UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINARIA (CLÍNICA E REPRODUÇAO ANIMAL)

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINARIA (CLÍNICA E REPRODUÇAO ANIMAL) PEDRO BITTENCOURT VELHO OCORRÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE MEMBROS DA FAMÍLIA Anaplasmataceae EM INFECÇÕES NATURAIS DE CÃES DO MUNICÍPIO DE PIRAÍ, RJ. NITERÓI 2009

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PEDRO BITTENCOURT VELHO OCORRÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE MEMBROS DA FAMÍLIA Anaplasmataceae EM INFECÇÕES NATURAIS DE CÃES DO MUNICÍPIO DE PIRAÍ, RJ. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária - Clínica e Reprodução animal da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Orientadora: Prof.ª Dr.ª NÁDIA REGINA PEREIRA ALMOSNY Co-Orientador: Prof. Dr. ALOYSIO DE MELLO FIGUEIREDO CERQUEIRA Niterói 2009

PEDRO BITTENCOURT VELHO OCORRÊNCIA E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE MEMBROS DA FAMÍLIA Anaplasmataceae EM INFECÇÕES NATURAIS DE CÃES DO MUNICÍPIO DE PIRAÍ, RJ. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária - Clínica e Reprodução animal da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Aprovada em Fevereiro de 2009 BANCA EXAMINADORA Prof.ª Dr.ª Nádia Regina Pereira Almosny - Orientadora Universidade Federal Fluminense Prof. Dr. Aloysio de Mello Figueiredo Cerqueira Universidade Federal Fluminense Prof. Dr. Carlos Wilson Gomes Lopes Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro Niterói 2009

Dedico este trabalho ao meu avô, Darcy Machado Loja (in memorian), pelas lições que vão me acompanhar por toda vida.

AGRADECIMENTOS À minha mãe, meu pai, meus irmãos, avós, tios e primos, e a toda minha família, por todo o apoio e pelo amor e carinho que nunca faltaram em minha vida. Incluo aqui, as pessoas que provam que uma família não pode ser definida apenas por laços genéticos. César X. de B. S. Lima, Valeska Figueiredo, Ada S. Lima, Dona Marly, Bárbara Müller, agradeço à todos vocês por serem parte da minha vida. À Ananda Müller, por tudo. Sem você eu hoje não estaria aqui. À minha orientadora, Profª. Drª. Nádia R. P. Almosny por todos os ensinamentos, por ter me concedido o privilégio de ser seu orientado desde os tempos de graduação, e por mostrar que é possível trabalhar com seriedade e competência mesmo nas condições mais adversas. Ao meu Co-orientador, Prof. Dr. Aloysio de Mello F. Cerqueira, por me receber em seu laboratório. Sem o seu apoio este momento não seria possível. Aos professores de Laboratório Clínico, Nayro Alencar e Márcia Xavier, que participaram da minha formação profissional e são muito mais do que mestres, são amigos. Às equipes do Laboratório Clínico Veterinário da Universidade Federal Fluminense (UFF) e do grupo de pesquisa de hemoparasitas, que, desde os tempos de estagiário, participam de minha formação pessoal e profissional. Alexandre Sá, Fabrício Abreu, Kátia Silva, Tandara Machado, Júlia Dourado, Renata Guedes, Alexandre Figueiredo e Daniel Macieira, obrigado por tudo. À UFF, por ser, há nove anos, minha casa. À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de estudos concedida.

A todos os professores e colegas do curso de mestrado, pela amizade e ensinamentos. À amiga Mariana Boechat, que mesmo por hora distante, foi fundamental nesta caminhada. Ao Renatinho, por ser um exemplo de amizade verdadeira. Ao Raphael, pelos nove anos de amizade. À Gracy, que me acompanha neste caminho desde os tempos de estágio. À toda equipe do Laboratório de Enteropatógenos e Microbiologia de Alimentos do Instituto Biomédico da UFF. A todos meus amigos que mesmo distantes carrego sempre comigo. Sem vocês nada disso tem sentido.

A imaginação é mais importante que o conhecimento. Albert Einstein

SUMÁRIO LISTA DE ILUSTRAÇÕES 11 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS 13 1 INTRODUÇÃO 17 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 19 2.1 FAMÍLIA Anaplasmataceae 19 2.1.2 TAXONOMIA 20 2.1.2.1 HISTÓRICO 20 2.1.2.2 NOVA CLASSIFICAÇÃO 21 2.1.3 Ehrlichia canis 22 2.1.3.1 EPIDEMIOLOGIA 22 2.1.3.2 PATOGENIA 23 2.1.3.3 ALTERAÇÕES LABORATORIAIS 25 2.1.4 Anaplasma platys 29 2.1.4.1 EPIDEMIOLOGIA 29 2.1.4.2 PATOGENIA 31 2.1.4.3 ALTERAÇÕES LABORATORIAIS 32 2.1.5 Anaplasma phagocytophilum 33 2.1.5.1 EPIDEMIOLOGIA 33 2.1.5.2 PATOGENIA 35 2.1.5.3 ALTERAÇÕES LABORATORIAIS 36 2.1.6 INFECÇÕES EM HUMANOS 37 2.1.7 DIAGNÓSTICO 38 2.1.7.1 MICROSCOPIA ÓPTICA 38 2.1.7.2 SOROLOGIA 39 2.1.7.2.1 Reação de Imunofluorescência Indireta 39 2.1.7.2.2 Testes comerciais de Ensaio Imunoenzimático Indireto 40 2.1.7.3 REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE 41 2.2 BABESIOSE CANINA 42 2.2.1EPIDEMIOLOGIA 42 2.2.2 PATOGENIA 43

2.2.3 ALTERAÇÕES LABORATORIAIS 44 2.2.4 DIAGNÓSTICO 45 3 MATERIAL E MÉTODOS 47 3.1 ANIMAIS 47 3.2 AMOSTRAS 47 3.3 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS 48 3.3.1 HEMOGRAMAS 49 3.3.2 DOSAGENS BIOQUÍMICAS 50 3.3.3 EXTRAÇÃO/PURIFICAÇÃO DO DNA GENÔMICO 50 3.3.4 ENSAIOS DE PCR PARA AMPLIFICAÇÃO DE SEQÜÊNCIA GENÉTICA DA FAMÍLIA Anaplasmataceae 51 3.3.4.1 PROTOCOLO I 51 3.3.4.2 PROTOCOLO II 51 3.3.4.3 PREPARO DAS MISTURAS E CONDIÇÕES DE REAÇÃO DO PROTOCOLO I 3.3.4.4 PREPARO DAS MISTURAS E CONDIÇÕES DE REAÇÃO DO PROTOCOLO II 52 52 3.3.4.5 VISUALIZAÇÃO DOS PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO 53 3.3.4.6 CONTROLES 53 3.3.5 ENSAIOS DE PCR PARA AMPLIFICAÇÃO DE SEQÜÊNCIA GENÉTICA DE Anaplasma platys 55 3.3.5.1 PROTOCOLO 55 3.3.5.2 PREPARO DAS MISTURAS E CONDIÇÕES DE REAÇÃO 55 3.3.5.3 VISUALIZAÇÃO DOS PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO 56 3.3.5.4 CONTROLES 56 3.3.6 ENSAIOS DE PCR PARA AMPLIFICAÇÃO DE SEQÜÊNCIA GENÉTICA DE Babesia sp. 56 3.3.6.1 PROTOCOLO 56 3.3.6.2 PREPARO DAS MISTURAS E CONDIÇÕES DE REAÇÃO 56 3.3.6.3 VISUALIZAÇÃO DOS PRODUTOS DE AMPLIFICAÇÃO 57 3.3.6.4 CONTROLES 57 3.3.7 SEQUENCIAMENTO DA AMOSTRA POSITIVA PARA MEMBROS DA FAMÍLIA Anaplasmataceae 57

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 59 4.1 DADOS EPIDEMIOLÓGICOS DA POPULAÇÃO ESTUDADA 59 4.2 CLASSIFICAÇÃO SISTEMÁTICA DOS CARRAPATOS 61 4.3 OCORRÊNCIA DE HEMOPARASITOS POR MEIO DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE 61 4.3.1 OCORRÊNCIA DE MEMBROS DA FAMÍLIA Anaplasmataceae POR MEIO DA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE 61 4.4 SEQUENCIAMENTO 63 4.5 DADOS EPIDEMIOLÓGICOS DOS ANIMAIS POSITIVOS PARA MEMBROS DA FAMÍLIA Anaplasmataceae 64 4.6 AVALIAÇÃO DO HEMOGRAMA DOS ANIMAIS POSITIVOS PARA MEMBROS DA FAMÍLIA Anaplasmataceae 65 4.7 AVALIAÇÃO DO PERFIL BIOQUÍMICO DOS ANIMAIS POSITIVOS PARA MEMBROS DA FAMÍLIA Anaplasmataceae 67 5 CONCLUSÕES 69 6 OBRAS CITADAS 70

LISTA DE ILUSTRAÇÕES 1 LISTA DE TABELAS TABELA 1 Total de observações absolutas válidas para cada variável analisada entre os 88 animais provenientes de Piraí utilizados no presente estudo, no período de setembro/2006 a outubro/2006. 48 TABELA 2 Dados do questionário epidemiológico ao qual foram submetidos os proprietários dos 88 cães avaliados no presente estudo. 59 TABELA 3 Resultados dos protocolos de PCR no presente trabalho em animais positivos para membros da família Anaplasmataceae pela avaliação molecular utilizando o protocolo II ( primers ECC e ECB). Animais testados no período de junho/2008 a janeiro/2009. 62 TABELA 4 Parâmetros hematológicos individuais aferidos no presente trabalho em animais positivos para membros da família Anaplasmataceae pela avaliação molecular utilizando o protocolo II ( primers ECC e ECB). Animais testados no período de setembro/2006 a outubro/2006. 65 TABELA 5 Parâmetros bioquímicos individuais aferidos no presente trabalho em animais positivos para a família Anaplasmataceae pela avaliação molecular utilizando o protocolo II ( primers ECC e ECB). Animais testados no período de setembro/2006 a outubro/2006. 67

2 LISTA DE QUADROS QUADRO 1 Nova classificação da ordem Rickettsiales. 21 QUADRO 2 Ocorrência de reações cruzadas entre membros da família 40 Anaplasmataceae em Reação de Imunofluorecência Indireta com soros de cães natural ou experimentalmente infectados QUADRO 3 Valores de referência para parâmetros hematológicos de cães. 49 QUADRO 4 Valores de referência para parâmetros bioquímicos de cães 50 QUADRO 5 Iniciadores utilizados na amplificação de fragmento de 345pb do 51 gene codificador da unidade 16S do RNA ribossomal de membros da família Anaplasmataceae. QUADRO 6 Iniciadores utilizados na amplificação de fragmento de 475pb do 52 gene codificador da unidade 16S do RNA ribossomal de membros da família Anaplasmataceae. QUADRO 7 Iniciadores utilizados na amplificação de fragmento de 54 aproximadamente 399pb do gene codificador da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), presente em todos os mamíferos. QUADRO 8 Iniciadores utilizados na amplificação de fragmento de 55 aproximadamente 678pb do gene codificador da unidade 16S do RNA ribossomal de A. Platys. QUADRO 9 Iniciadores utilizados na amplificação de fragmento de 56 aproximadamente 400pb do gene codificador da unidade 18S do RNA ribossomal de Babesia sp.

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS µl Microlitros µm Micromolar AGH Anaplasmose Granulocítica Humana ALT Alanino aminotransferase AST Aspartato aminotransferase C 3 CDC Complemento Centers for Disease Control and Prevention CHGM Concentração de hemoglobina globular média CID Coagulação intravascular disseminada CK Creatino quinase DNA Ácido desoxirribonucléico dntp Trifosfatos desoxirribonucleosídeos Dr. Doutor Dr. a Doutora EDTA Ácido etileno diamino tetracético ELISA Do inglês Enzyme-Linked Imunosorbent Assay ou ensaio imuno enzimático EMC Erliquiose Monocítica Canina EMH Erliquiose Monocítica Humana EUA Estados Unidos da América fl Fentolitros g/dl Gramas por decilitro HCl Ácido clorídrico IgA Imunoglobulina A IgG Imunoglobulina G IgM Imunoglobulina M KCl Cloreto de Potássio LE Leucometria específica LG Leucometria global M Molar m Metros

MHC Do inglês Major Histocompability Complex ou Complexo Maior de Histocompatibilidade mg/dl Miligramas por decilitro MgCl 2 Cloreto de magnésio mm Milimolar N o Número p. Página pb Pares de base PCR Do inglês Polymerase Chain Reaction ou reação em cadeia da polimerase ph Potencial hidrogeniônico pmol Picomol PTN Proteínas q.s.p. Quantidade suficiente para RJ Rio de Janeiro RNAr Ácido ribonucléico ribossomal SP São Paulo Taq Thermophilus aquaticus U Unidade internacional de medida U/L Unidades por litro UFF Universidade Federal Fluminense VG Volume globular VGM Volume globular médio

RESUMO A família Anaplasmataceae compreende diversos gêneros de Rickettsias capazes de infectar animais domésticos, selvagens e seres humanos. Existem poucos dados acerca da ocorrência e da epidemiologia destes agentes no interior do estado do Rio de Janeiro. São escassos também os estudos que fazem uso de técnicas de biologia molecular para o diagnóstico e caracterização destes microrganismos. Os objetivos deste trabalho foram: a determinação da ocorrência de infecções por membros da família Anaplasmataceae em cães do município de Piraí- RJ, por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), traçar um perfil hematológico e bioquímico dos animais infectados, e, através da técnica de sequenciamento de DNA, determinar as espécies envolvidas nas infecções. Em setembro de 2006, foram coletadas amostras de sangue de 88 cães, sem sinais clínicos de doença, provenientes do município de Piraí-RJ. A PCR foi utilizada para a detecção de seqüências genéticas de microrganismos da família Anaplasmataceae (através de dois protocolos) e do gênero Babesia. Uma amostra foi positiva para DNA da família Anaplasmataceae pelo protocolo I e cinco (5,7%) pelo protocolo II. Uma amostra foi positiva em ambos protocolos. Esta amostra foi senquenciada, apresentando uma similaridade genética de 99% com Anaplasma platys e A. phagocytophilum. Um protocolo de PCR específico para A. platys foi então realizado obtendo resultado negativo. Este resultado sugere que uma espécie de Anaplasma sp., possivelmente A. phagocytophilum, está presente em cães no Brasil. Nenhuma amostra foi positiva para Babesia sp. Palavras-chave: Anaplasmataceae; Cães; Erliquiose; PCR; Diagnóstico.

16 ABSTRACT The family Anaplasmataceae is consists of several species capable of infecting domestic and wild animals, and humans. There is little data available about the prevalence and epidemiology of these agents in Rio de Janeiro state. There are also few studies using molecular biology tools for diagnosis and characterization of these microorganisms. The aims of this study were: to estimate the occurrence of infections by members of the family Anaplasmataceae in dogs from Piraí - Rio de Janeiro State, Brazil, using polymerase chain reaction (PCR), provide a hematological and biochemical profile of infected dogs, and, using DNA sequencing, determine wich species were involved in the infection. In September of 2006, blood samples from 88 dogs with no clinical signs of disease were collected in Piraí municipality, Rio de Janeiro State. PCR was used to detect gene sequences from Anaplasmataceae family (using two protocols) and Babesia sp. One sample had a positive PCR result for the family Anaplasmataceae in protocol I and 5 (5,7%) in protocol II. One sample was positive in both protocols and it was sequenced, showing a 99% similarity with Anaplasma platys e Anaplasma phagocytophilum. The sample was tested in a PCR protocol specific for A. platys with a negative result. This result suggests that a Anaplasma species, possibly A. phagocytophilum is present in Brazilian dogs. None of the animals was positive for Babesia sp. Palavras-chave: Anaplasmataceae; Dogs; Ehrlichiosis; PCR; Diagnosis.

17 1 INTRODUÇÃO A família Anaplasmataceae compreende diversos gêneros de microrganismos capazes de infectar animais domésticos, selvagens e seres humanos, além de hospedeiros invertebrados como artrópodes e helmintos (DUMLER et al., 2001). As infecções causadas por membros da família Anaplasmataceae em cães têm sido descritas em quase todo território nacional (ALMOSNY, 1998; ALMOSNY & MASSARD, 2002). O carrapato Riphicephalus sanguineus, responsável pela transmissão destes microrganismos, entre outros hemoparasitas, é facilmente encontrado no Brasil, especialmente em áreas urbanas (O DWYER et al. 2001; RODRIGUES et al., 2001; TORRES et al., 2004). Uma grande quantidade de trabalhos, sobre aspectos epidemiológicos, clínicos e laboratoriais têm sido desenvolvidos, mostrando que as hemoparasitoses vêm se disseminando, inclusive como zoonoses (O DWYER et al. 2001; LABARTHE et al., 2003; MACIEIRA, 2003; DAGNONE et al., 2003; COSTA JR et al., 2007; SANTOS et al., 2009). Alguns estudos demonstram que, além de animais de companhia, como cães e gatos, espécies silvestres também são suscetíveis à infecção (MACHADO et al., 2006). A detecção de anticorpos para alguns destes agentes em seres humanos também já foi feita em território nacional por CALIC et al. (2005) e COSTA et al. (2006). Existem poucos dados acerca da ocorrência e da epidemiologia destes agentes no interior do estado do Rio de Janeiro. São escassos também os estudos que fazem uso de técnicas de biologia molecular para o diagnóstico e caracterização destes microrganismos. Devido à importância clínica destes agentes, à grande população de ácaros transmissores de hemoparasitos, e por muitas destas parasitoses

18 possuírem potencial zoonótico, torna-se necessária a caracterização dos agentes presentes nestas regiões, permitindo que sejam traçadas estratégias de controle, métodos de diagnóstico eficientes e um perfil hematológico e bioquímico desta população proporcionando, assim, um maior conhecimento das características epidemiológicas da infecção de cães por membros da família Anaplasmataceae no estado do Rio de Janeiro. Os objetivos deste trabalho foram: a determinação da ocorrência de infecções por membros da família Anaplasmataceae em cães do município de Piraí-RJ, por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), traçar um perfil hematológico e bioquímico dos animais infectados, e, através da técnica de sequenciamento de DNA, determinar as espécies envolvidas nas infecções.

19 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 FAMÍLIA Anaplasmataceae A família Anaplasmataceae é constituída por organismos gram negativos, intracelulares obrigatórios que parasitam leucócitos, eritrócitos, células endoteliais e/ou plaquetas de mamíferos. Os organismos desta família, que previamente pertenciam ao gênero Ehrlichia, podem ser classificados de acordo com o tipo celular que infectam predominantemente como sendo: monocitrópicos (Ehrlichia canis, E. chaffeensis, E. ruminantum, Neorickettsia sennetsu e N. risticii), granulocitotrópicos (Anaplasma phagocytophilum e E. ewingii) ou trombocitotrópicos (A. platys) (GREENE, 2006). Estes agentes são transmitidos para os animais e seres humanos através de carrapatos vetores específicos que adquirem a infecção ao fazer o repasto sanguíneo em animais infectados, sejam eles mamíferos domésticos ou reservatórios selvagens. Historicamente, pensava-se que as espécies do gênero Ehrlichia possuíam uma alta especificidade de hospedeiros, entretanto, novas evidências demonstraram que espécies deste gênero podem infectar diversas espécies de hospedeiros (BREITSCHWERDT, 2000). Assim, as espécies que infectam cães incluem algumas que freqüentemente causam doença clínica nos mesmos e outras que aparentemente causam uma doença mais branda ou assintomática nesses animais que podem servir de reservatórios e ser responsáveis pela transmissão dos microrganismos para humanos (MURPHY et al., 1998).

20 2.1.2 TAXONOMIA 2.1.2.1 HISTÓRICO A erliquiose é uma das mais importantes hemoparasitoses que acometem cães. A doença é causada por organismos bacterianos gram negativos, intracelulares obrigatórios. Sua primeira descrição, por Donatien & Lestoquard, se deu em 1935 na Argélia. O microrganismo recebeu o nome de Rickettsia canis, e em 1945 foi renomeado como Ehrlichia canis. A partir do primeiro relato, em 1935, diversos casos da doença passaram a ser descritos no mundo todo (RIKIHISA, 1991). Ao longo dos anos novas espécies foram descritas dentro do gênero Ehrlichia, sendo que E. platys (HARVEY et al., 1978); E. risticii (KAKOMA et al., 1994); E. ewingii (ANDERSON et al., 1992a; STOCKHAM et al., 1992); E. chaffeensis (DAWSON et al., 1992; BREITSCHWERDT et al., 1998); E. phagocytophila (JOHANSSON et al., 1995; PUSTERLA et al., 1997a); E. equi (LEWIS et al., 1975; MADEWELL et al., 1982) e o agente da ehrlichiose granulocítica humana foram encontrados em infecções naturais em cães (GREIG et al., 1996). Em 1984, Ristic & Huxsoll elaboraram uma classificação do gênero Ehrlichia baseando-se na comparação de características fenotípicas, ecologia, dados epidemiológicos, padrões de infecções experimentais e em humanos, e características antigênicas dos isolados. Essa classificação foi revista por Rikihisa (1991), com o acréscimo de novas espécies, mas sem que fossem feitas mudanças no sistema de classificação. Com o avanço no campo dos estudos genômicos (seqüenciamento de uma porção do gene codificador da unidade 16S do RNA ribossomal e estudos diversos relacionados ao DNA) foram abertos novos horizontes para a classificação taxonômica dos membros da família Anaplasmataceae. (OLSEN & WOESE, 1993; DRANCOURT & RAOULT, 1994). O uso das novas ferramentas de biologia molecular tornou possível agrupar as espécies da tribo Ehrlichiaeae em três genogrupos distintos, (ANDERSON et al., 1991) sendo

21 eles: genogrupo um ou da E. canis; genogrupo dois ou da E. phagocytophila e genogrupo três ou da E. sennetsu. 2.1.2.2 NOVA CLASSIFICAÇÃO Seguindo a tendência estabelecida com divisão em genogrupos, o gênero Ehrlichia foi submetido a uma importante reclassificação em 2001. Isso ocorreu após estudos das seqüências dos genes codificadores da unidade 16S RNAr, da gênese de proteínas de superfície e análise genética da proteína de choque térmico groesl, fornecerem evidências moleculares da necessidade de uma reestruturação das famílias Rickettsiaceae e Anaplasmataceae e dos gêneros Anaplasma, Ehrlichia, Cowdria, Neorickettsia e Wolbachia (quadro 1). Quadro 1: Nova classificação da ordem Rickettsiales. Ordem Família Gênero Espécie A. marginale A. centrale Anaplasma A. ovis A. bovis A. platys A. phagocytophilum E. ruminantium Rickettsiales Anaplasmataceae E. canis Ehrlichia E. chaffeensis E. muris E. ewingii Fonte: DUMLER et al., 2001 Neorickettsia Wolbachia N. helminthoeca N. risticii N. sennetsu W. pipientis Com isso, os membros das tribos Ehrlichiaeae e Wolbachiaeae foram transferidos para a família Anaplasmataceae com a eliminação da estrutura tribal da família Rickettsiaceae. O gênero Anaplasma passou então a incluir a espécie A. phagocytophilum (englobando as espécies E. phagocytophila, E.

22 equi e o agente da erliquiose granulocítica humana), as espécies E. platys e E. bovis foram renomeadas como A. platys e A. bovis Os gêneros Ehrlichia e Neorickettsia foram corrigidos. O primeiro para inclusão da espécie E. ruminantium, antiga Cowdria ruminantium, e o segundo para inclusão das espécies N. risticii, antiga E. risticii e N. sennetsu, antiga E. sennetsu (DUMLER et al., 2001). Estas alterações foram homologadas em 2002 1, com A. phagocytophila tendo seu nome corrigido para A. phagocytophilum e A. bovis e A. platys consideradas como novas espécies, por se julgar que seus antigos nomes não possuíam nenhum suporte. 2.1.3 Ehrlichia canis 2.1.3.1 EPIDEMIOLOGIA Agente causador da Erliquiose Monocítica Canina (EMC), E. canis foi descrito pela primeira vez em 1935 na Argélia por DONATIEN & LESTOQUARD, este organismo ganhou notoriedade ao causar a morte de centenas de cães do exército americano durante a guerra do Vietnam (RIKIHISA, 1991a). Trata-se da espécie mais prevalente e mais virulenta entre os cães (HOSKINS, 1991). Possui ampla distribuição geográfica, intimamente relacionada com a de seu vetor o carrapato vermelho do cão, Rhipicephalus sanguineus, podendo ser encontrada na Ásia, África, Europa, Oceania e nas Américas (WOODY & HOSKINS, 1991; RIKIHISA, 1991a; BREITSCHWERDT, 2000; NEER & HARRUS, 2006). O primeiro relato no Brasil, foi em Belo Horizonte, MG em 1973 (COSTA et al., 1973). No Rio de Janeiro foi descrita em cães da Polícia Militar do Estado em 1976 (CARRILLO et al., 1976). De acordo com Almosny (1998) e Almosny & Massard (2002), a doença vem sendo descrita com freqüência em vários locais do território brasileiro. Estudos utilizando diferentes técnicas de 1 LIST EDITOR: Notification list. Notification that new names and new combinations have appeared in volume 51, part 6 of the IJSEM. IJSEM, vol 52, p 5-6, 2002.

23 diagnósticas demonstraram variações na ocorrência de Ehrlichia spp. em diversas regiões do Brasil (O DWYER et al., 2001; MACIEIRA, 2003; LABARTHE et al., 2003; DAGNONE et al., 2003). A transmissão ocorre principalmente através do carrapato R. sanguineus (WOODY & HOSKINS, 1991; RIKIHISA, 1991a; BREITSCHWERDT, 2000; NEER & HARRUS, 2006). O carrapato se torna infectado após ingerir sangue com leucócitos parasitados (WOODY & HOSKINS, 1991) e contamina outros cães quando inocula sua secreção salivar contaminada no local da picada, no momento do repasto sanguíneo (GROVES et al., 1975). No carrapato há transmissão transestadial e os vetores infectados podem transmitir a doença por ao menos 155 dias após a infecção (NEER & HARRUS, 2006). Visto que não há transmissão transovariana o carrapato não pode funcionar como um reservatório, sendo necessária a presença de cães contaminados para que o carrapato se infecte. Dermacentor variabilis pode atuar como vetor de E. canis, visto que já foi obtida a infecção experimental através deste carrapato (JOHNSON et al., 1998). Transfusões com sangue de doadores contaminados também podem transmitir E. canis (WOODY & HOSKINS, 1991; HARRUS et al., 1998a; BREITSCHWERDT, 2000). 2.1.3.2 PATOGENIA Uma grande variedade de fatores como, tamanho do inócuo, infecções concomitantes por outros agentes e cepas mais patogênicas, pode influenciar o curso e o prognóstico da doença. Nenhuma predisposição de idade ou sexo foi observada, mas cães da raça Pastor alemão parecem ser mais suscetíveis, apresentando doença mais severa e de pior prognóstico do que outras raças (GREENE, 2006). A patogenia da Erliquiose Monocítica Canina (EMC) envolve um período de incubação que dura de 8 a 20 dias (HARRUS et al., 1997a). Neste período organismos se multiplicam por meio de fissão binária em macrófagos do sistema monocítico fagocitário (NEER & HARRUS, 2006). Essa multiplicação

24 leva à linfoadenomegalia e à hiperplasia linforreticular no fígado e no baço. As células infectadas, transportadas pela corrente sangüínea, vão para outros tecidos do organismo, em especial pulmões, rins e meninges. A adesão das células infectadas ao endotélio vascular desencadeia uma vasculite e infecção de tecido sub-entotelial (BREITSCHWERDT, 2000). O período de incubação é seguido de três fases identificadas através das alterações clínico-patologicas: aguda, subclínica e, em alguns casos, crônica (RIKIHISA, 1991a; WOODY & HOSKINS, 1991; HARRUS et al., 1997a; BREITSCHWERDT, 2000; NEER & HARRUS, 2006). A fase aguda dura de duas a quatro semanas (BREITSCHWERDT, 2000; NEER & HARRUS, 2006). Os sinais clínicos na fase aguda são geralmente moderados e inespecíficos. Os sinais clínicos associados à esta fase incluem febre, depressão, anorexia, linfoadenopatia, perda suave de peso, petéquias, equimoses e esplenomegalia (WOODY & HOSKINS, 1991; ALMOSNY, 1998; NEER & HARRUS, 2006), no entanto, em diversos casos, os sinais podem ser inaparentes (IQBAL et al., 1994; BREITSCHWERDT, 2000). Diversos outros sinais como, por exemplo, manifestações do sistema nervoso central, oculares, respiratórias, também têm sido associados à erliquiose (WOODY & HOSKINS, 1991). Quadros clínicos agudos mais acentuados parecem ocorrer em regiões onde o aparecimento da doença é mais recente, indicando uma menor adaptação entre parasito e hospedeiro (ALMOSNY & MASSARD, 2002). Em animais imunocompetentes, os sinais clínicos tendem a desaparecer, mesmo sem tratamento, e o cão passa à fase subclínica da doença (NEER & HARRUS, 2006). Durante a infecção por Ehrlichia sp., repetidas recombinações ocorrem nos genes das principais proteínas antigênicas do microrganismo, levando a formação de vários epítopos antigênicos distintos. Com isso, as bactérias conseguem escapar das defesas do organismo, resultando em infecções persistentes (REDDY & STRECK, 1999). A evasão do sistema imune é outro mecanismo pelo qual E. canis consegue se perpetuar no seu hospedeiro. Estudos in vitro indicaram uma diminuição na expressão de receptores do Complexo Maior de Histocompatibilidade (MHC) de classe II (HARRUS et al., 2003).

25 Infecções experimentais indicam que o baço é o órgão no qual E. canis se mantém durante a fase subclínica da doença. O baço aparentemente possui um papel na patogênese de E. canis. Cães esplenectomizados infectados experimentalmente apresentaram doença mais branda do que cães não esplenectomizados (HARRUS et al., 1998b). Os cães que não obtiverem sucesso na eliminação do parasito durante a fase subclínica podem se manter nessa fase por anos ou ingressar na fase crônica da doença (NEER & HARRUS, 2006). A fase crônica da doença, na sua forma mais severa, é caracterizada por pancitopenia, devido à hipoplasia ou até mesmo a uma aplasia de medula. O prognóstico nestes casos é desfavorável, com os animais podendo vir a óbito por infecções secundárias, sangramentos incontroláveis e/ou anemia (NEER & HARRUS, 2006). A formação de anticorpos específicos para E. canis ocorre entre 4 e 7 dias após a infecção (IgM e IgA) e depois de 15 dias (IgG) (WANER et al., 2001). 2.1.3.3 ALTERAÇÕES LABORATORIAIS A primeira alteração hematológica observada em uma infecção experimental foi a ocorrência de plaquetas gigantes ou ativadas, a partir do 3º dia pós-inoculação (ALMOSNY, 1998). A presença de macro plaquetas em esfregaços sanguíneos tem sido associada a uma aceleração na produção das mesmas na medula óssea. Porém, o achado de plaquetas atípicas na avaliação do esfregaço sanguíneo pode ser o primeiro indicativo de distúrbios na trombopoiese ou na função plaquetária (JAIN, 1993). Em um estudo retrospectivo envolvendo 100 casos, observou-se que a maioria dos cães apresentava trombocitopenia e anemia (aproximadamente 75%), sendo que em 50% dos cães a anemia era do tipo normocítica e normocrômica, caracterizando uma resposta ineficiente por parte do hospedeiro. No mesmo estudo, perto de 50% dos cães apresentavam linfopenia e aproximadamente 37% estavam leucopênicos (HARRUS et al.,

26 1997b). Observações similares foram feitas em outro estudo, que encontrou 82% dos cães apresentando anemia, na maioria dos casos arregenerativa, trombocitopenia em 82% e leucopenia em 32%, dos quais 20% apresentavam neutropenia (TROY & FORRESTER, 1990). Trombocitopenia é a mais comum das alterações hematológicas da erliquiose, podendo ser encontrada em todas as fases da doença ((WOODY & HOSKINS, 1991; WANER et al., 1995; HARRUS, 1997a). Diversos mecanismos estão envolvidos na patogênese da trombocitopenia, tais como, consumo excessivo; diminuição da meia vida das plaquetas (possivelmente por seqüestro esplênico e destruição imunomediada); presença de anticorpos antiplaquetas e, na fase crônica, hipoplasia megacariocítica na medula óssea (NEER & HARRUS, 2006). Sabe-se que uma citocina chamada fator inibidor de migração plaquetária, é encontrada em cães com erliquiose. A concentração deste fator é inversamente proporcional ao número de plaquetas circulantes, sendo níveis mais elevados do mesmo, encontrados em variantes mais virulentas de E. canis (NEER & HARRUS, 2006). A inibição da migração plaquetária pode interferir com a entrada de plaquetas na circulação a partir da medula óssea, além de poder facilitar a adesão das plaquetas no endotélio. A queda na adesividade relacionada associada à trombocitopenia sugere que os mecanismos para a diminuição da adesividade plaquetária incluem anticorpos antiplaquetários, um inibidor que poderia ser um fator plasmático ou ainda um efeito direto do parasito sobre as plaquetas. Durante o curso da erliquiose há, portanto, um déficit qualitativo e quantitativo nas funções plaquetárias (LOVERING et al., 1980). Almosny (1998) não observou, durante a fase aguda, casos acentuados de trombocitopenia, embora existisse uma variação cíclica na contagem das plaquetas, sugerindo maior adaptação na relação parasito-hospedeiro nos animais estudados. A anemia é um achado consistente na maioria dos casos, tendo sido descrita por diversos autores (NEITZ & THOMAS, 1938; HUXSOLL et al., 1972; TROY & FORRESTER, 1990; HOSKINS, 1991; WOODY & HOSKINS, 1991). Almosny, 1998, observou que os valores de volume globular médio e da

27 hemoglobina globular média se mantinham dentro dos parâmetros de normalidade, caracterizando uma anemia normocítica normocrômica e um quadro hematológico arregenerativo. No entanto, é possível que a anemia seja regenerativa em casos onde haja hemólise ou perda de sangue concomitante (HOSKINS, 1991). A anemia parece ser mais severa entre a 3ª e a 4ª semana pós-inoculação, quando se observou uma acentuada palidez nas mucosas (ALMOSNY, 1998). Um estudo realizado em um hospital no sul do Brasil, a anemia foi um fator de risco maior para a erliquiose do que a trombocitopenia (DAGNONE et al., 2003). A fase subclínica, que ocorre entre seis e oito semanas após a inoculação, é caracterizada por persistência variável de trombocitopenia, leucopenia e anemia sem presença de sinais clínicos (WOODY & HOSKINS, 1991). Durante a fase subclínica a contagem total de células sangüíneas está levemente deprimida, especialmente as plaquetas (McDADE, 1990). Esta fase pode ainda ser caracterizada pela persistência de altos títulos de anticorpos e de sinais clínico-patológicos condizentes com a erliquiose (CODNER & FARRIS-SMITH, 1986). Na fase crônica, os sinais clínicos e alterações hematológicas podem variar de ausentes até extremamente graves, de acordo com o caso em questão (BREITSCHWERDT, 2000; NEER & HARRUS, 2006). Tendências ao sangramento, palidez devido à anemia severa, emaciação, apatia, sensibilidade abdominal, uveíte anterior, hemorragias retinianas e sinais neurológicos consistentes com meningoencefalite, podem ser observados em cães que desenvolvem manifestações da doença durante a fase crônica. Outra alteração laboratorial frequentemente encontrada na erliquiose é hipergamaglobulinemia, geralmente de caráter policlonal, mas em alguns casos podem ocorrer gamopatias monoclonais (HARRUS et al., 1997b). Diversas evidências apontam para o envolvimento de uma resposta hiperimune na patogenia da EMC (NEER & HARRUS, 2006). A presença de infiltrados plasmocitários na medula óssea e em órgãos parenquimatosos, teste de Coombs e de auto-aglutinação positivos, presença de anticorpos antiplaquetas e imunocomplexos circulantes são exemplos (HARRUS et al., 1999; HARRUS et al., 2001). Propõe-se que a nefropatia com perda de proteínas,

28 frequentemente observada em pacientes com EMC crônica, se deva a uma glomerulonefrite causada por acúmulo de imunocomplexos (BREITSCHWERDT, 2000). A imunossupressão, presente em animais na fase crônica da EMC, predispõe os pacientes à infecções secundárias, bacterianas ou por outros microrganismos oportunistas. (BREITSCHWERDT, 2000) Os achados hematológicos da fase crônica se assemelham aos da fase aguda (KUEHN & GAUNT, 1985). Monocitose persistente, assim como linfocitose, trombocitopenia e anemia não regenerativa são as características principais (HOSKINS, 1991). A pancitopenia geralmente ocorre por hipoplasia/aplasia da medula óssea e ocorre na fase crônica acentuada (18% dos casos), e com mais freqüência em pastores alemães (WOODY & HOSKINS, 1991; NEER & HARRUS, 2006). HARRUS et al. (1998b) propuseram que E. canis induza a produção e/ou elaboração de um fator esplênico, que irá suprimir a hematopoiese. A ausência deste fator em cães esplenectomizados pode explicar a redução nos parâmetros eritrocitários vistos nos cães intactos. É possível que esse fator possa desempenhar um papel importante na supressão da medula óssea que ocorre durante a fase crônica da infecção por E. canis. Ewing e Buckner, (1965) ao estudarem o desenvolvimento da doença clínica em animais infectados por Ehrlichia sp. e B. canis observaram que animais infectados somente com B. canis desenvolviam uma anemia normocítica/normocrômica devido à destruição dos eritrócitos, recuperando-se com o tratamento e os animais que tinham erliquiose concomitante além da destruição dos eritrócitos, também desenvolviam uma aplasia medular que agravava a doença, levando a um curso fatal. As principais alterações bioquímicas observadas na erliquiose são hiperproteinemia (33%), hiperglobulinemia (39%), hipoalbuminemia (43%) e elevações nas atividades séricas de Alanina Aminotransferase (ALT) e Fosfatase alcalina (43% e 31% respectivamente) (NEER & HARRUS, 2006).

29 2.1.4 Anaplasma platys 2.1.4.1 EPIDEMIOLOGIA Agente da trombocitopenia cíclica, o microorganismo foi primeiramente descrito por Harvey et al., em 1978, na Florida, em plaquetas de um cão trombocitopênico. São poucos os estudos epidemiológicos em relação ao parasito, mas acredita-se que sua distribuição geográfica se assemelhe a de outras espécies de rickettsias (BRADFIELD et al., 1996). A. platys já foi descrito nos EUA, na Grécia, França, Itália, Israel, China, Japão, Tailândia e Venezuela (BROWN et al., 2001). A infecção por A. platys também vem sendo relatada em cães de várias regiões do Brasil (MACHADO, 2004), sendo observada ainda a co-infecção com E. canis e B. canis, podendo R. sanguineus ser o vetor destas três espécies (KORDICK et al., 1999; HUA et al., 2000; SUKSAWAT et al., 2001). Foi detectada a presença do DNA de A. platys em carrapatos das espécies Ixodes ovatus e Haemaphysalis flava (INOKUMA et al., 2003). Simpson et al., (1991) realizaram experimento onde houve falha na transmissão do agente pelo carrapato R. sanguineus. Mas, existem evidências de que A. platys seja transmitido pela picada deste carrapato (HIBLER et al., 1986; WOODY e HOSKINS, 1991; CHANG et al., 1996; HARRUS et al., 1997a, INOKUMA et al., 2000, SPARAGANO et al., 2003). No Japão, material genético de A. platys foi amplificado a partir de DNA extraído de carrapatos (INOKUMA et al., 2000). Riphicephalus sanguineus possui ampla distribuição geográfica e é o vetor de outros agentes tais como E. canis e B. canis. A co-infecção destes agentes com A. platys é um achado freqüente (EWING e BUCKNER, 1965; HUA et al., 2000; SUKSAWAT et al., 2001; INOKUMA et al., 2003) fato este que pode reforçar a hipótese de que o vetor seja o mesmo para os três. Harvey (1990) afirmou que não há transmissão vertical e Hoskins (1991b) relatou não haver evidências de transmissão do cão para os humanos diretamente. É comum a infecção associada com Babesia sp., e Hepatozoon canis, visto que todos compartilham o carrapato R. sanguineus, como vetor (SHAW

30 et al., 2001). Em 1999, Sainz et al. relataram um caso clínico onde o cão apresentou infecção simultânea por A. platys, E. canis e Babesia sp. Infecções simultâneas podem ocorrer como resultado da transmissão de múltiplos organismos pelo mesmo carrapato ou como resultado de transmissões independentes em tempos diferentes, por carrapatos diferentes (KORDICK et al., 1999). Já foram observadas inclusões sugestivas de A. platys em um gato no Brasil, porém uma tentativa de infecção experimental em gato não obteve sucesso (SATARÉM et al., 2000; HARVEY 2006). Na África do Sul foi identificada uma seqüência do gene 16S RNAr 99,5% idêntica à A. platys no sangue de uma ovelha. No entanto não se conseguiu observar a morfologia do parasita nem o tipo de célula infectada (HARVEY 2006). Anaplasma platys é um microorganismo intracelular obrigatório, que apresenta aspectos morfológicos e comportamentais característicos e parasita unicamente plaquetas de cães, não sendo encontradas inclusões em megacariócitos ou qualquer outra célula precursora na medula óssea durante a parasitemia (HIBLER et al., 1986; RIKIHISA, 1991 WOODY & HOSKINS, 1991, HOSKINS, 1991a; ALMOSNY & MASSARD, 2002). São parasitos intracitoplasmáticos pequenos, pleomórficos (podem ser cocóides ou elipsóides) e gram-negativos, apesar de não se corarem bem por este método. Podem aparecer isolados, em pares ou em grupos, dentro de vacúolos. Através da realização de fissões binárias sucessivas formam inclusões compactas chamadas mórulas (HIBLER et al., 1986, HARVEY, 1990). Podem medir de 350 à 1250nm de diâmetro e as plaquetas infectadas podem ter de um a três vacúolos contendo de um a oito microorganismos cada (HARVEY, 1978). Arraga-Alvarado et al., em 2003, relataram a observação de vacúolos com até quinze microrganismos. O mecanismo de penetração e saída do parasito ainda não é conhecido, mas provavelmente a entrada na plaqueta ocorre por meio de endocitose, devido à propriedade fagocítica da mesma (HARVEY, 1978) sendo a membrana do vacúolo proveniente da membrana externa dessa célula (HARVEY, 1990).

31 Rikihisa (2003) descreveu algumas características dos gêneros Anaplasma e Ehrlichia que contribuem para o entendimento do mecanismo de adesão e sobrevivência na célula hospedeira. Quando a bactéria interage com a célula alvo, sinais são transmitidos entre ambas. Dessa forma, cria-se um ambiente propício à replicação. A entrada nos fagócitos é independente de microfilamentos (não caracterizando uma fagocitose), mas depende da atividade da transglutaminase, pois a endocitose é mediada por receptor. 2.1.4.2 PATOGENIA O período de incubação da doença varia de oito a quinze dias. Durante a fase aguda da infecção há uma alta porcentagem de plaquetas infectadas no sangue circulante. Em alguns dias ocorre um decréscimo do número de plaquetas circulantes em e a contagem pode chegar a valores como 20.000 plaquetas/µl ou menos, neste momento, tornam-se mínimas as chances de visualização do parasita. Após o desaparecimento dos microrganismos, a plaquetometria volta ao normal em três ou quatro dias. Sete a quatorze dias após o primeiro episódio ocorre outra parasitemia na qual, novamente, o número de plaquetas decresce. Esta natureza cíclica das trombocitopenias e das parasitemias tende a diminuir com o tempo e com a cronificação da doença, o que resulta em esporádicas aparições do parasito e trombocitopenias moderadas (HIBLER et al., 1986; HARVEY, 1990; SWANGO et al., 1989; WOODY e HOSKINS, 1991). Supõe-se que o mecanismo inicial da trombocitopenia esteja relacionado à proliferação do parasito e que as trombocitopenias subseqüentes são determinadas por mecanismos de remoção imunomediados (WOODY e HOSKINS, 1991). Usualmente, os animais infectados naturalmente por A. platys não apresentam evidências de doença clínica, sendo raras as hemorragias. Em estudos experimentais, uma discreta hipertermia é observada durante a parasitemia inicial e um pouco de sangue nas fezes também pode ser

32 observado nos pacientes trombocitopênicos (HIBLER et al., 1986; HARVEY, 1990; WOODY e HOSKINS, 1991). Existem, no entanto, relatos de animais que apresentaram anorexia, letargia, depressão, perda de peso, descarga nasal mucopurulenta, linfoadenomegalia, mucosas hipocoradas e febre (RIKIHISA, 1991; HARRUS et al., 1997a). Um caso de uveíte também foi relatado em um animal com alta titulação de anticorpos anti A. platys e nenhum título para E. canis (GLAZE e GAUNT, 1986). Waner (1993) relatou em Israel, um caso no qual uma cadela apresentava anorexia, apatia, febre e achados laboratoriais eram sugestivos de infecção por E. canis como anemia, leucopenia e trombocitopenia. O diagnóstico foi definido através da pesquisa em esfregaço sanguíneo, pois foram encontradas apenas mórulas em plaquetas. O animal apresentava sorologia positiva para A. platys e negativa para E. canis, mas o autor não descartou completamente a possibilidade de infecção conjunta. A associação de A. platys a outros hemoparasitos como E. canis e B. canis, potencializa a doença clínica e dificulta o diagnóstico e o manejo terapêutico dos cães doentes (SUKSAWAT et al., 2001a). 2.1.4.3 ALTERAÇÕES LABORATORIAIS Os principais achados laboratoriais da infecção por A. platys são trombocitopenia, anemia (DAGNONE et al., 2003), macroplaquetas, monocitose e hipoalbuminemia (HARRUS et al., 1997a, KAKOMA et al., 2000). Cães infectados podem apresentar plaquetometrias próximas ao valor mínimo de referência ou valores extremamente baixos. Em alguns casos, uma diminuição transitória da leucometria global também pode ser observada, assim como uma leve diminuição do hematócrito, que raramente é inferior ao valor de referência (WOODY e HOSKINS, 1991; HOSKINS, 1991a). A trombocitopenia associada a A. platys é classificada como regenerativa, pois é observada uma hiperplasia megacariocítica na medula óssea de cães infectados (BAKER et al., 1987). Não foram observadas

33 mudanças cíclicas no número de megacariócitos ou inclusões citoplasmáticas nos mesmos. Há uma diminuição da agregação plaquetária, mas sua relevância clínica ainda não está completamente esclarecida. Isso pode estar relacionado à ativação plaquetária durante a infecção aguda e posterior liberação do parasito, pois estas plaquetas continuam circulantes, porém de forma hipofuncional, o que pode justificar o decréscimo discreto da agregação (GAUNT et al., 1990). A anemia que ocorre durante a doença clínica é classificada como normocítica/normocrômica e as mudanças nos eritrócitos e na concentração de ferro sérico se assemelham às descritas na anemia da doença inflamatória. Ocorre ainda uma diminuição da relação mielóide/eritróide, assim como uma hipoalbuminemia e hipocalcemia devido à inflamação e à resposta imune do hospedeiro ao microrganismo (BAKER et al., 1988). A hipergamaglobulinemia também é relatada, havendo elevações dos valores de IgM e IgA (HIBLER et al., 1986; ALMOSNY; MASSARD, 2002). Outras doenças também podem causar anemia e trombocitopenia, não sendo esses achados suficientes para um diagnóstico conclusivo, mas deve-se pensar em Ehrlichia sp ou A. platys como diagnóstico diferencial para outras doenças (DAGNONE et al., 2003). 2.1.5 Anaplasma phagocytophilum 2.1.5.1 EPIDEMIOLOGIA Anaplasma phagocytophilum é o agente causador da Anaplasmose Granulocitotrópica e possui ampla distribuição geográfica, sendo encontrado nos Estados Unidos, Reino Unido, Noruega, Suécia, Suíça, Alemanha, Holanda, Eslovênia, Espanha, França, Itália, Russia, Coréia do Sul e Tailândia (GREIG & ARMSTRONG, 2006; BELTRAME et al., 2006; AMUSATEGUI et al., 2006; MATSUMOTO et al., 2006). Os tipos celulares infectados são principalmente neutrófilos e eosinófilos. Ocasionalmente o microrganismo pode

34 ser visualizado em monócitos (WOLDEHIWET, 2006) e eosinófilos (GREIG & ARMSTRONG, 2006). O parasita já foi detectado infectando cães, equinos, gatos e seres humanos (AGUERO-ROSENFELD, et al. 1996, BARLOUGH, et al. 1996; GREIG et al. 1996; EGENVALL, et al. 1997; LAPPIN, et al. 2004). Na Europa, A. phagocytophilum é reconhecido como um agente de grande importância em ruminantes (WOLDEHIWET, 2006). Diversas espécies de roedores e cervídeos são implicadas como reservatórios naturais do agente tanto nos EUA como na Europa (GREIG & ARMSTRONG, 2006; WOLDEHIWET, 2006). Carrapatos coletados de aves migratórias na Suécia estavam infectados por A. phagocytophilum, indicando que estas aves podem ter um papel na distribuição geográfica do agente (BJÖERSDORFF et al., 2001). Os vetores são carrapatos ixodídeos, em especial do gênero Ixodes (GREIG & ARMSTRONG, 2006). Na Coréia do Sul, o DNA do agente foi detectado também em carrapatos da espécie H. longicornis (KIM et al., 2003). A principal via de transmissão da infecção é através do carrapato vetor, mas a transmissão transplacentária já foi observada em bovinos (PUSTERLA et al., 1997a). Anaplasma phagocytophilum possui três cepas, correspondentes aos três agentes agrupados nesta espécie em 2001: Ehrlichia equi, E. phagocytophila e o Agente da Erliquiose Granulocítica Humana. As três cepas apresentam uma homologia de 99,1% na seqüência do gene codificador da unidade 16S do RNA ribossomal, e uma grande ocorrência de reações cruzadas em testes sorológicos (DUMLER et al., 2001). Mesmo possuindo grande similaridade genética, as três variedades genéticas de A. phagocytophilum possuem diferentes características acerca de sua distribuição e espectro de hospedeiros (GREIG & ARMSTRONG, 2006) A cepa E. phagocytophila causa doença apenas em ruminantes na Europa (PUSTERLA et al. 1999; STUEN et al. 2002). Até o presente momento, os casos europeus de infecções em cães, gatos e seres humanos foram identificados como pertencentes à cepa do Agente da Erliquiose Granulocítica Humana (EGENVALL, et al., 1997; PETROVEC et al., 1997; PUSTERLA et al., 1997b; BJÖERSDORFF et al., 1999). Nos Estados Unidos há relatos da ocorrência da

35 cepa do Agente da Erliquiose Granulocítica Humana em cães, gatos e seres humanos e da cepa de E. equi em equinos na califórnia (GREIG & ARMSTRONG, 2006). No Brasil ainda não existem relatos da detecção molecular de A. phagocytophilum. 2.1.5.2 PATOGENIA O período de incubação da doença dura de uma a duas semanas após a infecção (GREIG & ARMSTRONG, 2006). Anaplasma phagocytophilum invade as células do hospedeiro através de endocitose, após se ligar a receptores de membrana (DUMLER, 2005). In vitro, o microrganismo infecta tanto células precursoras de neutrófilos como de monócitos, porém, a presença de um maior número de receptores específicos na superfície dos neutrófilos é responsável pela maior susceptibilidade deste tipo celular à infecção (KIM et al., 2002). Após a entrada na célula, o microrganismo impede a fusão do fagolisossomo e causa um bloqueio nos mecanismos oxidativos da respiração celular, utilizados na eliminação organismos invasores (MOTT & RIKIHISA, 2000; WANG et al., 2002), garantindo a sobrevivência do agente e prejudicando a capacidade do hospedeiro de responder a este tipo de agressão. Garyu e Dumler (2005) demonstraram que A. phagocytophilum reduz a capacidade fagocítica de neutrófilos humanos in vitro, por interferir na expressão de receptores de membrana envolvidos na fagocitose. A ativação de macrófagos parece ter um importante papel na patogenia da Anaplasmose Granulocítica em seres humanos. O grau de ativação bem como o aumento na produção de citocinas parecem estar relacionados com a severidade da doença (DUMLER et al. 2007). O envolvimento de células endoteliais na patogênese de A. phagocytophilum foi demonstrado pela detecção da presença do microrganismo nas mesmas tanto in vitro como em camundongos experimentalmente infectados por até sete semanas após a inoculação (MUNDERLOH et al., 2004; HERRON et al., 2005). Foi observada ainda uma

36 diminuição na função plaquetária após associação com A. phagocytophilum in vitro (BORJESSON et al., 2005). A anemia decorrente da infecção possivelmente ocorre devido a uma supressão da hematopoiese decorrente do aumento na produção de citocinas pelos neutrófilos infectados (GREIG & ARMSTRONG, 2006). Os sinais clínicos da doença são, geralmente, inespecíficos incluindo: febre, letargia, depressão e anorexia. Dores musculares também são observadas, com os animais apresentando claudicação, fraqueza e relutância em se movimentar (GREIG et al., 1996; EGENVALL, et al., 1997; PUSTERLA et al., 1997b). Menos de 10% dos pacientes apresentam dores articulares (GREIG & ARMSTRONG, 2006). Outros sinais, menos frequentes incluem: vômito, diarréia, linfadenomegalia, hepatomegalia, esplenomegalia, sinais neurológicos e respiratórios (GREIG et al., 1996; EGENVALL, et al., 1997; PUSTERLA et al., 1997b; GREIG & ARMSTRONG, 2006). Em um estudo, cães que haviam se recuperado da infecção espontaneamente, e tinham resultados de PCR negativos para o agente, foram submetidos a doses imunossupressoras de glicocorticóides por ao menos um mês. Os animais voltaram a apresentar resultados positivos para A. phagocytophilum, apesar de não apresentarem sintomatologia (GREIG & ARMSTRONG, 2006). Este resultado sugere que cães podem ser portadores assintomáticos do microrganismo, podendo assim transmitir o agente para outros animais e/ou seres humanos. 2.1.5.3 ALTERAÇÕES LABORATORIAIS As alterações laboratoriais mais frequentes são trombocitopenia de intensidade variável e linfopenia (GREIG et al., 1996; EGENVALL, et al., 1997). A contagem de neutrófilos está, geralmente, dentro dos limites de referência sem a ocorrência de desvio a esquerda (GREIG et al., 1996; EGENVALL, et al., 1997; PUSTERLA et al., 1997b). Anemia normocítica normocrômica de caráter arregenerativo está presente em menos da metade dos animais (GREIG & ARMSTRONG, 2006).