Análise Genética da Cannabis sativa Rodrigo Soares de Moura-Neto Professor Associado Instituto de Biologia/UFRJ 02/09/2014 rodrigomouraneto@ufrj.br
Perspectiva Histórica da Tipagem por DNA SNPs 2014 STR desenvolvidos 1985 FSS Quadruplex 1990 1994 1996 1992 PCR desenvolvido RFLP Locais do CODIS definidos 1998 2000 Primeiros STR multiplexes fluorescentes Eletroforese Capilar Primeiros STRs descritos Identifiler 5-dye kit e ABI 3100 2002 2004 PowerPlex 16 Y-STRs Tipagem de STR por CE mtdna Multiplex STRs
Inventor do PCR "I think I might have been stupid, in some respects, if it weren't for my psychedelic experiences. -Kary Mullis, Ph.D., Nobel Prize Laureate, Chemistry, 1993
Tecnologia Atual Capilar Cheio com Solução de Polímero Eletroforese Capilar Janela de Leitura 50-100 m x 27 cm - + Rápida Separação do DNA Inlet (cathode) 5-20 kv Outlet (anode) Coleta de Dados e Análise
Sequenciamento de DNA
Desoxinucleotideo H
H Didesoxinucleotideo H
Mecanismo de Migração da Moléclua de DNA - DNA - DNA - DNA - DNA - DNA - + Separação de acordo com o tamanho e a forma de interação do DNA com o Polímero existente no interior do capilar
Janela de Leitura ABI 3100 Array Detection
ABI Prism 3100 Analizador Genético
Tipo de Analisador Genético (Sequenciador) AB Prism 3100 Genetic Analyzer
ABI Prism 3500 Analizador Genético
Mitocondria
Heavy (H) strand S2 L2 H ND5 ND4 ND4L R ND3 G Genoma Mitocondrial 16024 16365 1 73 340 HV1 cyt b E ND6 COIII Control region (D-loop) T ATP6 P ATP8 O H 1/16,569 K COII F S1 HV2 16024 576 Light (L) strand 16,569 bp 12S rrna O L D V Q A N C Y 16S rrna COI L1 ND1 I M ND2 W 9-bp deletion 22 trnas 2 rrnas 13 genes Coding Region
A B C D
2 1 1 2
B C A T T A A C T G 0 A G 2 A 0 A 0 C 0 G 0 A 0 = 2 B T G A A C T G 0 A C 1 A 0 G 1 C 0 T 2 G 1 = 5 C A T T A A C T G 0 A C 1 A 0 D G 1 C 0 T 2 G 1 = 5 D B A T T A A C T G 0 A C 1 A 0 C 2 C 0 T 2 A 0 = T G A A C T C A G C T G 0 A T T 0 G C 1 C 0 A 0 D A 0 C 2 C 1 C 0 C 0 T 2 T 0 A 0 = 5 C
Matriz de Informação Topologia A B C D A - B 2-1,5 1 1 A B C 5 5 - D 5 5 2-1,5 1 1 C D
A B C D
A Jornada Humana Out of Africa
Sistema de STR para Cannabis sativa
Eletroferograma de 05 Locais de STR em Cannabis sativa
O Sistema de STR permite a análise filogenética de evolução rápida e, portanto, recente.
Variação Genética por AFLP de Cannabis sp, em diferentes cidades americanas
Sistemas de evolução lenta,como haplótipos do DNA mitocondrial e do cloroplasto, permitem um estudo global da distribuição da Cannabis sp.
Cloroplasto
Genoma do Cloroplasto
Haplótipo de mtdna de Cannabis sativa
Distribuição dos Haplótipos de mtdna de Cannabis sativa
Identificação e Caracterização Molecular da Cannabis sativa através do Perfil de DNA: Barcoding como Ferramenta de Inteligência Policial no Estado do Rio de Janeiro
Cannabis sativa é a droga ilícita mais consumida no mundo e há uma grande dificuldade em identificar e individualizar as amostras de Cannabis sp. Por isso, técnicas genéticas estão cada vez mais sendo adotadas para a sua identificação. DNA Barcoding é uma região curta e padronizada que contém suficiente variabilidade entre as espécies; é curta o suficiente para ser sequenciada em uma única reação; e contém regiões conservadas para o desenvolvimento de iniciadores universais.
Teste colorimétrico para detecção de canabinóides pelo método de Duquenois-Levine. (A) Passo1: Adição do reagente de Duquenois na amostra, (B) Passo 2: Adição de ácido clorídrico, (C) Passo 3: Adição de clorofórmio. Amostras com canabinóides tornam-se roxas com a adiição do reagente de do ácido clorídrico. Com o clorofórmio, o roxo passa para a camada orgânica, indicando a presença da substância (DEA - Lab Processes).
Cromatografia em camada delgada (TLC) para detecção de diferentes compostos, extratos vegetais, etc.
Objetivos Desenvolver e validar técnicas de identificação genética da Cannabis sativa; Testar o desempenho do gene de rbcl para identificação da espécie; Encontrar haplótipos em Cannabis sativa, apreendidas no Estado do Rio de Janeiro.
Material e Métodos Material genético extraído com o kit DNeasy Plant Mini (Qiagen); Iniciadores universais do gene de rbcl : ESrbcL628F e ESrbcL1361R; Amplificação de uma região de 733 pb;
Material e Métodos Sequenciamento por BigDye Terminator v 3.1 (Life Technologies); eletroforese no 3500HID, usando Data Collection e Sequencing Analysis (Applied Biosystems); Análise dos dados nos programas Geneious e Mega 5.1.
Regiões das apreensões das amostras de C. sativa
Amostras de C. sativa ICCE/PCERJ IPPGF/PCERJ DNA LabFor/UFRJ.
Amostras de maconha cedidas pela PCERJ
DNA Genômino 1 2 3 DNA Amplificado M 1 2 trnl-trnf (cpdna)
Eletroforese em gel de agarose 1,5% de uma aliquota dos produtos da amplificação do gene rbcl
Iniciadores utilizados na reação de amplificação (PCR) Nome Sequência do Iniciador GenBank Tamanho ESrbcL628F F: CCATTYATGCGTTGGAGAGATCG Gene rbcl 733 pb ESrbcL1361R R:TCAGGACTCCACTTACTAGCTTCACG Iniciadores rbcl alinhados ao gene rbcl de Morus indica, indicados abaixo da figura: ESrbcL628F e ESrbcL1361R. O produto amplificado teria um tamanho de 732 pb, aproximadamente.
Parte do alinhamento das amostras do Rio de Janeiro, evidenciando a sequência consenso de 516pb.
Sequência Consenso das Amostras do Rio de Janeiro (Cannabis sativa RIO DE JANEIRO)
Posição dos SNPs na sequência. SNP#1 em destaque no alinhamento superior, e SNP#2 em destaque no alinhamento inferior.
Diferenças encontradas nas sequências do gene de rbcl de C. sativa, das amostras do Rio de Janeiro, Reino Unido, Estados Unidos e China. Amostra Posição no gene SNP#1 58233(G/A) SNP#2 58493(C/T) Rio de Janeiro G C Reino Unido G T Estados Unidos G T China A C
Diferenças encontradas na sequência de aminoácidos entre as amostras do Rio de Janeiro, Reino Unido, Estados Unidos e da China. Amostra Rio de Janeiro Reino Unido Estados Unidos China Posição na cadeia polipeptídica 19411(V/I) Valina Valina Valina Isoleucina
SNP#1 SNP#2
Árvore filogenética da família Cannabaceae (gene rbcl)
Parte da árvore mostrando o grupo monofilético de Cannabis sp. e de Humulus sp., com 1000 réplicas de bootstrap (números nos clados).
Árvore filogenética da família Cannabaceae (gene trnl-f)
Rede Filogenética de Cannabaceae (gene rbcl)
Rede Filogenética de Cannabaceae (gene trnl-f)
Discussão e Conclusão 1. As doze amostras de C. sativa, apreendidas no Rio de Janeiro, mostraram-se idênticas. Possivelmente ao fato de todas serem originárias de cultivares geneticamente próximos ou idênticos. 2. Em comparação com outras amostras do gene de rbcl de C. sativa, depositadas no GenBank, observamos três haplótipos distintos. Um diferenciando as amostras do Rio de Janeiro, outro da China e, um terceiro comum entre os Estados Unidos e Reino Unido.
Discussão e Conclusão 3. Essas diferenças encontradas levam a uma única mudança de aminoácido. A Valina foi encontrada na posição 19411 nas amostras do Rio de Janeiro, Estados Unidos e Reino Unido, enquanto que a Isoleucina foi encontrada na amostra da China. 4. Análise filogenética sugere que essa mutação tenha ocorrido após a expansão da Cannabis a partir da Ásia. 5. A ocorrência do SNPs encontrados no gene de rbcl, entre as amostras do Rio de Janeiro, Estados unidos, Reino Unido e China, pode ser usado como marcador biogeográfico, sugerindo que se trata de uma assinatura genética para análise forense.
Apresentação no IV Congresso de Genética Forense e publicação na Gene rbcl como barcode para identificação forense de Cannabis sativa. Ribeiro ASD 1,2 ; Dias VHG 1 ; Mello ICT 1 ; Silva R 3 ; Sabino BD 4 ; Garrido RG 5 ; Seldin L 6 ; Moura-Neto RS 1,2 1 Laboratório de Biologia Molecular Forense, Instituto de Biologia/UFRJ. 2 Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia, INMETRO. 3 Laboratório de Metabolismo Macromolecular Firmino Torres de Castro, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho/UFRJ 4 Instituto de Criminalística Carlos Éboli /DGPTC/PCERJ. 5 Instituto de Pesquisas e Perícias em Genética Forense, /DGPTC/PCERJ. 6 Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Góes/UFRJ
Obrigado Fim