Faculdade de Ciências Farmacêuticas Dep. Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica Curso de Tecnologia Químico-Farmacêutica Dissertação para obtenção do grau de Mestre Alzira Maria da Silva Martins Orientadora:Prof. Titular Dra Thereza Christina Vessoni Penna
Identificação e verificação da resistência aos sanitizantes dos microrganismos presentes na água destinada ao abastecimento público e em diferentes pontos de um sistema de purificação.
Introdução: Aplicações da água: Água potável Água industrial Água purificada Água para injetáveis
Principais contaminantes da água Contaminantes particulados Contaminantes inorgânicos Contaminantes orgânicos Contaminantes microbiológicos
Características químicas da água para abastecimento público (Portaria n 1469 de 29/12/200) Aspecto Odor Sólidos dissolvidos Totais ph Oxigênio consumido Nitrogênio nítrico Ferro Cloretos Límpido Cheiro de cloro levemente perceptível/ agradável Até 1000mg/litro Entre 6 a 9,5 Até 10mg/litro em oxigênio Até 10mg/litro em nitrogênio Até 0,3mg/litro em ferro Até 250mg/litro íon cloreto Sulfatos Cloro residual Até 250mg/litro em íon sulfito 2,0mg/litro em cloro residual Parâmetros microbiológicas da água para abastecimento público Escherichia coli ou coliformes termotolerantes Coliformes Totais Ausência em 100 ml Ausência em 100 ml
Determinação de padrões de qualidade de água, segundo a Farmacopéia Água purificada Condutividade TOC Bactérias Água para injetáveis Condutividade TOC Limites < 1,3uS/cm < 0,5mg/L < 100UFC/mL Limites < 1,3uS/cm < 0,5mg/L Bactérias < 10UFC/mL Pirogênio < 0,25UE/mL
Sistema de água purificada da Edwards Lifesciences Macchi Água de alimentação Ponto 1 Filtros Multimeios Ponto2 Abrandadores Ponto 3 Filtro de Carvão Ponto 4 Filtro de 5 micras Ponto 5 Osmose Reversa Ponto 6 Deionização continua Ponto 7 Água Purificada Ponto 8 UV- Ponto 9 Filtros de 0.05 micras Ponto 10 Pontos de Uso Ponto 11,12,13
A Edwards Lifesciences Macchi fornece na linha cardiovascular uma extensa gama de produtos e serviços divididos em 4 quatro grandes áreas. Perfusão/CEC Cuidado Intensivo Cirurgia Cardíaca Vascular
Pontos de uso LAVAGEM DE COMPONENTES LAVAGEM DE FILTROS TESTE DE ESTANQUEIDADE
Agentes químicos utilizados na higienização dos subsistemas de tratamento de água Agente químico Conc. de uso (%) Valor final do ph Ponto de uso Tempo de contato (minutos) aplicação Minncare PAA(0,4 5%)+H 2 O 2 (2,2%) 2.1 Osmose reversa Unidade deionização 180 Desinfetante Álcool 70,0 7.2 Pontos de amostragem(externo) 01 Desinfetante Hipoclorito 0,5 11,9 Tanque de água purificada 60 Desinfetante de sódio Linha de distribuição aos pontos de uso Bissulfito de sódio 1,0 4,0 Filtros multimeios Abrandadores 90 Declorinação Filtro de Carvão Hidróxido de Sódio 0,4 12,8 Osmose Reversa Deionização Continua 30 Ajuste de ph Ácido cítrico 0,5 2,4 Osmose Reversa 30 Ajuste de ph Ácido clorídrico 0,5 0,3 Unidade de Deionização 30 Ajuste de ph
Material e Métodos Amostragem: Todos os pontos foram sanitizados com álcool 70%, seguido pela coleta em sacos estéreis de polietileno Filtração: As amostras foram submetidas ao método de filtração de membrana 0,45 um. Incubadas em meio TSA 35 C/72 horas (contagem total), em meio m Endo Agar Less 34,5-35,5 C/22 horas (coliformes total)
Isolamento Contagem das colônias Subcultura das colônias Coloração de Gram Indol Oxidase
Identificação BBL Crystal Substratos enzimáticos e bioquímicos. As reações são baseadas na habilidade do microrganismo em metabolizar o substrato, provocando alteração de cor do indicador de ph. API 20 NE É composto por 20 microtubos (8 testes convencionais e 12 de assimilação). As reações durante o período de incubação, se traduzem em rinsagens espontâneas coloridas e reveladas por adição de reativos. Nos testes de assimilação as bactérias crescem se forem capazes de utilizar o substrato correspondente.
Eficácia dos desinfetantes Concentração inibitória mínima(cim) A avaliação do espectro da ação do agente químico quanto a resistência dos microrganismos é realizada através de diluições, onde é determinada a menor concentração inibitória mínima.
Tempo de redução decimal (Valor D) É o intervalo de tempo necessário para a redução de um ciclo logarítmico de uma população microbiana quando em contato com agentes desinfetante ou esterilizante.
RESULTADOS Contagem total de heterotróficos (UFC/100mL) U F C / 1 0 0 m L 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 pontos de amostragem
Resultados % de bactérias identificadas Microrganismos N colônias %de identificação Pseudomonas aeruginosa 25 32.05 Pseudomonas picketti 18 23.08 Pseudomonas vesiculares 10 12.82 Pseudomonas diminuta 09 11.54 Flavobacterium aureum 05 6.42 Pseudomonas fluorescens 04 5.13 Acinetobacter lwoffi 02 2.56 Pseudomonas putida 02 2.56 Pseudomonas alcaligenes 01 1.28 Pseudomonas paucimobilis 01 1.28 Flavobacterium multivorum 01 1.28 Contagem Total 78 100.0
Resultados Concentração inibitória mínima Agente químico 0,5% acido cítrico 0,5% acido clorídrico 70% álcool 0,5% Bissulfito de sódio 0,4% Hidróxido de sódio 0,5% Hipoclorito de sódio 1% Minncare (acido peracético+ H 2 O 2 ) Pseudomonas aeruginosa identificada (%) 0,25 0,16 17,5 0,078 0,3 0,25 0,50 E. Coli ATCC 25922 0,125 0,16 2,18 0,03 0,1 0,06 0,06
Resultados Valor D - Pseudomonas aeruginosa isolada e identificada Agente químico Log N= R 2 Valor D Log N 0-1/Dt (min) 6log 10 0.5% acido cítrico 1.77-0.244 0.97 4 24 0.5%Acido clorídrico 2.32-0.1502 0.92 6 36 70% Álcool 1.71-0.103 0.95 9 54 0.5% Bissulfito de sódio 2.02-0.1619 0.95 6 36 0.4% Hidróxido de sódio 2.22-0.121 0.94 8 48 0.5% Hipoclorito de sódio 1.50-0.1063 0.98 9 54 1% Minncare (acido peracético + H 2 O 2 ) 1.27-0.1808 0.98 5 30
Resultados Valor D Eschericihia coli ATCC 25922 Agente químico Log N= R 2 Valor D 6log 10 Log N 0-1/Dt (min) 0,5%Acido cítrico 2,05-0,12 0,95 7 42 0,5% Acido clorídrico 1,50-0,24 0,98 4 24 70% Álcool 1,31-0,17 0,98 6 36 0,5% Bissulfito de sódio 1,77-0,20 0,97 5 30 0,4% Hidróxido de sódio 1,81-0,19 0,94 5 30 0,5% Hipoclorito de sódio 1,16-0,22 0,99 4 24 1%Minncare 1,11-0,24 0,90 4 24 (acido peracético+h 2 O 2 )
Discussão Hipoclorito de sódio Valor D Hipoclorito de Sódio 0,5% Log (UFC/mL) 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 P.aeruginosa D=9min E.coli D=4min 0 2 4 6 8 10 12 tempo de contato (min) CIM P.aeruginosa = 0,25% E.coli = 0,06%
Minncare Valor D Minncare 1% Log (UFC/mL) 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 P.aeruginosa D=5min E.coli D=4min 0 1 2 3 4 5 6 tempo de contato (min) CIM P.aeruginosa = 0,50% E.coli = 0,06%
Conclusões A Pseudomonas aeruginosa foi a bactéria com maior % de identificação e maior resistência ao cloro. O Hipoclorito de sódio na concentração 0,5%/ 60min, mostrou-se adequado para sanitização dos reservatórios de água, linhas de distribuição e pontos de uso. O Minncare R na concentração de 1%/ 180 min, mostrou-se adequado para sanitização das membranas de osmose reversa e unidade de deionização.
As bactérias gram negativas não fermentadoras de glicose, se mostraram adequadas para monitoração da sanitização em sistemas de tratamento de água. Em águas tratadas a análise para P.aeruginosa e faz necessária, pois sua presença é marcante e também por sua capacidade de formar biofilme, que causa interferência em processos farmacêuticos e hospitalares. O procedimento de higienização de tanques de armazenamento da água do abastecimento público e sistemas de tratamento de água devem ser rigorosos, de forma a assegurar a ausência de microrganismos patógenos e pirogênio