulina humana indica presença de anticorpos da classe IgG, os quais geralmente possuem importância clinica, devendo-se selecionar sangue antígeno-negativo para a transfusão. No caso de pesquisa positiva, realizar a identificação do(s) anticorpo(s). Os métodos enzimáticos não deverão ser utilizados como única técnica de triagem de anticorpos, por excluírem anticorpos, cujos antígenos correspondentes foram destruídos pelas enzimas utilizadas. Pesquisa de Anticorpos Irregulares (teste de Coombs Indireto) - GEL Cartão ID-LISS/Coombs Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 18 de 39
Hemácias Células I e II do ID-DiaCell I+II Amostra do receptor Soro ou Plasma bem centrifugado Técnica -- (Resumo prático, não substituir pelas instruções de uso contidas na caixa do produto). 1. Preparar a estação de trabalho colocando os tubos das amostras bem centrifugadas em direção aos cartões LISS/Coombs. 2. Identificar dois ID-Tubos como I e II e colocar uma quantidade de células do ID-DiaCell I+II respectivamente. 3. Isolar e Identificar dois micros tubos no cartão como I e II e o nome do paciente logo abaixo. 4. Pipetar 50ul das células do ID-DiaCell I+II nos micro tubos devidamente identificados. 5. Pipetar 25ul do soro ou plasma sobre as células já pipetadas. 6. Incubar por 10 minutos a 37ºC no ID-Incubadora. 7. Centrifugar 1000 rpm durante 10 minutos e Ler. PROVA DE COMPATIBILIDADE = PROVA CRUZADA: PROCEDIMENTO EM GEL Cartão ID-LISS/Coombs Diluente Diluente 2 (LISS) para suspensão das hemácias do doador Amostra Doador: Sangue da Cânula da bolsa ou sangue total bem centrifugado. Paciente: Plasma ou soro. Suspensão 1000ul de Diluente 2 (LISS Modificado) + 10 a 12,5 ul de hemácias (sedimento) Técnica (Resumo prático, não substituir pelas instruções de uso contidas na caixa do produto.) Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 19 de 39
1. Preparar a estação de trabalho colocando da esquerda para a direita: Os tubos das amostras bem centrifugadas dos pacientes (separados soro ou plasma) Seguida das cânulas das bolsas (no interior de um tubo) Seguida de um ID-Tubo com 1000ul de ID-Diluente 2 Em direção a um cartão ID-LISS/Coombs. 2. Identificar os cartões e relação aos respectivos de amostras isolando, com uma caneta, um ou mais micro tubos e sob ele o nº da (s) bolsa (s) do (s) doador (es) e no corpo do cartão o nome do paciente, imediatamente abaixo dos respectivos micros tubos. 3. Sangrar as cânulas nos tubos, desprezando-as, e pipetar 10 a 12,5 ul das hemácias no ID-Tubo contendo p ID-Diluente 2 (LISS Modificado) e homogeneizar. 4. Abrir os cartões e pipetar 50 ul da suspensão descrita acima no(s) respectivos micros tubo(s) do cartão ID-LISS /Coombs, devidamente identificado(s) 5. Em seguida pipetar 25ul de plasma ou soro sobre as respectivas hemácias. 6. Incubar os cartões por 10 minutos a 37ºC no ID-incubadora. 7. Centrifugar e Ler Interpretação Compatibilidade ABO e Rho (D) confirmada: os micro tubos A-B-D apresentam reações claramente positivas ou negativas. Compatibilidade ABO e Rho (D) não confirmada: presença de dupla população de hemácias num mesmo micro tubo. Compatibilidade Receptor-Doador: reações negativas nos testes enzimáticos e de Coombs. Incompatibilidade Receptor-Doador: reações positivas (fortes ou fracas) nos teste enzimático e/ou de Coombs. Autocontrole positivo: verificar presença de auto-anticorpo no receptor. Procedimento Técnico em TUBO: SALINA/ALBUMINA/AGH 1. Lavar 200 ul de hemácias do doador 03 vezes com soro fisiológico 2. Preparar a suspensão de hemácias do doador a 3-5% (Salina) 3. Suspensão Hemácias 1 ml soro fisiológico + 75 ul hemácias do doador Versão atual: 06 Código: PPT 6 paginação: 20 de 39