UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO LUCINDA CALHEIROS GUIMARÃES

0 UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO LUCINDA CALHEIROS GUIMARÃES ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS NO SISTEMA DIGESTÓRIO EM 322 NECRÓPSIAS DE PACIENTES COM SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA: COMPARAÇÃO DOS ACHADOS PRÉ E PÓS-HAART. UBERABA 2015

1 LUCINDA CALHEIROS GUIMARÃES ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS NO SISTEMA DIGESTÓRIO EM 322 NECRÓPSIAS DE PACIENTES COM SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA: COMPARAÇÃO DOS ACHADOS PRÉ E PÓS-HAART. Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, área de concentração Patologia Humana, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para obtenção do título de doutor. ORIENTADORA: Prof a Dr a Sheila Jorge Adad CO-ORIENTADORES: Prof. Dr. Sebastião Tostes Júnior e Prof a Dr a Adilha M. R. Micheletti UBERABA 2015

2 LUCINDA CALHEIROS GUIMARÃES ALTERAÇÕES MORFOLÓGICAS NO SISTEMA DIGESTÓRIO EM 322 NECRÓPSIAS DE PACIENTES COM SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA: COMPARAÇÃO DOS ACHADOS PRÉ E PÓS-HAART. Tese apresentada ao curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, área de concentração Patologia Humana, da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, como requisito parcial para obtenção do título de doutor. de de. Banca examinadora: Prof a Dr a Sheila Jorge Adad Orientadora Universidade Federal do Triângulo Mineiro - UFTM Prof a Dr a Lenice do Rosário de Souza Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - UNESP Prof a Dr a Patrícia Maluf Cury Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto - FAMERP Prof a Dr a Luciana de Almeida Silva Teixeira Universidade Federal do Triângulo Mineiro - UFTM Prof a Dr a Virgínia Oliveira Crema Universidade Federal do Triângulo Mineiro UFTM

3 Dedicatória

4 Aos meus pais, Maria Abadia e Cândido, meus exemplos de vida. À minha irmã, Tereza, pela parceria de sempre.

5 Agradecimentos

6 À Dra. Sheila Jorge Adad, pela oportunidade de desenvolver este trabalho, pela confiança em mim depositada e pelo exemplo de dedicação à carreira acadêmica. Aos alunos e residentes, pelo desafio que representam no ofício de ensinar. Ao Dr. Sebastião Tostes Júnior, pelo valoroso auxílio na revisão do texto e na análise estatística. À Dra. Adilha Misson Rua Micheletti, pela co-orientação neste trabalho. Aos Drs. João Carlos Saldanha e Thales Parenti Silveira, pela amizade e incentivo. Aos colegas médicos e professores da Disciplina de Patologia Especial e do Serviço de Patologia Cirúrgica, pela contribuição cotidiana ao meu aprimoramento profissional. Aos funcionários da Disciplina de Patologia Especial e do Serviço de Patologia Cirúrgica, pelo apoio à realização deste trabalho, em especial à Luzia, Eliângela e Anuska. Ao Pedro, pela dedicação e competência na busca dos prontuários.

7 Aos técnicos de necrópsia da Disciplina de Patologia Especial e do Serviço de Patologia Cirúrgica, pelo auxílio na localização das peças macroscópicas. À minha família, pelo apoio incondicional. Apoio Financeiro: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq): financiamento de projeto n 478955/2012-0 e Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM).

8 Mortui vivos docent. (Rokitansky)

9 Resumo

10 Comprometimento do sistema digestório em pacientes com síndrome da imunodeficiência adquirida (aids) é frequente. Estudos clínicos mostram que a introdução da terapia antirretroviral altamente eficaz (HAART) no tratamento da aids possibilita sobrevida prolongada e menor incidência de infecções oportunistas e de neoplasias malignas. Entretanto, não encontramos estudos de necrópsias de indivíduos com aids comparando as alterações morfológicas do sistema digestório pré e pós-haart. Os objetivos deste estudo foram descrever a frequência de lesões no sistema digestório em necrópsias de indivíduos com AIDS, verificar se há correlação entre a frequência das lesões no sistema digestório e o uso ou não de HAART, verificar a correlação entre o tempo de sobrevida após o diagnóstico de HIV e o uso ou não de HAART e analisar a relevância das doenças do sistema digestório para o óbito dos pacientes. Foi feito um estudo retrospectivo com revisão de prontuários, de laudos de necrópsias e de cortes histológicos dos segmentos do sistema digestório da língua ao intestino grosso de 322 necrópsias de indivíduos com aids, realizadas entre 1989 e 2012, na Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, MG, Brasil. Os casos foram classificados em três grupos: Grupo A - sem uso de qualquer medicação antirretroviral - 185

11 (57,4%) casos; grupo B - um ou dois antirretrovirais por qualquer tempo ou HAART por período inferior aos últimos seis meses de vida - 83 (25,8%) casos; grupo C - HAART nos últimos seis meses de vida ou mais - 54 (16,8%) casos. Na análise global do sistema digestório, alterações estavam presentes em 73,6% dos casos. Candidíase (22,7%) e citomegalovirose (19,2%) foram as doenças mais frequentes, seguidas por histoplasmose (6,5%), infecção por micobactérias (5,6%) e toxoplasmose (4,3%). Infecção por citomegalovírus (CMV) e toxoplasmose foram mais freqüentes no grupo A em relação ao grupo C. Na língua, as lesões mais frequentes foram candidíase (32,1%) e leucoplasia pilosa oral (10,7%); no esôfago, candidíase (13,5%) e infecção por CMV (12,8%); no estômago, infecção por CMV (6,9%) e toxoplasmose (3%); no intestino delgado, infecção por CMV (5,9%) e histoplasmose (4,2%); no intestino grosso, infecção por CMV (11,6%) e histoplasmose (5,3%). Apenas no intestino grosso e, somente em relação à infecção por CMV, houve diferença estatisticamente significante, sendo mais frequente no grupo sem uso de antirretrovirais em relação ao grupo em uso de HAART. Esses dados mostram que infecções continuam sendo frequentes, mesmo com o uso de HAART. Entretanto, o tempo médio de sobrevida no grupo C (57,2 meses) foi mais de três vezes o do grupo A (16,9 meses) e quase o dobro do grupo B (34,2 meses). Em 2,2% dos casos, a causa do óbito foi secundária à hemorragia digestiva alta, principalmente por úlceras infecciosas. Nossos resultados confirmam o sistema digestório como local comum de doenças relacionadas ao HIV/aids, mesmo com o advento da HAART, embora as doenças digestivas sejam causas incomuns de óbito nesses pacientes. O maior tempo de sobrevida dos indivíduos em uso de HAART evidencia o claro benefício do uso da HAART, confirmando os estudos clínicos. Palavras-chave: Necrópsia. Aids. HIV. Sistema digestório. HAART.

12 Abstract

13 Digestive system involvement in patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is frequent. Clinical studies show that the introduction of highly active antiretroviral therapy (HAART) for the treatment of AIDS enables prolonged survival and lowers incidence of opportunistic infections and malignancies. However, we have not found autopsy studies of individuals with AIDS comparing digestive system morphological disorders in the pre and post-haart eras. This study aims to describe the frequency of digestive system lesions in autopsies of AIDS patients, compare the frequency of digestive system lesions in HAART users and non-users, as well as the correlation between survival time after diagnosis of HIV in HAART users and non-users, and analyze the role of the digestive system diseases in the cause of death. This is a retrospective study with review of medical records, autopsies reports and histological sections of digestive system segments from tongue to large bowel of 322 autopsies of AIDS patients, carried out between 1989 and 2012 at Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, MG, Brazil. Cases are classified into: Group A - no HAART treatment - 185 (57.4%) cases; group B - 1 or 2 antiretroviral drugs during any time or HAART previous to the last 6 months of life - 83 (25.8%) cases; group C - HAART within the last 6 months of life or longer - 54 (16.8%) cases. Digestive system impairment was

14 present in 73.6% of cases. Candidiasis (22.7%) and cytomegalovirus infection (19.2%) were the most frequent diseases, followed by histoplasmosis (6.5%), mycobacterial infection (5.6%) and toxoplasmosis (4.3%). Cytomegalovirus infection (CMV) and toxoplasmosis were more frequent in group A compared to group C. In the tongue, the most frequent lesions were candidiasis (32.1%) and oral hairy leukoplakia (10.7%); in the esophagus, candidiasis (13.5%) and CMV (12.8%); in the stomach, CMV (6.9%), and toxoplasmosis (3%); in the small bowel, CMV (5.9%) and histoplasmosis (4.2%); and in the large bowel, CMV (11.6%), and histoplasmosis (5.3%). There was a statistically significant difference only in the large bowel CMV infection. At this segment of digestive system, CMV was more frequent in the group of HAART non-users comparing to the group of HAART users. These data show that infections are still frequent, even with the use of HAART. However, the average survival time in group C (57.2 months) was more than three times than in group A (16,9 months) and almost twice than in group B (34,2 months). In 2.2% of cases, the cause of death was secondary to upper gastrointestinal bleeding, mainly due to infectious ulcers. These results confirm that the digestive system is an usual site of disorders related to HIV/AIDS, even after HAART. However, the digestive diseases are uncommon causes of death in these patients. The longer survival of patients using HAART demonstrates the clear benefit of HAART, confirming the clinical studies. Keywords: Autopsy. AIDS. HIV. Digestive system. HAART.

15 Abreviaturas

16 Aids: síndrome da imunodeficiência adquirida CD4: antígeno de superfície do linfócito T auxiliar CEP: comitê de ética em pesquisa CMV: citomegalovírus DNA: ácido desoxirribonucleico DST: doenças sexualmente transmissíveis ELISA: ensaio imunoenzimático GIST: tumor estromal gastrointestinal HAART: terapia antirretroviral altamente eficaz (do inglês, Highly Active Antiretroviral Therapy) HE: hematoxilina e eosina HHV-8: herpesvírus humano 8 HIV: vírus da imunodeficiência humana HSV: herpes simples vírus PAS: ácido periódico de Schiff PBS: solução salina tamponada RNA: ácido ribonucleico SK: sarcoma de Kaposi UFTM: Universidade Federal do Triângulo Mineiro

17 Sumário

18 INTRODUÇÃO... 19 1. O HIV... 21 2. O HIV e o sistema digestório... 21 3. Necrópsias em HIV/aids, período pré-haart... 22 4. A era pós-haart... 28 5. A importância das necrópsias na infecção por HIV/aids... 31 HIPÓTESE... 34 OBJETIVOS... 36 CASUÍSTICA E MÉTODOS... 38 1. Metodologia para atender aos objetivos 1 e 2... 40 2. Metodologia para atender ao objetivo 3... 43 3. Metodologia para atender ao objetivo 4... 44 RESULTADOS... 45 1. Características da amostra... 47 2. Caracterização e frequência das alterações morfológicas no sistema digestório em 322 necrópsias de pacientes com HIV/aids... 49 3. Análise da relação entre a presença de alterações morfológicas no sistema digestório e o uso ou não de HAART... 54 4. Análise da relação entre o tempo de sobrevida após o diagnóstico de infecção por HIV e o uso ou não de HAART... 64 5. Análise da relevância das doenças do sistema digestório para o óbito dos pacientes... 64 DISCUSSÃO... 66 CONCLUSÕES... 74 REFERÊNCIAS... 77 ANEXOS... Anexo 1 Parecer consubstanciado (CEP) protocolo 1871... Anexo 2 Protocolo para o relato das alterações morfológicas... Anexo 3 Quadro com todos os casos do estudo... A B H J

19 Introdução

20 O primeiro caso de Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (aids, do inglês, Acquired Immunodeficiency Syndrome) no Brasil foi diagnosticado em 1982 (www.aids.gov.br/pagina/historia-da-sida). Em 1983, identificou-se um vírus, anos depois nomeado vírus da imunodeficiência humana (HIV), como agente causador da aids (SABINO et al., 2009). Desde então, um número crescente de pessoas vem sendo diagnosticada com infecção pelo HIV/aids em todo o mundo. Globalmente, houve uma estimativa de prevalência da aids de 35,3 milhões de casos em 2012. No mesmo ano, a incidência da doença foi de 2,3 milhões de novos casos e o número de mortes de 1,6 milhão (www.unaids.org). Segundo o último Boletim Epidemiológico AIDS e DST-2014 (www.aids.gov.br), aproximadamente 734 mil pessoas vivem com HIV/aids no Brasil. Desde 1980 até junho de 2014 foram registrados 491.747 (65,0%) casos de aids em homens e 265.251 (35,0%) casos em mulheres no Brasil. A região Sudeste apresenta a maioria dos casos registrados até hoje (54,4%) e uma taxa de mortalidade por aids em 2013 de 6,7/100.000 habitantes. No Brasil, a epidemia pelo HIV/aids é hoje fenômeno de grande magnitude e extensão, não se limitando a segmentos

21 populacionais sob particular risco, a princípio, homossexuais e bissexuais masculinos, hemofílicos e as demais pessoas que receberam sangue e hemoderivados, e usuários de drogas injetáveis. A transmissão heterossexual do HIV é o motor da dinâmica da epidemia, contribuindo também para o aumento do número de casos de aids entre as mulheres (SZWARCWALD et al., 2000). O fenômeno de feminização da aids foi também descrito por Ribeiro et al. (2009). 1. O HIV O HIV é um retrovírus da subfamília dos Lentivírus. Retrovírus são constituídos de RNA e utilizam a enzima transcriptase reversa para a replicação do RNA viral, originando uma dupla fita de DNA que se integra ao genoma da célula hospedeira, onde irá permanecer enquanto a célula continuar viva. Nessa fase, a infecção é considerada latente, quando o DNA proviral apenas se integra ao genoma da célula hospedeira. Na infecção por HIV, a transcrição do DNA proviral é controlada por proteínas virais e do hospedeiro, e resulta na formação de novas partículas virais, caracterizando a infecção produtiva. O RNA viral sintetizado se reúne a proteínas virais formando novos vírus, os quais contêm, ainda, a transcriptase reversa no core viral e as glicoproteínas do invólucro, gp 41 e gp 120. A liberação dos vírus se faz por brotamento. A infecção produtiva, quando associada a extenso brotamento viral, leva as células infectadas à morte, resultando em perda progressiva dos linfócitos T CD4, principais alvos da infecção pelo HIV. A proteína viral de superfície gp 120 liga-se à molécula CD4 da célula hospedeira, o que permite a entrada do vírus na célula (KUMAR et al., 2010). A replicação viral, portanto, ocorre principalmente no tecido linfóide, rico em células que expressam CD4, como os já citados linfócitos, além de monócitos, macrófagos e células de Langerhans (SABINO et al., 2009). A perda progressiva de linfócitos T CD4 leva a desregulação das respostas imunes celular e humoral, favorecendo o surgimento de infecções oportunistas e neoplasias relacionadas à aids. 2. O HIV e o sistema digestório O sistema digestório é considerado um santuário da infecção pelo HIV por ser um órgão com abundante tecido linfóide, cujos linfócitos T CD4 e macrófagos da lâmina própria são células-alvo da infecção viral. Replicação viral ativa foi observada no tecido linfóide

22 intestinal de pacientes recebendo tratamento antirretroviral cuja carga viral no sangue periférico era indetectável, sugerindo que o sistema digestório seja um importante reservatório de células infectadas pelo HIV, o que contribui para a persistência viral (DANDEKAR, 2007). Além de linfócitos e macrófagos, antígenos virais também foram observados em células epiteliais, através de hibridização in situ, imuno-histoquímica e ELISA (KOTLER et al., 1991). Desde o início da aids como pandemia, o acometimento do sistema digestório está entre as características mais comuns da doença (TORRE et al., 2005). O termo enteropatia pelo HIV refere-se às alterações clínicas, funcionais e morfológicas que acometem pacientes infectados desde a fase aguda até as fases tardias da doença. Essas alterações incluem diarréia, aumento de células mononucleares na mucosa intestinal, aumento da permeabilidade intestinal, má absorção de ácidos biliares e de vitamina B12. Histologicamente, esse dano é representado por infiltrado inflamatório linfocítico na mucosa com agressão às células epiteliais, atrofia vilosa, hiperplasia de criptas e encurtamento de vilos. Tais alterações ocorrem na ausência de infecções fúngicas, bacterianas ou virais oportunistas. É possível que o próprio HIV, através de efeitos tóxicos ou imunologicamente mediados, seja o responsável pela enteropatia nesses indivíduos (KOTLER et al., 1984). Além da enteropatia por HIV, infecções oportunistas e neoplasias são causas comuns de comprometimento do sistema digestório em pacientes com aids. Trabalhos de necrópsia mostram que o comprometimento do sistema digestório segue, em termos de frequência, o comprometimento do sistema nervoso central e do sistema respiratório. De fato, o trabalho de mestrado desta aluna (GUIMARÃES, 2011; GUIMARÃES et al., 2012), demonstrou comprometimento do sistema digestório em 73 (78,5%) de 93 casos de necrópsias em pacientes com HIV/aids realizadas de 1989 a 1996 no Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Triângulo Mineiro (UFTM). 3. Necrópsias em HIV/aids, período pré-haart A HAART (do inglês, Highly Active Antiretroviral Therapy) corresponde à associação de, pelo menos, três medicamentos (dois inibidores da transcriptase reversa associados a um inibidor de protease ou a um inibidor não nucleosídeo da transcriptase reversa) para o tratamento da aids e, no Brasil, é mais conhecida como coquetel (LOMAR e

23 DIAMENT, 2009). Desde o início do tratamento dos pacientes com HIV/aids com HAART houve significativa mudança na história natural da doença, que pode ser percebida através da comparação dos estudos de necrópsias nas fases pré e pós-haart, como relatamos a seguir. Séries de estudos de necrópsia demonstram em geral as alterações encontradas em vários órgãos e, menos frequentemente, detalham a avaliação específica de determinado órgão ou sistema. Os estudos mais abrangentes de necrópsias descrevem os achados globais das alterações infecciosas e neoplásicas associadas à aids. Markowitz et al. (1996) relataram as alterações em necrópsias de 252 pacientes com aids em Nova York, Estados Unidos da América. As infecções mais comuns no sistema digestório foram por citomegalovírus (CMV) e candidíase e a neoplasia mais frequente foi sarcoma de Kaposi (SK). Hofman et al. (1999) descreveram os achados de 395 necrópsias de indivíduos com aids na França, falecidos entre 1983 e 1996. As infecções mais comuns em todos os órgãos foram CMV (151/38%) e toxoplasmose (101/26%). Nesse estudo houve comprometimento do sistema digestório por Candida (204/52%), CMV (35/9%), micobactérias (19/5%), Leishmania (8/2%), T. gondii (4/1%) e bactérias não especificadas (41/10%). Outra grande série de estudo de necrópsias de pacientes HIV positivos foi descrita por Lucas et al. (1993), na qual foram avaliadas 294 necrópsias realizadas na África. Três doenças infecciosas tuberculose, bacteremia (predominantemente pneumococcemia ou salmonelose) e toxoplasmose cerebral em conjunto, contribuíram para mais de 50% dos óbitos. Esses autores discutem sobre a baixa sobrevida dos pacientes africanos com aids, que não sobreviviam tempo suficiente para desenvolverem infecções consideradas pouco virulentas como pneumocistose, CMV e micobacteriose atípica. De fato, a frequência dessas infecções nesse estudo foi menor que em estudos americanos e europeus: pneumocistose e micobacteriose atípica foram encontradas, cada uma, em 4% dos casos e CMV em 26%. Nesse trabalho, os autores referem enterite não associada à infecção por CMV, Cryptosporidium, estrongiloidíase ou tifo presentes em 10% dos casos, tendo sido causa imediata do óbito em 3% dos casos. Klatt et al. (1994) foram os autores do maior estudo de necrópsias em indivíduos com aids que encontramos na literatura, no qual foram avaliadas 565 necrópsias realizadas em Los Angeles, Estados Unidos da América. Nesse estudo os pulmões foram descritos como a principal sede de doenças associadas à aids causadoras do óbito, seguidos, em ordem de frequência, pelo sistema digestório e sistema nervoso central. Com relação ao sistema

24 digestório, houve comprometimento de todos os segmentos analisados, nas seguintes proporções: cavidade oral 202 (35,7%) casos; esôfago 142 (25,1%) casos; estômago 131 (23,1%) casos; intestino delgado 176 (31,1%) casos; cólon e reto 140 (24,8%) casos. Mohar et al. (1992) referem que na América Latina há um perfil epidemiológico intermediário entre os Estados Unidos da América e a África, com relação à frequência e distribuição de infecções oportunistas e neoplasias secundárias à aids, tendo como base dados demográficos e sócio-econômicos. Em estudo de 177 necrópsias de pacientes com aids realizado na Cidade do México, esses pesquisadores relataram taxas de CMV disseminada (69%) e SK (30%) semelhantes às americanas. No entanto, a prevalência de tuberculose disseminada (24%) foi comparável à encontrada em pacientes africanos. Além disso, infecções frequentes na população norte-americana com aids, tais como pneumocistose e micobacteriose atípica, foram menos comuns. Lucas et al. (1993), em estudo de 294 necrópsias na África, também mostraram menor frequência de pneumocistose, micobacteriose atípica e linfomas quando comparada às taxas norte-americanas. As diferenças na proporção de doenças associadas à aids resultam de diferentes condições geográficas e sócioeconômicas, justificando-se a relevância do estudo e do conhecimento dessas alterações em cada região, o que permite traçar estratégias específicas para a abordagem clínica e terapêutica das mesmas. Avaliação do sistema digestório foi realizada por Lanjewar et al. (1996) em 49 necrópsias de pacientes com aids na Índia em um período de 5 anos. Eram 37 homens e 12 mulheres, cujas idades variavam de 18 a 72 anos. Trinta (61,2%) casos apresentaram alterações no sistema digestório. Agentes infecciosos foram observados em 29 (59%) casos, observando-se múltiplos microorganismos em alguns deles. O microorganismo mais frequentemente encontrado foi CMV, observado em 13 (27%) casos. Nesse estudo não foram vistas alterações macroscópicas na mucosa gastrointestinal nos locais infectados por CMV. O comprometimento do sistema digestório por CMV afetou, em ordem decrescente de frequência, intestino delgado, estômago, cólon e esôfago. Parasitas foram encontrados em 9 (18%) casos: Cryptosporidium (5/10%), Strongyloides stercoralis (3/6%) e verminose (1/2%). Fungos foram observados em 8 (16%) casos: Candida em cinco (10%) e Cryptococcus neoformans em três (6%) casos. Infecção por M. tuberculosis ocorreu em sete (14%) casos. SK foi encontrado em um (2%) paciente, afetando o estômago e o intestino delgado.

25 O mesmo autor (LANJEWAR, 2011) descreveu as alterações em 236 necrópsias de adultos com aids realizadas na Índia, abrangendo um período de 20 anos (1988 a 2007). Tuberculose foi a principal causa do óbito, ocorrendo em 63% dos casos. Havia envolvimento por tuberculose no sistema digestório em 11 (5%) casos. CMV no sistema digestório foi observado em 15 (6,3%) casos e, em todos eles, foi considerado doença contributiva ao óbito. Enterite por Cryptosporidium foi identificada em seis (3%) casos, sendo também considerada doença contributiva ao óbito. Candidíase estava presente em seis (3%) casos: em 5 acometendo o esôfago e em um caso, acometendo o estômago. Havia dois (1%) casos de SK, associados a tuberculose disseminada, a qual foi considerada a causa do óbito. As lesões do SK não foram consideradas graves e disseminadas o suficiente para constituírem causa do óbito. Em 3 (1%) casos foi diagnosticada estrongiloidíase. Nesse estudo, 13 (6%) pacientes morreram devido a doenças não-associadas à aids: cirrose alcoólica (3), cirrose por hepatite B (3), além de hemorragia pulmonar, malária cerebral, meningite purulenta, peritonite bacteriana, pielonefrite aguda, amiloidose e carcinoma epidermóide do pulmão, cada uma dessas condições ocorrendo em um caso. O autor destaca as doenças infecciosas como causa de óbito de 97% dos casos relacionados à aids. Ressalta, ainda, a relativa escassez de criptosporidiose (3%) nos casos de necrópsia relacionada à rápida autólise da mucosa intestinal no exame post-mortem. A baixa prevalência de SK, neste estudo, é relacionada à baixa prevalência de infecção pelo HHV-8 na população indiana. Embora parte dos casos desse estudo inclua a época pós-haart no mundo, o autor não faz nenhuma referência ao uso ou não de HAART pelos pacientes. No Brasil, estudo específico do sistema digestório foi feito por Carvalho et al. (1994) em Botucatu, SP. Nesse trabalho foram revistos cortes histológicos dos segmentos do sistema digestório (da boca à região anal) de 45 necrópsias consecutivas de pacientes HIV positivos. Eram 32 homens e 13 mulheres, com idades entre 23 e 58 anos e 37 (82,3%) deles apresentaram lesões no sistema digestório. As principais alterações encontradas foram de natureza infecciosa, predominando infecção por CMV (36%). A boca foi o local mais frequentemente comprometido (33/73%). Sete neoplasias foram observadas no total, localizadas nos seguintes órgãos: estômago (um SK e um linfoma), intestino delgado (três SK) e região anal (dois carcinomas espinocelulares intramucosos). Lesões múltiplas foram vistas em 17 (38%) casos, sendo o CMV o agente mais comumente encontrado nas associações. As associações mais comuns foram CMV com Candida (5/29%), CMV com leucoplasia pilosa oral (3/18%) e CMV com SK (3/18%).

26 No mestrado desta aluna (GUIMARÃES, 2011; GUIMARÃES et al., 2012) foram estudadas as alterações morfológicas no sistema digestório em 93 necrópsias consecutivas de indivíduos com HIV/aids no período de 1989 a 1996. Nesse estudo apenas três pacientes não preenchiam os critérios de aids. Foram observadas alterações no sistema digestório em 73 (78,5%) casos. As alterações mais comuns foram doenças infecciosas: candidíase (42%), CMV (29%), histoplasmose (11,8%), toxoplasmose (9,7%) e infecção por micobactérias (9,7%). Neoplasias malignas estavam presentes em quatro (4,3%) casos: dois SK, um adenocarcinoma gástrico e um carcinoma embrionário metastático. Nesse estudo, a importância das alterações encontradas no sistema digestório foi avaliada no contexto do óbito de cada paciente. As doenças do sistema digestório foram causa imediata do óbito em cinco (5,4%) casos. Além desses dois estudos brasileiros de séries de necrópsias avaliando especificamente o sistema digestório, alguns estudos globais fazem referência aos órgãos do sistema digestório. No Brasil, o primeiro estudo publicado de séries de necrópsias em pacientes com aids data de 1986, época do diagnóstico de numerosos casos de aids em todo o mundo. Michalany et al. (1987) analisaram 15 necrópsias de pacientes com aids no Departamento de Anatomia Patológica da Escola Paulista de Medicina, em São Paulo e encontraram resultados semelhantes aos estudos internacionais previamente publicados. O agente infeccioso e a neoplasia mais comuns foram CMV (7/47%) e SK (2/13%), respectivamente. Entretanto, a frequência de neoplasias (3/20%), foi muito menor que a relatada em estudos norteamericanos. Foram observados dois casos de SK, sendo que um desses pacientes apresentava também linfoma do sistema nervoso central. Com relação ao sistema digestório, esôfago e intestino estavam comprometidos, cada um, em quatro (26,7%) dos 15 pacientes avaliados. Estômago e ânus estavam comprometidos em um (6,7%) e três (20%) dos 15 pacientes avaliados, respectivamente. Estudos brasileiros posteriores (NETTO et al., 1990) confirmaram os resultados de Michalany et al. (1986) e de estudos norte-americanos. Os autores avaliaram 58 necrópsias realizadas no Hospital do Servidor Público Estadual Francisco Morato de Oliveira, em São Paulo. Infecções oportunistas foram observadas em 53 (90%) casos. Em análise global de todos os órgãos, as infecções mais frequentes foram por: CMV (34/59%), T. gondii (13/22%), P. jirovecii (10/17%). Nesse estudo o intestino foi o segmento do sistema digestório mais frequentemente afetado (24/41%), seguido do estômago (12/21%) e esôfago (11/19%). SK foi encontrado em 12 (21%) pacientes, quatro dos quais apresentavam comprometimento

27 gastrointestinal. Linfomas estavam presentes em quatro casos (7% do total), sendo que apenas um paciente apresentava comprometimento gastrointestinal. Borges et al. (1997) avaliaram 52 necrópsias de pacientes com aids na Universidade Federal de Uberlândia, MG e encontraram, também, predominância das lesões infecciosas sobre as neoplásicas. No sistema digestório, as infecções oportunistas encontradas foram por CMV (intestino e esôfago), histoplasmose (intestino), candidíase (esôfago) e toxoplasmose (esôfago, estômago e intestinos). As neoplasias que acometeram o sistema digestório, nesse estudo, foram SK e adenocarcinoma do intestino delgado. Houve discordância entre os achados clínicos e os de necrópsia em 54% dos casos, sendo que 48% dos pacientes tinham pelo menos uma doença relacionada à aids não diagnosticada previamente em vida. Esses dados reiteram a importância da realização de necrópsias nos pacientes com aids, pois funcionam também como instrumento de avaliação do corpo clínico e de aprendizado de patologistas, clínicos e estudantes de medicina. Os autores comentam ainda sobre a ausência de infecção por Paracoccidioides brasiliensis nas necrópsias estudadas. A paracoccidioidomicose, micose sistêmica mais comum na região geográfica da pesquisa, não foi encontrada em nenhum dos 52 pacientes avaliados; provavelmente, segundo os autores, porque o P. brasiliensis é sensível às sulfas usadas comumente na profilaxia para outras infecções nos pacientes com aids. Em outro estudo brasileiro geral de necrópsia, realizado em São José do Rio Preto, SP, Cury et al. (2003) confirmaram uma menor incidência de neoplasias em relação às doenças infecciosas nos pacientes com aids. Esses autores avaliaram 92 necrópsias de indivíduos com aids e relataram que 92% dos óbitos eram secundários às doenças infecciosas e apenas dois decorrentes de neoplasias. Nesse estudo não foi observado nenhum caso de SK e as neoplasias malignas encontradas foram três linfomas (dois não-hodgkin e um Hodgkin). Segundo esses autores, a baixa aderência ao tratamento antirretroviral e à profilaxia contra as infecções oportunistas favorece alta incidência de infecções oportunistas. No Hospital de Clínicas da UFTM, Micheletti (2007) pesquisou neoplasias benignas e malignas em 240 necrópsias de pacientes HIV positivos, no período de 1989 a 2004; para a publicação do artigo, os autores expandiram o estudo até 2008 (MICHELETTI et al., 2011). O sistema digestório estava comprometido em 10 (20,4%) de 49 casos que apresentavam neoplasias, tendo sido encontrados quatro SK, três adenocarcinomas (dois gástricos e um intestinal), um GIST e dois lipomas submucosos no intestino grosso.

28 Estudo brasileiro de necrópsias foi também realizado no estado do Amazonas, no período de 1996 a 2003 (SOUZA et al., 2008). Foram estudadas 129 necrópsias de pacientes com aids, 96 (74,4%) homens e 33 (25,6%) mulheres. A média de idade foi de 33,8±10,6 anos, sendo a faixa etária predominante no sexo feminino de 20 a 29 anos e, no sexo masculino, de 30 a 39 anos. As causas dos óbitos foram: tuberculose (28%), pneumonia bacteriana (17%), histoplasmose (13%), toxoplasmose (10%), pneumocistose pulmonar (8%), criptococose (5%), sepse bacteriana (4%), SK, meningoencefalite viral, cirrose hepática e síndrome diarréica (2% cada), leucemia linfocítica aguda, acidente vascular cerebral, meningite bacteriana, hepatite medicamentosa, linfoma, malária e pneumonia aspirativa (1% cada). Nesse estudo não há detalhamento das doenças em relação aos órgãos e sistemas comprometidos, tampouco referências sobre uso ou não de HAART. 4. A era pós-haart De doença invariavelmente fatal no início da pandemia, a aids passou por várias fases de expressão clínica e prognóstico, principalmente devido a descobertas na etiopatogênese, as quais possibilitaram avanços terapêuticos que resultaram em importantes mudanças na história natural da enfermidade (GALLO, 2006). A introdução de medicamentos antirretrovirais (HAART) no tratamento da doença permite, atualmente, sobrevida prolongada e com menor incidência de infecções oportunistas e neoplasias. De fato, vários trabalhos mostram alterações nas causas de óbitos de pacientes com aids nas épocas anterior e posterior à introdução da HAART. Há uma clara distinção nas causas de óbitos de pacientes com aids na fase pós-haart nos países desenvolvidos em relação aos países subdesenvolvidos relacionada às infecções oportunistas mais prevalentes em cada local e à possibilidade de acesso a cuidados médicos (LUCAS, 2012). Estudos clínicos europeus, americanos e canadenses relatam diminuição das taxas de mortalidade entre pacientes tratados com HAART, além de diminuição de infecções oportunistas e aumento das mortes por causas não relacionadas à aids (BEADSWORTH et al., 2009; CRUM et al., 2005; KRENTZ et al., 2005; SACKOFF et al., 2006). Dentre as doenças não relacionadas à aids relatadas como causas de óbitos nesses pacientes destacam-se as causas externas (overdose de drogas, suicídio, violência), doenças hepáticas e cardiovasculares, além das neoplasias malignas não relacionadas à aids. Os estudos clínicos e de necrópsias africanos, por sua vez, descrevem a persistência das doenças infecciosas, sobretudo

29 tuberculose, e condições relacionadas à aids como principais causas de óbitos nesses pacientes. Possíveis explicações para essas discrepâncias incluem acesso tardio à HAART e má adesão ao tratamento dos pacientes africanos (COX et al., 2012; ETARD et al., 2006; MZILENI et al., 2008). Um estudo clínico brasileiro avaliou 342 pacientes com infecção por HIV divididos em dois grupos: pré e pós-haart (NOBRE et al., 2003). Os autores mostram um aumento da prevalência da doença no sexo feminino: de uma proporção de cinco homens para cada mulher infectada no período pré-haart, para uma proporção de dois homens para cada mulher infectada, na fase pós-haart. Foram observados, ainda, diminuição da frequência de SK e histoplasmose no grupo pós-haart, e aumento da frequência de tuberculose e toxoplasmose no mesmo grupo. Os autores atribuem o aumento do número de casos de tuberculose e toxoplasmose, provavelmente, ao uso de métodos diagnósticos mais acurados. Nesse estudo foram comparados os achados das necrópsias de 20 pacientes com os diagnósticos clínicos e houve concordância em relação ao diagnóstico principal em 50% dos casos. Em relação às doenças do sistema digestório, vários estudos clínicos e em biópsias demonstram diminuição da incidência de infecções oportunistas após o advento da HAART (HUPPMANN e ORENSTEIN, 2010; MÖNKEMÜLLER et al., 2000, 2005; RAUFMAN, 2005; WALLACE e BRANN, 2000; WILCOX e SAAG, 2008). Huppmann e Orenstein (2010), em estudo descritivo em biópsias, relatam diminuição de cerca de 50% da frequência de doenças gastrointestinais a partir do início da HAART (1996) em relação aos anos anteriores. Essa diminuição pode ser vista numa comparação desse estudo com trabalho anterior (DIETERICH e ORENSTEIN, 2001): o primeiro trabalho mostrou alterações em 38% de 82 biópsias do cólon, antes da introdução da HAART, enquanto na pesquisa mais recente houve diminuição desse percentual para 19% dos casos. As mesmas doenças oportunistas foram diagnosticadas em ambos os trabalhos, porém, com diminuição de 50% da frequência no estudo mais recente. Os autores ressaltam, ainda, o aumento da frequência de infecção por H. pylori, provavelmente como resultado do aumento da sobrevida e do envelhecimento dos pacientes com aids tratados com HAART. Em estudo em biópsias do sistema digestório, Mönkemüller et al. (2000) descreveram o declínio da prevalência de doenças oportunistas ao longo de três anos durante o advento da HAART. Em 166 pacientes analisados, houve queda da prevalência de doenças oportunistas

30 de 69% no início do estudo, em pacientes que não usavam HAART, para 13% no fim do período, em pacientes tratados com HAART. As doenças oportunistas mais frequentes foram infecção por CMV e candidíase. Os autores observaram, ainda, aumento da frequência de doenças não oportunistas e de achados endoscópicos normais no fim do período estudado. Nesse estudo, a utilização ou não de HAART foi considerada apenas pelo período em questão, não havendo avaliação precisa a respeito do uso individual de HAART e da adesão ao tratamento. Os mesmos autores (MÖNKEMÜLLER et al., 2005), em estudo em biópsias de 294 pacientes com infecção por HIV, descreveram a presença de doenças oportunistas gastrointestinais em 27 de 105 (26%) pacientes em tratamento com HAART, enquanto que no grupo de pacientes sem tratamento com HAART, as doenças oportunistas foram encontradas em 33 (80%) dos 41 casos. Um grupo de 148 pacientes estava em uso de terapia antirretroviral sem inibidor de protease, não preenchendo os critérios de HAART desse estudo, tendo apresentado doenças oportunistas em 48% dos casos. Nesse estudo, 40% dos pacientes com doenças oportunistas gastrointestinais apesar da HAART não tiveram adesão adequada ao tratamento. Além da má adesão, outras possíveis causas da ocorrência de doenças oportunistas mesmo na vigência de HAART são, segundo os autores, resistência viral às drogas, interação entre drogas e diminuição da biodistribuição das mesmas. O trabalho de Nkuize et al. (2010) comparou os resultados de endoscopia digestiva alta em três grupos de pacientes: grupo I fase pré-haart (1991-1994), grupo II fase inicial da HAART (1999-2002), e grupo III HAART recente (2005-2008). Foram observados aumentos estatisticamente significantes nas frequências de doença do refluxo gastroesofágico, gastropatia inflamatória e úlcera gástrica nos grupos II e III. Infecção por Helicobacter pylori foi significantemente mais prevalente no grupo III. Concomitantemente, foram observadas reduções na frequência de esofagite por Candida sp, úlcera esofágica não específica e SK ao longo dos três períodos estudados. Ainda assim, os autores relatam a presença de esofagite por Candida sp em 23% dos pacientes do grupo II e em 16% dos pacientes do grupo III. Estudos de necrópsias na fase pós-haart são raros. Um estudo norte-americano em 394 necrópsias ao longo de 20 anos mostrou comprometimento do sistema digestório em 50% de 88 necrópsias realizadas de 1979 a 1986; 42% de 207 necrópsias realizadas de 1987 a 1995; e 42% de 99 necrópsias realizadas de 1996 a 2000 (MORGELLO et al., 2002). Esses

31 três períodos são chamados, respectivamente, de fases sem terapia antirretroviral, com terapia antirretroviral limitada e com terapia antirretroviral altamente eficaz (HAART). Os autores não descrevem em detalhes as doenças encontradas no sistema digestório, mas relatam comprometimento em 44% dos casos durante todo o estudo, além de declínio significante na frequência de SK. Desde 1996, há distribuição da HAART pelo Ministério da Saúde no Brasil, que garante acesso universal e gratuito aos medicamentos antirretrovirais. A partir de 1997 a HAART foi instituída para o tratamento da aids nos pacientes assistidos no Hospital de Clínicas da UFTM. Entretanto, a terapêutica antirretroviral não elimina a infecção por HIV, embora reduza a carga viral e aumente o número de linfócitos T CD4. Formas latentes do HIV estão presentes em linfócitos T CD4 já detectados no sangue periférico, no sistema digestório e em linfonodos, podendo existir em qualquer outro órgão que contenha tecido linfóide. Esses vírus latentes não são atingidos pela terapia antirretroviral e podem sofrer reativação mesmo durante a HAART. Além da reativação das formas latentes, outras causas de progressão da doença apesar da HAART incluem diagnóstico tardio, má-adesão ao tratamento, resistência e intolerância às múltiplas drogas utilizadas (MÖNKEMÜLLER et al., 2005; WILCOX e SAAG, 2008). 5. A importância das necrópsias na infecção por HIV/aids Existe uma tendência mundial de diminuição do número de necrópsias em decorrência da maior utilização de exames radiológicos e laboratoriais no diagnóstico antemortem (BURTON e UNDERWOOD, 2007). No entanto, a necrópsia continua importante ainda nos dias de hoje, visto que as taxas de discordância entre os achados antemortem e postmortem na aids variam de 42 a 74%. Apesar dos significativos avanços nos procedimentos diagnósticos, ainda acontecem diagnósticos falso-positivos e falso-negativos na ausência do exame de necrópsia (BEADSWORTH et al., 2009; LANJEWAR, 2011; SILVA, 2011; SILVA et al., 2012; SOUZA et al., 2008; WILKES et al., 1988). As necrópsias têm finalidade didática, de controle de qualidade do corpo clínico e, no contexto da aids, segundo Cox et al. (2010): É provável que novas síndromes não previstas possam surgir entre os pacientes tratados com HAART por longo tempo, que podem ser relacionadas a drogas ou novas condições relacionadas ao HIV; as necrópsias devem identificar esses casos.

32 O Hospital das Clínicas da UFTM constitui um centro regional de referência no diagnóstico e tratamento da infecção por HIV/aids. Nos últimos 20 anos a doença mais frequente em nossas necrópsias é aids (18% dos casos). Essas necrópsias são de alta complexidade devido às múltiplas infecções, muitas vezes concomitantes, frequentemente não características à macroscopia, necessitando ampla amostragem microscópica, diferentes técnicas de coloração e imuno-histoquímica, tornando-se um procedimento caro e que exige bastante tempo de trabalho dos patologistas e técnicos (SILVA, 2011; SILVA et al., 2012). Além disso, necrópsias são fundamentais para o controle de qualidade em um Hospital Universitário e tem auxiliado no conhecimento das doenças mais frequentes nos portadores de HIV/aids em nossa região, como após verificarmos, por exemplo, que nossa região é endêmica para histoplasmose (ADAD et al., 1996), auxiliando no manejo clínico dos pacientes. Ademais, acreditamos que o estudo dessas necrópsias de aids (355 casos em um total de 1965 necrópsias do Serviço nos últimos 22 anos) representa um retorno social e científico ao tempo e ao dinheiro investido nesses procedimentos, além de representarem também um controle de qualidade ao que é feito na Instituição, permitindo melhor conhecimento para adequação ao tratamento dos pacientes com aids com base nas afecções mais comuns no sistema digestório em nossa região, em uso ou não de HAART (SILVA, 2011; SILVA et al., 2012). Tendo em vista: A escassez de estudos de necrópsia avaliando especificamente o sistema digestório de pacientes com HIV/aids; A morbi/mortalidade das doenças digestivas na infecção por HIV/aids; As variações dos achados em diferentes regiões geográficas; A importância do advento da HAART na história natural da doença; e, O valor da necrópsia como controle de qualidade hospitalar; propomo-nos a avaliar as doenças do sistema digestório em necrópsias de indivíduos com HIV/aids na UFTM no período de 1989 a 2012, dividindo-os em três grupos (sem uso de drogas antirretrovirais, uso de uma ou duas drogas antirretrovirais, ou uso de HAART). Os objetivos incluem avaliação do impacto da HAART nas doenças do sistema digestório e da importância das doenças digestivas no óbito. O melhor conhecimento das alterações

33 gastrointestinais associadas ao HIV/aids poderá auxiliar nas condutas preventivas e terapêuticas de pacientes da nossa região e de outros locais.

34 Hipótese

35 Houve redução na frequência das doenças do sistema digestório em necrópsias de indivíduos com aids após o advento da HAART?

36 Objetivos

37 Com o intuito de contribuir para o conhecimento das alterações do sistema digestório que ocorrem na infecção por HIV/aids, pretende-se, neste estudo, em necrópsias de indivíduos com aids: 1. Descrever a frequência das lesões do sistema digestório globalmente, em todos os segmentos, e, separadamente, em cada segmento do sistema digestório; 2. Verificar se há correlação entre a frequência das lesões no sistema digestório e o uso ou não de HAART; 3. Verificar a correlação entre o tempo de sobrevida após o diagnóstico de HIV e o uso ou não de HAART 4. Descrever os tipos e as frequências das lesões do sistema digestório relevantes para o óbito dos pacientes.

38 Casuística e métodos

39 Trata-se de estudo retrospectivo do sistema digestório em necrópsias de indivíduos com infecção por HIV/aids realizadas na Disciplina de Patologia Especial/Serviço de Patologia Cirúrgica do Hospital de Clínicas da UFTM, no período de janeiro de 1989 a dezembro de 2012. O Hospital de Clínicas da UFTM está localizado na cidade de Uberaba, Minas Gerais, e comporta, atualmente, 292 leitos ativos, sendo 20 de UTI infantil, 10 de UTI adulto e 10 de UTI coronariano. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFTM (Anexo 1 Parecer Consubstanciado protocolo CEP/UFTM número 1871). A partir de 1989, quando foi realizada a primeira necrópsia de paciente com HIV/aids na UFTM, adotou-se a coleta sistemática de sangue em todos os casos de necrópsia, para realização de sorologia para HIV no Hemocentro Regional de Uberaba.

40 CRITÉRIOS DE INCLUSÃO Idade maior que 13 anos; Apresentar aids, diagnosticada em vida ou à necrópsia, segundo os critérios de classificação da infecção por HIV do CDC (Centers for Disease Control and Prevention), 1993. CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO Ausência de lâminas histológicas (necrópsia não concluída). Não se encontrar o prontuário clínico. SELEÇÃO DA AMOSTRA Foram revistos os registros de necrópsias e os resultados de sorologias para HIV arquivados no Serviço de Patologia Cirúrgica da UFTM de 1989 a 2012, nos quais estão relacionadas todas as necrópsias realizadas no serviço desde o seu início e os resultados de sorologias para HIV feitos a partir de 1989. Foram selecionados os casos com sorologia positiva para HIV e calculada a proporção desses casos em relação ao número total de necrópsias realizadas no serviço no período. 1. Metodologia para atender aos objetivos 1 e 2 (1. descrever a ocorrência das lesões do sistema digestório globalmente, em todos os segmentos, e separadamente, em cada segmento do sistema digestório; 2. verificar se há correlação entre a ocorrência das lesões no sistema digestório e o uso ou não de HAART). A - Coleta dos dados morfológicos O diagnóstico das lesões encontradas no sistema digestório foi feito através de revisão de lâminas histológicas arquivadas dos casos selecionados. Nas necrópsias realizadas na UFTM, após o exame macroscópico do cadáver, foram coletadas amostras dos segmentos do sistema digestório (língua, esôfago, estômago, intestino delgado e intestino grosso) posteriormente fixadas em formaldeído a 10%. A padronização de amostragem para

41 microscopia do sistema digestório no nosso serviço é confeccionar no mínimo um bloco contendo fragmentos de cada segmento sem alterações macroscópicas e fragmentos das lesões encontradas. Posteriormente, cortes histológicos foram preparados a partir dessas amostras e corados através da técnica de hematoxilina-eosina. Quando pertinente, procedeu-se à realização de técnicas histoquímicas especiais de coloração para a identificação de agentes infecciosos ou à revisão das mesmas, quando já existentes: Fite-Faraco para micobactérias; Grocott, PAS e mucicarmin para fungos. Foram revistos os cortes histológicos pela autora da tese e feitos cortes adicionais quando necessário. Apesar da padronização macroscópica, não havia cortes histológicos de todos os segmentos do sistema digestório em todos os casos, sendo os resultados apresentados na forma de números absolutos e porcentagem sobre o total de casos avaliados de cada segmento do sistema digestório. Foi elaborado um protocolo para o relato das alterações macro e microscópicas encontradas nos órgãos do sistema digestório (Anexo 2). Por fim, os resultados foram dispostos em uma tabela que continha as informações de todos os órgãos analisados em cada necrópsia (Anexo 3). A.1-Imuno-histoquímica Quando indicado, foi feito estudo imuno-histoquímico, ou revistas as lâminas previamente feitas, para confirmação microbiológica (anti-toxoplasma, anti-cmv, anti-hsv, anti-papilomavírus humano) e de neoplasias (anti-cd34 e anti-cd117). Empregou-se a técnica de polímeros, utilizando-se novos cortes do material incluído em parafina. Os novos cortes, com espessura de 4µm, foram dispostos em lâminas histológicas silanizadas (ATPS/Silano, A3648, Sigma ). A seguir, as lâminas permaneceram na estufa a 56 C por 24 horas. Em seguida, foram desparafinizadas em três banhos de xilol, permanecendo cerca de 5 minutos em cada um e hidratadas em 3 banhos de álcool absoluto e um banho de álcool a 80%, durante 10 segundos cada um. Posteriormente, as lâminas permaneceram em banho de PBS (ph 7,2) durante cinco minutos para hidratação. Logo depois, o excesso de tampão foi removido e a borda do corte cuidadosamente secada com papel absorvente. As lâminas foram colocadas em uma bandeja, adicionando-se água oxigenada a 3% sobre cada corte, durante dez minutos, para bloqueio da peroxidase endógena. Novamente foi feita a lavagem em PBS.

42 A seguir, foi feita a recuperação dos antígenos: foram colocados 250µl de tampão citrato ph 6 (Reagen) sobre as lâminas; essa incubação foi feita na panela Pascal (vapor de água a 121 C e 18psi) por 30 minutos. Após essa etapa, as lâminas foram novamente lavadas em 3 banhos de cinco minutos no tampão PBS e incubadas com seus respectivos anticorpos primários em torno de 18 horas, em câmara úmida com temperatura de 3 a 4 C. Os anticorpos foram diluídos em soro de albumina bovina (Sigma ) de acordo com as indicações presentes em suas especificações. Foram utilizados os seguintes anticorpos monoclonais: antitoxoplasma (Novocastra-NCL-TG-TP3) 1:1200; anti-citomegalovírus (Novocastra-NCL- CMV-pp65) 1:200; anti-herpes simples vírus (Dako-HSV Tipo I e Tipo II) 1:2000; antipapilomavírus (Dako-BVP-1) 1:800; anti-cd34 (Biocare Medical-CD34) 1:600; anti-cd117 (Zeta corporation-cd117-yr145) 1:600. Após incubação por toda a noite, as lâminas foram colocadas em temperatura ambiente, em torno de 15 minutos, lavadas em PBS e secas como anteriormente. O reagente pós-primário (Técnica de polímeros - Novolink - Novocastra ) foi adicionado em cada lâmina por 30 minutos à temperatura ambiente, em câmara úmida. Em seguida foram feitas 3 lavagens de cinco minutos cada uma em PBS e secaram-se as lâminas como anteriormente. Logo depois, o reagente Polímero (Técnica de polímeros - Novolink - Novocastra ) foi adicionado por 30 minutos nas mesmas condições acima. Após três lavagens em PBS, por cinco minutos cada uma, as lâminas foram reveladas através da adição de uma solução cromógena (Liquid DAB, Dako, Carpinteria, CA) por cinco minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadas e contra-coradas com hematoxilina de Harris por dois segundos. Finalmente, as lâminas foram imersas em 3 banhos de álcool absoluto por cerca de dez segundos cada um e, a seguir, utilizou-se entellan para a montagem das lamínulas. B - Coleta dos dados clínicos Durante a revisão dos prontuários anotou-se se os pacientes com aids faziam uso de medicações antirretrovirais ou não, quais as drogas utilizadas e por quanto tempo. Como HAART considerou-se o uso de, pelo menos, três medicamentos (dois inibidores da transcriptase reversa associados a um inibidor de protease ou a um inibidor não nucleosídeo da transcriptase reversa).