ÁGUA DE COCO EM PÓ EM BIOTÉCNICAS DA REPRODUÇÃO DE CAPRINOS (Powdered coconut water in biotechnologies of reproduction in goats) Cristiane Clemente de Mello SALGUEIRO 1, José Ferreira NUNES 2 1 Universidade Potiguar (UnP) 2 Universidade Estadual do Ceará (UECE) *E-mail: crismello@pq.cnpq.br RESUMO O uso de biotecnologias reprodutivas objetiva a obtenção do melhoramento genético dos animais de interesse econômico. A utilização dessas biotecnologias, como o uso de diluentes seminais associados a processos de preservação por refrigeração ou congelação, seguidos de inseminação artificial, visa aumentar o número de animais disponíveis para seleção, diminuindo o intervalo entre gerações e obtendo-se ganho genético pelo aumento da eficiência reprodutiva de machos e fêmeas caprinas. Dentre os diluentes seminais, estudos vêm sendo realizados com o uso da água de coco in natura desde a década de 80 e, mais recentemente, com a água de coco em pó desde 2002, apresentando resultados satisfatórios quanto à preservação espermática. Palavras-chave: Biotecnologia; Reprodução; Caprinos; Água de coco em pó ABSTRACT The use of reproductive biotechnologies search breeding of animals of economic interest. The use of these biotechnologies, such as the use of sperm extenders associated with the processes of preservation by cooling or freezing, followed by artificial insemination, aimed to increasing the number of animals available for selection, reducing the generation interval and obtaining genetic gain by increasing reproductive performance of bucks and dams. Among the sperm extenders, studies are being conducted with the use of fresh coconut water since the 80 s and, more recently, with 27 a 29 de junho de 2012. 20
the powdered coconut water since 2002, with satisfactory results related to sperm preservation. Key words: Biotechnology; Reproduction; Goats; Powdered coconut water INTRODUÇÃO O uso de biotecnologias reprodutivas objetiva a obtenção do melhoramento genético dos animais de interesse econômico, buscando atingir três objetivos fundamentais: o aumento do número de animais disponíveis para a seleção e, por consequência, a diminuição do intervalo de geração, e a obtenção de ganho genético, o que se dá pelo aumento da eficiência reprodutiva de machos e fêmeas (Martins Filho & Martins, 2010). A geração de tecnologias e sua transferência ao setor produtivo ainda não conseguiu modificar o perfil da cadeia produtiva de caprinos no Brasil. A dispersão das tecnologias, assim como da própria cadeia produtiva, e a falta de recursos humanos qualificados em todos os níveis, parece ser o maior problema que enfrentamos. A falta de um modelo produtivo para a região, estratificado para a produção de carne, leite e pele através da utilização de tecnologias aplicadas, junto com a eleição de raças mais adequadas aos propósitos regionais, poderá solucionar o problema. A introdução de normas de manejo tecnificado nos sistemas de produção, assim como um programa de melhoramento genético que vá de encontro às necessidades dos produtores da região, deverá receber toda a prioridade. A criopreservação de sêmen e embriões de animais geneticamente superiores poderá, através do trabalho de controle zootécnico, inseminação artificial (IA) e transferência de embriões, aumentar a produtividade ponderal e numérica dos rebanhos. Para tanto, apresentaremos a seguir algumas das biotécnicas da reprodução que podem ser aplicadas à criação de caprinos. Refrigeração seminal O fundamento da refrigeração do sêmen é prolongar a capacidade de fertilização dos espermatozoides ao reduzir ou deter sua motilidade e suas reações metabólicas. O 27 a 29 de junho de 2012. 21
método de conservação por refrigeração consiste em refrigerar o sêmen diluído dos 30 ºC aos 15 ºC ou, com maior frequência, aos 5 ºC. Deve-se evitar a rápida queda de temperatura entre 18 ºC a 5 ºC, pois, nessa faixa de temperatura, os espermatozoides são mais sensíveis ao choque térmico. O choque térmico causa perda irreversível da motilidade, da atividade metabólica e da capacidade de fertilização, o que resulta em alterações na membrana espermática (Maxwell & Evans, 1990). A velocidade de refrigeração do sêmen deve estar entre 0.25 e 0.35 ºC/min até alcançar a temperatura de 5 ºC, mantendo, desta maneira, a motilidade dos espermatozoides em baixos níveis por algumas horas ou dias (Machado & Simplício, 1995). O sêmen caprino diluído em leite e refrigerado a 15 ºC mantém sua viabilidade até 12 horas quando refrigerado a 5 ºC, podendo manter um nível aceitável de fertilidade até 48 horas (Evans & Maxwell, 1987). A refrigeração do sêmen de caprino a 4 ºC utilizando diluentes à base de água de coco tem mostrado bons resultados. Nunes & Silva (1984) demonstraram que o sêmen de caprinos da raça Anglo Nubiana diluído em água de coco e refrigerado a 4 ºC era viável por um período de 10-12 horas. Nunes & Salgueiro (1999) observaram que o sêmen de animais da raça Saanen diluído em água de coco e refrigerado a 4 ºC manteve-se viável durante 48 horas e com qualidade superior ao sêmen dos mesmos animais refrigerado em diluente à base de leite desnatado. Os testes de determinação da qualidade de movimento e de porcentagem de espermatozoides móveis às 2, 4, 6, 8 e 24 horas de incubação a 15 ºC mostraram valores mais altos nos espermatozoides conservados em diluente à base de água de coco que nos diluídos em leite desnatado (Nunes et al., 1994). Utilizando diluente à base de água de coco e refrigerado a 4 ºC, Oliveira et al. (1996) alcançaram 50% de fertilidade em cabras da raça Saanen e nativas através de IA. A adição de glicerol ao sêmen diluído em água de coco-gema não afeta a cinética dos espermatozoides. Assim, em cabras nativas inseminadas com sêmen refrigerado da raça Saanen, diluído em água de coco-gema-glicerol, obtiveram-se taxas de fertilidade de 41,29% e 54% para o sêmen conservado em refrigeração durante 12 e 24 horas, respectivamente (Figueirêdo et al., 2002). 27 a 29 de junho de 2012. 22
Congelação seminal Segundo Hunter (1982), para congelar o sêmen e poder usá-lo posteriormente com bons resultados, é necessário se ter em conta uma série de fatores chave: o diluente e a concentração de células; o agente crioprotetor adequado e sua concentração no meio; o tempo e a temperatura de equilíbrio; a natureza da curva de congelação; a natureza da curva de descongelação; a utilização de um procedimento específico de descongelação; a maneira de se eliminar o agente crioprotetor (diluição ou diálise). De acordo com Hopkins & Evans (1991), a sensibilidade dos espermatozoides às mudanças de temperatura é determinada pela ação protetora do plasma seminal e pela integridade da membrana espermática. Sendo que a última depende ainda da composição básica dos lipídios/proteínas e da proporção colesterol/fosfolipídios presente na mesma. A congelação do sêmen em caprinos têm além dos problemas comuns às outras espécies, como a formação de cristais de gelo e aumento da concentração intra e extracelular de solutos, características ou particularidades na composição de seu plasma seminal, como a presença de fosfolipases produzidas pelas glândulas bulbouretrais (Mateos-Rex & Aguilar, 1996). Quando o sêmen é congelado sem a eliminação do plasma seminal (não-lavado), os ejaculados recém colhidos podem ser diluídos pela adição de um meio que contenha glicerol a 30 C (uma fase), refrigerados em 1-1,5 horas para chegar a 4-5 C e congelados sem tempo de equilíbrio (Ritar et al., 1990). Alternativamente, a diluição do sêmen não-lavado pode ser realizada em duas fases, a primeira depois da colheita (30 ºC) com um diluente que não contenha glicerol, e a segunda depois da refrigeração (4-5 C) com um diluente que contenha glicerol, seguido de um tempo de equilíbrio de 1,5 horas antes da congelação. Qualquer que seja o método utilizado para a congelação, são observadas diferenças entre os indivíduos com relação à congelabilidade e à capacidade fertilizante do sêmen (Corteel et al., 1987). Na atualidade, na congelação de sêmen caprino, são utilizadas palhetas francesas de 0,25 ml ou 0,50 ml. Esta técnica consiste colocar as palhetas com sêmen, durante cinco minutos, a 3 cm de distância dos vapores de nitrogênio líquido (NL) a uma 27 a 29 de junho de 2012. 23
temperatura de -60 ºC, submergindo-as na sequência em NL e armazenando-as em botijões de NL (-196 ºC) (Vázquez, 1993). Independentemente do método utilizado, deve-se levar em consideração que a velocidade de congelação deve ser rápida suficiente para prevenir a formação de cristais de gelo intracelulares e lenta suficiente para prevenir a perda de conteúdo intracelular. De acordo com Maxwell & Evans (1990), o sêmen deve ser descongelado tão rápido quanto foi a congelação para permitir uma rápida recuperação espermática. Deve também ser levado em conta que o sêmen congelado se deteriora rapidamente após a descongelação, então a descongelação deve ser realizada próxima ao momento da IA (Hunter, 1982). Além de facilitar o emprego da IA, o sêmen congelado também permite ser armazenamento e transportado entre propriedades e a utilização de bodes em um número maior de fêmeas do que seria obtido em condições naturais de acasalamento (Xavier et al., 2009). Apesar dessas vantagens, ainda existem limitações ao uso de sêmen congelado, bem como dificuldades na sua implementação devido à capacidade fertilizante do sêmen congelado ser menor comparada à obtida com o sêmen fresco (Salamon & Maxwell, 1995). Diluentes seminais Hafez (1995) sugere que um bom diluente deve: proporcionar nutrientes como fonte de energia; proteger os espermatozoides dos efeitos deletérios do frio; proporcionar um meio tampão; manter a pressão osmótica adequada; inibir o crescimento bacteriano; aumentar o volume do ejaculado; e proteger as células espermáticas durante a congelação. Os diluentes diferem em sua composição dependendo da espécie animal, da utilidade que se dará ao sêmen, da temperatura e do tempo no qual o mesmo será conservado diluído (Hopkins & Evans, 1991). A capacidade tamponante de um diluente tem grande importância para o sêmen caprino. Por isso, é necessário manter o ph entre 6.2 e 6.8 (Martín & Alfonso, 1985). Vázquez et al. (1989) consideram que a pressão osmótica dos diluentes de sêmen 27 a 29 de junho de 2012. 24
caprino deve estar entre 300 e 330 mosm/kg H 2 O. Para inibir o crescimento de microrganismos no sêmen, é adicionada penicilina, estreptomicina, gentamicina, polimixina B ou outra combinação de antibióticos de amplo espectro para controlar os vários tipos de micróbios encontrados (Hafez, 1995). Normalmente são utilizados dois tipos de diluente, de refrigeração e de congelação. O diluente de refrigeração não contém glicerol já que este, em temperatura ambiente, é muito tóxico para os espermatozoides. O glicerol, assim como o etilenoglicol, são crioprotetores penetrantes que atuam reduzindo os dados celulares, prevenindo os efeitos deletérios do choque térmico (Vishwanath & Sahnnon, 2000). A concentração do glicerol usada por diferentes pesquisadores varia de 3% a 9%, preferencialmente de 4-7% no sêmen diluído. No método de Corteel (1987), o leite desnatado com 14% de glicerol é adicionado a 4 C em três passos, com intervalo de 10 minutos, resultando em uma concentração final de glicerol de 7% e uma concentração espermática de 400 a 500 x 10 6 espermatozoides por ml. No método de Ritar & Salamon (1982) o diluente à base de TRIS com glicerol é adicionado ao sêmen não-lavado em um passo a 30 ºC, sendo a concentração final de glicerol e gema de ovo de 4% e 20%, respectivamente, no sêmen diluído (Evans & Maxwell, 1987). A adição de glicerol a 5 ºC não apresentou vantagens sobre a adição a 30 ºC (Tuli & Holtz, 1994). Diluentes seminais alternativos a água de coco em pó A busca por produtos naturais, exclusivamente de origem vegetal, com baixo risco de transmissão de doenças e capacidade de incrementar a viabilidade espermática levou os pesquisadores a buscarem um diluente alternativo para a criopreservação espermática. Dentre eles, a água de coco tem sido usada desde os anos 80 e 90, principalmente na conservação de células espermáticas. Os primeiros resultados obtidos com a água de coco in natura levaram os pesquisadores a aprofundarem os estudos no sentido de padronizá-la e estabilizá-la na forma de pó (ACP), para que a mesma, em não perdendo suas características físicoquímicas, tivesse seu uso simplificado, podendo representar uma alternativa para a difusão de várias biotecnologias, fato alcançado no início de 2002. 27 a 29 de junho de 2012. 25
No que diz respeito às inovações biotecnológicas, a água de coco tem sido utilizada em várias biotecnologias relacionadas à reprodução animal. Excelentes resultados têm sido obtidos com o uso da água de coco em estudos de preservação seminal em animais domésticos como caprinos, ovinos, bovinos, bufalinos, suínos, caninos, equinos, coelhos, galos, felídeos, peixes de água doce como tambaqui, carpa, pirapitinga, além de animais silvestres como o macaco-prego. O uso de diluentes pobres em fosfolipídios na biotecnologia de criopreservação do sêmen caprino suprime o processo de lavagem ao qual o sêmen era submetido antes da diluição nos meios convencionais (Machado, 1991). As vantagens incluem não somente o fato de ser um produto natural de origem vegetal, como aumentar a viabilidade a 4 ºC por até 48 horas e a motilidade pósdescongelação, permitindo seu uso em IA por via cervical com taxas que superam as atualmente praticadas. Inseminação artificial Para que a reprodução seja econômica e competitiva, a única forma de aumentar a produtividade é não perder de vista a rentabilidade. Isso requer uma revisão dos conceitos obsoletos e um novo enfoque para programas de desenvolvimento reprodutivo, como a inseminação artificial em tempo fixo (IATF), que está direcionando os esforços dos criadores tanto para ganhos qualitativos (genéticos) como quantitativos (número de crias nascidas). A IA é uma das técnicas mais simples e de baixo custo empregada na área da reprodução animal e a que apresenta o melhor resultado quando se deseja realizar a seleção e o melhoramento genético de um rebanho em seu conjunto. O melhoramento genético é obtido através da utilização do sêmen de reprodutores de comprovado valor zootécnico e de seu uso em rebanhos selecionados através do processo de IA. Apesar de sua simplicidade, a IA requer um controle cuidadoso e rigoroso das distintas etapas, desde a seleção do reprodutor doador de sêmen, passando pelo processamento tecnológico deste, seleção e controle do rebanho, até o treinamento do inseminador. Com a IATF, toda a reprodução fica sobre o controle do produtor. Através desta técnica, as matrizes tratadas são inseminadas em um momento determinado, sem a 27 a 29 de junho de 2012. 26
necessidade de se observar os cios. Portanto, o produtor pode inseminar mais matrizes em menos tempo, programar a inseminação e o nascimento das crias, aumentar o número de produtos nascidos de IA no começo da estação de parição e obter um melhor aproveitamento de mão de obra. Resultados da utilização do diluente à base de água de coco em caprinos Os primeiros estudos utilizando a agua de coco como diluente para sêmen caprino foram realizados por Nunes (1986) na cidade de Maceió, Alagoas, de setembro de 1985 a dezembro de 1987. Após duas horas de incubação a 37 ºC foi observado que tanto o vigor espermático (VE) como a porcentagem de espermatozoides móveis (PEM) foi maior quando o sêmen foi diluído em uma solução à base de agua de coco que quando foi diluído em leite desnatado (Tab. 1). Tabela 1: Avaliação in vitro a 37 ºC da porcentagem de espermatozoides móveis (PEM) e da motilidade individual progressiva (MIP) do sêmen caprino diluído em água de coco ou leite (Adaptado de Nunes, 1986) Tempo de Incubação (minutos) Água de coco (PEM e MIP) Leite (PEM e MIP) 5 80 4.50 80 4.00 30 80 4.50 70 4.00 60 75 4.50 70 3.50 90 70 4.50 60 3.00 120 70 4.50 60 3.00 A motilidade individual progressiva dos espermatozoides diluídos em água de coco permanece elevada desde o início da incubação até o final da mesma, duas horas depois, enquanto que no leite-glicose há uma degradação da motilidade de 25%, podendo esta perda comprometer a qualidade do sêmen (Nunes & Salgueiro, 1999). Foram obtidos resultados similares quando se utilizou a água de coco ou leite na 27 a 29 de junho de 2012. 27
diluição e refrigeração do sêmen a 4 C (Tab. 2) e em seu uso na inseminação artificial de cabras que tiveram seus estros sincronizados através de hormônios (Tab. 3). Tabela 2: Avaliação in vitro a 37º C da porcentagem de espermatozoides móveis (PEM) e da motilidade individual progressiva (MIP) do sêmen caprino diluído em água de coco ou leite e conservado por 48 horas a 4 ºC (Adaptado de Nunes, 1986) Tempo de Incubação a 4 ºC (horas) Água de coco (PEM e MIP) Leite (PEM e MIP) 6 80 4.00 70 3.00 12 70 4.00 60 3.00 24 60 3.00 30 2.00 36 45 3.00 10 1.00 48 30 2.50 05 0.50 Tabela 3: Fertilidade de cabras inseminadas com sêmen caprino diluído em água de coco ou leite (Adaptado de Nunes, 1986) Parâmetros Água de coco Leite Fertilidade aos 60 dias (%) 88 (194) 85 (136) Taxa de parição (%) 68 (150) 60 (96) Taxa de prolificidade (%) 180* (266) 110** (105) Proporção de fêmeas (%) 72 (194) 43 (45) Proporção de machos (%) 28 (72) 57 (60) ( ) Número de cabras ou crias; *P < 0,05. Com o uso da inseminação artificial com sêmen caprino diluído em água de coco e refrigerado a 4 ºC foram obtidas taxas de parição acima de 60% (Tab. 4). Alguns dados de inseminação artificial de cabras com o uso de sêmen diluído em água de coco são apresentados nas tabelas 5-7 a seguir. 27 a 29 de junho de 2012. 28
Tabela 4: Eficiência reprodutiva de cabras sem padrão racial definido, Saanen e Marota inseminadas artificialmente com sêmen diluído em água de coco e refrigerado a 4 ºC (Adaptado de Nunes, 1986) Parâmetros 1º ano 2º ano 3º ano Fertilidade baseada no não retorno ao estro (%) 82 87 85 Taxa de parição (%) 63 72 73 Prolificidade 1.83 1.78 1.00 Proporção de machos (%) 28 (26) 30 (79) 27 (21) ( ) Número de crias. Tabela 5: Fertilidade e prolificidade de cabras inseminadas com sêmen diluído e congelado em água de coco in natura (ACIN) e TRIS Parâmetro ACIN TRIS Fertilidade (%) 47,69 (65) 40,63 (64) Prolificidade 1.80 [56] 1.77 [46] ( ) número de cabras inseminadas; [ ] número de crias nascidas (Salgueiro, 2003). Tabela 6: Fertilidade de cabras inseminadas com sêmen diluído em água de coco in natura (ACIN) ou em pó (ACP-101) Parâmetro ACIN ACP-101 Taxa de concepção aos 17 dias 63,33 (11) 88,89 (09) ( ) número de cabras inseminadas (Salgueiro et al., 2002). Tabela 7: Fertilidade de cabras inseminadas com sêmen diluído e congelado em água de coco em pó (ACP-101c) Parâmetro Total Prenhez Taxa de fertilidade aos 30 dias 37 18 (48,64%) Nunes et al. (2010). 27 a 29 de junho de 2012. 29
CONSIDERAÇÕES FINAIS Com o conhecimento dos mecanismos fisiológicos da reprodução é possível se realizar um planejamento adequado do manejo reprodutivo do rebanho. Uma vez que as fêmeas de raças tropicais apresentam atividade reprodutiva durante todo o ano, e que os machos produzem uma quantidade extraordinária de espermatozoides durante todo o ano, sugere-se o uso de biotécnicas, como a IA, que objetivem maximizar a eficiência reprodutiva. Obviamente que o êxito do uso dessas ferramentas para o melhoramento genético depende do manejo geral, em particular da nutrição e sanidade do rebanho. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CORTEEL, J. M.; BARIL, G.; LEBOEUF, B. Development and application of artificial insemination with deep frozen semen and out-of season breeding of goats in France. In: INTERNATIONAL CONFERENCE ON GOATS, 4, 1987, Anais... Brasília, 1987, v. 1, p. 523-547. EVANS, G.; MAXWELL, W. M. C. Salamon s Artificial Insemination of Sheep and Goats. London: Butterworth. 1987. 194p. FIGUEIRÊDO, E. L.; NUNES, J. F.; MONTEIRO, A. W. U.; PINHEIRO, J. H. T.; CAMPOS, A. C. N.; SANTOS, R. R.; MEDEIROS, C. H. N. Fertilidade de cabras inseminadas artificialmente com sêmen refrigerado a 4 o C e conservado por até 24 horas. Rev. Bras. Reprod. Anim., v. 5, p. 118-120, 2002. HAFEZ, E. S. E. Reprodução Animal. 6 ed. São Paulo: Manole. 1995. 582 p. HOPKINS, S. M.; EVANS, L. E. In: MCDONALD, L. E. Endocrinología Veterinaria y Reproducción. 4 ed. México: Interamericana. 1991. HUNTER, R. H. F. Fisiología y tecnología de la reproducción de la hembra de los animales domésticos. Zaragoza: Acribia. 1982. MACHADO, R. Inseminación artificial con semen congelado en caprinos. Rev. Bras. Reprod. Anim., v. 3, p. 265-276, 1991. MACHADO, R.; SIMPLÍCIO, A. A. Inseminação artificial em caprinos no Brasil: estado atual. Rev. Bras. Reprod. Anim., v. 1, p. 61-72, 1995. MARTÍN, E. M.; ALFONSO, C. G. Fisiopatología de la reproducción con sus bases sinópticas. 1 ed. Zaragoza: Instituto Experimental de Cirugía y Reproducción de la Universidad de Zaragoza. 1985. 27 a 29 de junho de 2012. 30
MARTINS FILHO, R.; MARTINS, J. A. M. Biotecnologias reprodutivas aplicadas ao melhoramento genético animal. In: NUNES, J. F. Biotécnicas reprodutivas aplicadas aos pequenos ruminantes. Fortaleza: Tecnograf, 2010. p. 13-39. MATEOS-REX, E.; AGUILLAR, C. G. C. Técnicas de control de la reproducción en ganado caprino. In: Nuevas técnicas de reproducción asistida aplicadas a la producción animal. Colección Estudios. Cuenca: Ed. S. Pub. U. Castilla la Mancha. n. 32, cap. 9, p. 183-202, 1996. MAXWELL, W. M. C.; EVANS, G. Inseminación artificial de ovejas y cabras. Madrid: Acribia. 1990. NUNES, J. F.; SILVA, A. E. F. D. Tecnologia do sêmen resfriado em caprinos. Rev. Bras. Reprod. Anim., v. 8, n. 2, p. 121-127, 1984. NUNES, J. F. A inseminação artificial como método alternativo para o melhoramento da caprinocultura leiteira. In: SIMPÓSIO DA CAPRINOCULTURA DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, 1, 1986, Anais... Niterói-RJ, 1986. NUNES, J. F.; COMBARNOUS, Y.; PRISCILA, L. Utilisation d une substance ativa JYP presents dans l eau de coco pour la conservation in vitro et la fertilité dês spermatozoides de mammifers. S.I.: Sn. 1994. NUNES, J. F.; SALGUEIRO, C. C. M. Utilização da água de coco como diluente do sêmen de caprinos e ovinos. Rev. Cient. Prod. Anim., v. 1, n. 1, p. 17-46, 1999. OLIVEIRA, L.F.; AZEVEDO JÚNIOR, A. R.; TEIXEIRA, M. D. A.; ARAÚJO, A. A.; NUNES, J. F. Desempenho reprodutivo de cabras exóticas e SRD sincronizadas e inseminadas com sêmen refrigerado e diluído em água de coco. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE ZOOTECNIA, 35, 1996, Anais... Fortaleza, 1996. RITAR, A. J.; SALAMON, S. Effects of seminal plasma and of its removal and of egg yolk in the diluent and the survival of fresh and frozen spermatozoa of Angora goat. Aust. Jour. Biol. Sci., v. 35, p. 305-312, 1982. RITAR, A. J.; BALL, P. D.; O MAY, P. J. Examination of methods for the deep freezing of goat semen. Reprod. Fertil. Dev., v. 2, p. 27-34, 1990. SALAMON, S.; MAXWELL, W. M. C. Frozen storage of ram semen I. Processing, freezing, thawing and fertility after cervical insemination. Anim. Reprod. Sci., v. 37, p. 185-249, 1995. 27 a 29 de junho de 2012. 31
TULI, R. K.; HOLTZ, W. Effect of glycerolization procedure and removal of seminal plasma on post-thaw survival and got-release from Boer goat spermatozoa. Theriogenology, v. 42, p. 547-555, 1994. VÁZQUEZ, I.; CALDERÓN, F.; CASTILLO, M. Influencia de la presión osmótica de los diluyentes en la conservación del esperma refrigerado de morueco. In: JORNADAS INTERNACIONALES DE REPRODUCCIÓN ANIMAL, 4, 1989, Anais León, Espanha, 1989. VÁZQUEZ, I. Características morfológicas del semen. In: CURSO INTERNACIONAL DE REPRODUCCIÓN ANIMAL, 16, 1993, Anais Madrid, Espanha: CIT/INIA. VISHWANATH, R.; SAHNNON, P. Storage of bovine semen liquid and frozen state. Anim. Reprod. Sci., v. 62, p. 23-53, 2000. XAVIER, M. N.; MOUSTACAS, V. S.; CARVALHO JÚNIOR, C. A. Avaliação de diferentes antibióticos na inibição do crescimento de Brucella ovis em sêmen ovino congelado. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 18, 2009, Anais... Belo Horizonte: CBRA. 27 a 29 de junho de 2012. 32