RESUMO A intolerância à lactose é a mais comum a um hidrato de carbono e pode afectar pessoas de todos os grupos etários, apesar de ocorrer com mais frequência em idades avançadas. A intolerância à lactose é causada pela deficiência em lactase (β-galactosidase), a enzima que digere o açúcar do leite, a lactose. Neste trabalho pretendeu-se estudar a enzima β-galactosidase, proveniente de Kluyveromyces lactis, sob diferentes formas e em diferentes condições experimentais, através da variação da concentração de enzima, concentração de substrato padrão, o-nitrofenol-β-ᴅ-galactoside, e da variação temperatura. Foram depois realizados ensaios na matriz alimentar, o leite, uma vez que o ph óptimo desta enzima, 6,8, é semelhante ao ph do leite. Para tal, foi utilizada a enzima Lactozym 2600L, disponibilizada comercialmente pela Sigma-Aldrich sob a forma de suspensão líquida e a enzima imibond galactosidase SPRIN, disponibilizada comercialmente de forma imobilizada numa resina amino-acrílica pela SPRIN Tecnhologies. Foi também realizada a imobilização da enzima Lactozym 2600L em suporte de alginato de cálcio. De todas as formas enzimáticas testadas, a imibond galactosidase SPRIN foi a que apresentou melhores resultados, nomeadamente a nível da estabilidade operacional nos ensaios de reutilização. No final foram utilizados os valores optimizados na matriz alimentar, o leite, de modo a testar a actividade hidrolítica da enzima sobre a lactose, não se conseguindo obter um grande rendimento de conversão nesta reacção, sugerindo a necessidade da realização de mais estudos e ensaios nesta promissora área da biotecnologia. I
ABSTRACT Lactose intolerance is the most common one carbohydrate and can affect people of all age groups, although occur more frequently in elderly persons. Lactose intolerance is caused by a deficiency of lactase (β-galactosidase), the enzyme that digests the milk sugar lactose. This work aimed the study of the enzyme β-galactosidase, obtained from Kluyveromyces lactis in different forms and in different experimental conditions, by varying the enzyme concentration, standard substrate concentration, o-nitrophenol-β-ᴅ-galactoside, and temperature variation. Assays were then performed in the food matrix, milk, since the ph optimum of this enzyme, 6.8, is similar to ph of milk. To do this, the enzyme used was Lactozym 2600L, commercially available from Sigma-Aldrich in the form of liquid suspension and enzyme imibond galactosidase SPRIN, available commercially immobilized on an aminoacrylic resin by SPRIN Tecnhologies. It was also performed immobilization of de the enzyme Lactozym 2600L in a calcium alginate support. Of all the enzyme forms tested, the imibond galactosidase SPRIN showed the best results, particularly in terms of operational stability in the reuse assays. At the end, values optimized were used in the food matrix, milk, in order to test the hydrolytic activity of the enzyme on the lactose, but was not possible to obtain a high conversion yield, suggesting a need for further studies and tests on this promising area of biotechnology. II
AGRADECIMENTOS À Professora Doutora Maria Henriques Ribeiro, a minha Orientadora, pela supervisão, orientação, compreensão, simpatia, disponibilidade e apoio prestado ao longo destes meses. À Professora Doutora Matilde Castro, Coordenadora do Mestrado em Controlo de Qualidade e Toxicologia dos Alimentos, da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, a quem agradeço a organização de mais uma edição deste mestrado. A todos os docentes desta edição do Mestrado em Controlo da Qualidade e Toxicologia dos Alimentos, pelos conhecimentos transmitidos durante a parte curricular do mesmo. Ao Mário Nunes e à Isabel Ribeiro, pelas opiniões e conselhos práticos, pela simpatia e disponibilidade expressas durante este trabalho. À D. Maria do Carmo, pela atenção dispensada e prontidão demonstrada em relação ao material de laboratório. À minha família (mãe, avó, pai Mário, Bruno, Renata, Rafaela, Marcela, Sérgio, Nuno, Alice, Maria, Anita, Miguel, Zeca, Margarida, Francisca, Carlota, Afonso, Nino e Leonardo) por toda a compreensão e encorajamento e em especial ao meu namorado, José Jorge, pelo apoio incondicional, pelo incentivo e disponibilidade e por toda a paciência e carinho demonstrados ao longo destes meses. A todos os meus amigos, Marina, Clarisse, Charlotte, Sérgio, pela troca de ideias e opiniões e pelo animo transmitido ao longo deste mestrado, e em especial à Ana por tudo isto e pela sua inestimável companhia durante as longas horas passadas no laboratório. III
Índice Resumo... I Abstract... II Agradecimentos... III Índice... IV Índice de Figuras... VIII Índice de Tabelas... IX Indice de Gráficos... XI 1. INTRODUÇÃO E OBJECTIVOS... 1 1.1. Lactose... 1 1.2. Intolerância à lactose... 4 1.3. β-galactosidase... 7 1.3.1. Fontes microbianas da enzima... 8 1.3.1.1. Enzimas Bacterianas... 8 1.3.1.2. Enzimas de Fungos... 9 1.3.1.3. Enzimas de Leveduras... 9 1.3.2. Aplicação Industrial... 13 1.4. Métodos de Imobilização Enzimática... 13 1.4.1. Adsorção física... 14 1.4.2. A Encapsulação... 15 1.4.3. Ligação Covalente... 16 1.5. Cinética Enzimática... 17 1.5.1. Inibição Enzimática... 21 1.6. Objectivos... 22 2. MATERIAIS E MÉTODOS... 23 2.1. Reagentes... 23 2.2. Enzimas... 23 IV
2.3. Equipamentos... 24 2.4. Preparação de soluções... 25 2.5. Métodos analíticos... 29 2.5.1. Ensaio para a quantificação de açucares redutores: Método DNS... 29 2.5.1.1. Técnica... 29 2.5.2. Método de Bradford para determinação da proteína... 30 2.5.2.1. Técnica... 31 2.5.3. Doseamento da hidrólise enzimática de o-npg: método colorimétrico... 32 2.5.3.1. Curva de calibração de o-np... 34 2.5.4. Kit Glucose-Oxidase Sigma-Aldrich para determinação da glucose... 35 2.5.4.1. Técnica... 36 2.6. Métodos experimentais... 37 2.6.1 Imobilização... 37 2.6.1.1. Técnica... 38 2.6.2. Avaliação da Influência da Concentração de Enzima... 39 2.6.2.1. Técnica... 39 2.6.3. Avaliação da Influência da Concentração de Substrato 40 2.6.3.1. Técnica... 40 2.6.4. Estudo do Efeito da Temperatura... 42 2.6.4.1. Técnica... 42 2.6.5. Ensaios de Reutilização... 43 2.6.5.1. Técnica... 43 2.6.6. Ensaios de Bioconversão da lactose em leite... 44 2.6.6.1. Técnica... 44 2.6.6.2. Delineamento Experimental para modelação da Bioconversão da Lactose... 45 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 48 3.1. Ensaios com a Enzima Sóluvel Lactozym 2600L... 48 3.1.1. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Enzima... 48 3.1.2. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Substrato... 51 3.1.3. Estudo do Efeito da Variação da Temperatura... 53 V
3.2. Ensaios com a enzima imibond galactosidase SPRIN... 57 3.2.1. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Enzima... 57 3.2.2. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Substrato... 59 3.2.3. Estudo do Efeito da Variação da Temperatura... 62 3.2.4. Estudo da actividade enzimática durante o processo em contínuo... 64 3.3. Ensaios com a enzima imobilizada em esferas de Alginato de Cálcio... 67 3.3.1. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Enzima... 68 3.3.2. Estudo do Efeito da Variação da Concentração de Substrato... 69 3.3.3. Estudo do Efeito da Variação da Temperatura... 72 3.3.4. Estudo da actividade enzimática durante o processo em continuo... 73 3.4. Comparação da β-galactosidase livre, imibond galactosidase SPRIN e enzima imobilizada em alginato de cálcio... 77 3.5. Ensaios de Bioconversão na Matriz Alimentar: Leite... 78 3.5.1. Optimização da bioconversão em leite pela Metodologia das Superfícies de Resposta... 81 4. CONCLUSÃO... 88 5. BIBLIOGRAFIA... 90 ANEXOS Anexo I. Cálculos para a Preparação de Solução Tampão de Fosfato de Potássio 0,1 M, p.h. 6,8 Anexo II. Cálculos para Preparação de Solução Tampão de Tris-HCl 0,1 M, p.h. 7,0 Anexo III. Cálculos para Preparação das soluções padrão de o-np VI
Anexo IV. Cálculos para Preparação das soluções padrão de Lactozym 2600 L para o ensaio de Bradford Anexo V. Cálculo para a Preparação das diluições de Lactozym 2600 L utilizadas paras os ensaios com enzima livre Anexo VI. Cálculos para a Preparação de Solução de Ácido Sulfúrico 12N Anexo VII. Cálculo para a Preparação das soluções padrão de glucose VII
Índice de Figuras Figura 1. Molécula de lactose... 2 Figura 2. Hidrólise da lactose em glucose e galactose... 7 Figura 3. β-galactosidase... 8 Figura 4. Esquema dos vários métodos de imobilização... 16 Figura 5. Redução do reagente 3,5-dinitrosalicilato... 29 Figura 6. Reacção de hidrólise do o-npg pela β-galactosidase... 34 Figura 7. Esquema da reacção de determinação da glucose pelo teste da glucose/oxidase... 35 Figura 8. Esferas de alginato de cálcio (2%)... 39 VIII
Índice de Tabelas Tabela 1. Percentagem de lactose em leite e derivados... 2 Tabela 2. Valores nutricionais de lacticínios por 100 g de parte edível... 6 Tabela 3. Fontes microbianas de β-galactosidase... 10 Tabela 4. Quantidades de leite e de preparações enzimáticas utilizadas nos ensaios... 36 Tabela 5. Valores experimentais das duas variáveis testadas em simultâneo e respectivos níveis codificados por aplicação do CCRD... 47 Tabela 6. Constantes cinéticas... 77 Tabela 7. Teores de Hidratos de Carbono e Lactose no leite (tabela) e valores de glucose doseados em ensaio... 79 Tabela 8. Valores de actividade enzimática das diferentes enzimas a 20 e a 37 C ; e valores de glucose das amostras de leite aos 180 minutos de ensaio a 20 e a 37 C... 80 Tabela 9. Efeito da concentração de imibond galactosidase SPRIN, da temperatura e do tempo na bioconversão da lactose em glucose no leite... 82 Tabela 10. Equações dos modelos das superfícies de resposta, ajustados aos resultados experimentais obtidos em leite na bioconversão da lactose em glucose (mg/ml) por acção da imibond galactosidase SPRIN [Gal] em função da concentração de enzima (mg/ml), da temperatura (T) ( C) e do tempo (t) (min) e respectivos R 2 e R 2 ajustado... 87 IX
Tabela A-I. Resumo dos valores obtidos nos cálculos necessários para a realização das soluções padrão de o-np Tabela A-II. Resumo dos valores obtidos nos cálculos necessários para a realização das soluções padrão de proteína Tabela A-III. Resumo dos valores obtidos nos cálculos necessários para a realização das diluições de Lactozym 2600 L Tabela A-IV. Resumo dos valores obtidos nos cálculos necessários para a realização das soluções padrão de glucose. X
Índice de Gráficos Gráfico 1. Curva de Calibração da glucose (Método DNS)... 30 Gráfico 2. Curva de Calibração de proteína (Método Bradford)... 32 Gráfico 3. Curva de Calibração de o-np... 34 Gráfico 4. Efeito da variação da concentração de enzima livre ao longo do tempo... 49 Gráfico 5. Efeito da variação da concentração de enzima livre na actividade enzimática... 50 Gráfico 6. Efeito da variação da concentração de substrato na enzima livre... 51 Gráfico 7. Actividade enzimática da enzima livre às diferentes concentrações de substrato... 52 Gráfico 8. Efeito da variação da temperatura na enzima livre... 54 Gráfico 9. Actividade enzimática da enzima livre a diferentes temperaturas... 56 Gráfico 10. Efeito da variação da concentração de enzima SPRIN... 58 Gráfico 11. Actividade enzimática da enzima SPRIN às diferentes concentrações de enzima... 59 Gráfico 12. Efeito da Variação da Concentração de Substrato na enzima SPRIN... 60 Gráfico 13. Actividade enzimática da enzima SPRIN às diferentes concentrações de substrato... 60 Gráfico 14. Efeito da variação da temperatura na enzima SPRIN... 62 Gráfico 15. Actividade enzimática da enzima SPRIN a diferentes temperaturas... 63 Gráfico 16. Reutilizações da enzima SPRIN... 64 XI
Gráfico 17.Actividade enzimática da enzima SPRIN em cada reutilização... 65 Gráfico 18. Actividade Residual da enzima SPRIN ao longo do tempo... 65 Gráfico 19. Efeito da variação da concentração de enzima imobilizada em alginato de cálcio... 68 Gráfico 20. Actividade enzimática da enzima imobilizada em alginato de cálcio a várias concentrações... 69 Gráfico 21. Efeito da Variação da Concentração de Substrato na enzima imobilizada em alginato de cálcio... 70 Gráfico 22. Actividade enzimática da enzima imobilizada em alginato de cálcio às diferentes concentrações de substrato... 70 Gráfico 23. Efeito da variação da temperatura na enzima imobilizada em alginato de cálcio... 72 Gráfico 24. Actividade enzimática da enzima imobilizada em alginato de cálcio a diferentes temperaturas... 73 Gráfico 25. Reutilizações da enzima imobilizada em alginato de cálcio (2%)... 74 Gráfico 26. Actividade enzimática da enzima imobilizada em alginato de cálcio (2%) em cada reutilização... 75 Gráfico 27. Actividade residual da enzima imobilizada em alginato de cálcio (2%) em cada reutilização... 76 Gráfico 28. Superfície de resposta ajustada à formação de glucose como função da temperatura e do tempo em leite, com uma concentração de imibond galactosidase SPRIN de 8 mg/ml... 83 Gráfico 29. Superfície de resposta ajustada à formação de glucose como função do tempo e da concentração em leite à temperatura de 30 C... 84 XII
Gráfico 30. Superfície de resposta ajustada à formação de glucose como função da temperatura e da concentração de imibond galactosidase SPRIN em leite ao fim de 30 min... 86 XIII