Macromoléculas Biológicas Objetivos Visualizar a estrutura tridimensional de peptídeos e proteínas, usando-se recursos computacionais. Montar modelos estruturais de proteínas, usando-se kit de plástico. Materiais 1. Computador imac; 2. Programa VMD (Visual Molecular Dynamics) para visualização de macromoléculas biológicas; 3. Kit de montagem de proteína Protein Folder ; 4. Arquivos com coordenadas atômicas de proteínas. Introdução Na análise da estrutura de uma proteína, podemos visualizar diferentes níveis de complexidade. Do mais simples para o mais complexo. A sequência de resíduos de aminoácidos é a estrutura primária. A identificação das partes da estrutura primária que formam hélices, fitas e laços é a estrutura secundária. As coordenadas atômicas de todos os átomos que formam a proteína é a estrutura terciária. Por último, se a proteína tem mais de uma cadeia polipeptídica, esta apresenta uma estrutura quaternária. A figura abaixo ilustra os níveis de complexidade estrutural para a proteína purina nucleosídeo fosforilase. Todas as proteínas têm até a estrutura terciária, as que apresentam mais de uma cadeia peptídica formando um oligômero têm estrutura quaternária. Figura 1. Níveis estruturais das proteínas. A proteína mostrada na figura é a purina nucleosídeo fosforilase humana. A tabela 1 mostra a denominação para as principais estruturas quaternárias de proteínas Tabela 1. Principais estruturas quaternárias de proteínas. Estrutura quaternária Número de monômeros Dímero 2 Trímero 3 Tetrâmetro 4 Pentâmero 5 Hexâmero 6 Heptâmero 7 Octâmero 8 1
Procedimento 1) CDK2 Ao entrar em processo de divisão, a célula eucariótica segue uma série de eventos chamados de ciclo celular. A figura abaixo ilustra tais eventos (figura 2). Figura 2. Progressão do ciclo celular (fonte: http://en.wikipedia.org/wiki/cell_cycle). G 0 é a fase quiescente, G 1 é chamado gap 1 (intervalo 1), onde a célula aumenta de tamanho. S (síntese), quando ocorre a replicação do DNA. G2 é o gap 2, a célula continua a crescer, este é o intervalo entre a replicação do DNA e a mitose (fase M). Para passar de G 1 para S (etapa onde ocorre a replicação do DNA) é necessário que uma proteína esteja ativa, a CDK2, sigla em inglês para Cyclin-Dependent Kinase 2, ou seja, quinase dependente de ciclina 2. Para sua ativação a CDK2 precisa ligar-se numa outra proteína, chamada ciclina, e sofrer fosforilação no resíduo Thr 161 e desfosforilação nos resíduos Thr 14 e Tyr 15, como indicado no diagrama abaixo (figura 3) (CANDURI & DE AZEVEDO, 2005). Figura 3. Ativação da CDK2. Fosforilação do resíduo Thr 161 pelo complexo CDK7-ciclina H e desfosforilação dos resíduos Thr 14 e Tyr 15 pela fosfatase cdc25 (Fonte: CANDURI & DE AZEVEDO, 2005). 2
Descobriu-se que, aproximadamente 50 % dos tumores cancerígenos apresentam mutação no gene que codifica uma proteína inibidora de CDK2, ou seja, há uma correlação entre a não inibição de CDK2 e câncer. Tal observação levou à procura de pequenas moléculas (moléculas com massa molecular menor que 1000 Dáltons) que pudessem inibir a CDK2, e apresentarem atividade anticancerígena. Para isto foi elucidada a estrutura tridimensional da CDK2, a partir da técnica de cristalografia por difração de raios X. O estudo da estrutura permitiu a identificação do sítio ativo da CDK2 e o desenho de inibidores competitivos. A figura 4 ilustra a estrutura da CDK2 com um fármaco anticancerígeno, chamado roscovitine (DE AZEVEDO et al., 1997). Figura 4. Estrutura tridimensional da CDK2 em complexo com o fármaco roscovitine. A estrutura da CDK2 é formada por dois lóbulos, um com preponderância de fitas beta (terminal N) e outro com preponderância de hélices alfas, o inibidor liga-se no sítio ativo localizado entre estes dois lóbulos. Carregar coordenadas atômicas da proteína CDK2 (arquivo CDK2.pdb) no programa VMD. Visualizar a proteína nos seguintes esquemas de visualização (Graphics Representations Drawing Method nas opções: line, VDW, CPK e NewCartoon; 2) Montagem de Modelos Estruturais Os canais de K + dependentes de voltagem são de fundamental importância na sinalização nervosa (comunicação entre a célula pré-sináptica e célula pós-sináptica), assim qualquer interferência com esta proteína transmembranar pode ter efeitos danosos à transmissão do sinal nervoso. Algumas espécies de escorpião tiram vantagem disso para paralisar suas presas. Podemos pensar no veneno de escorpiões como um coquetel de peptídeos e proteínas. Um dos componentes do veneno do escorpião (Leiurus quinquestriatus hebraeus)(figura 5) apresenta uma neurotoxina, formada por um peptídeo de 38 resíduos de aminoácidos (agitoxina 2), que bloqueia o canal de K + dependente de voltagem, paralisando sua vítima. 3
Figura 5. Escorpião Leiurus quinquestriatus hebraeus (Fonte da foto: http://www.latoxan.com/venom/scorpion/leiurus-quinquestriatus-hebraeus.php) Carregar coordenadas atômicas da proteína (arquivo agitoxina2.pdb) no programa VMD. Visualizar a proteína no seguinte esquema de visualização (Graphics Representations Drawing Method na opção: NewCartoon. No Coloring Method na opção Secondary Structure. Faça um esboço (desenho) da estrutura secundária da Agiotoxina 2. Use o kit de montagem Protein Folder e monte a estrutura que você está visualizando na tela. 3) Visualização da Hemoglobina S A partir da elucidação da estrutura tridimensional da hemoglobina (uma proteína formada preponderantemente por hélices) foi possível identificar as bases estruturais da patologia conhecida como anemia falciforme. Tal doença é caracterizada pela mutação de um resíduo de aminoácido da hemoglobina. A mutação é de glutamato para valina, na posição 6 da cadeia beta. Esta denominação de cadeia beta não está relacionada com a estrutura secundária. Pessoas com tal patologia apresentam problemas de circulação devido à perda de flexibilidade da hemácia. Vamos visualizar a estrutura da hemoglobina de pessoas que apresentam tal mutação. Carregar coordenadas atômicas da hemoglobina S (arquivo hemoglobinas.pdb) no programa VMD. Visualizar a proteína nos seguintes esquemas de visualização (Graphics Representations Drawing Method NewCartoon. No Coloring Method na opção Chain. Você tem na tela a estrutura da hemoglobina S, presente em pacientes com anemia falciforme. Qual a estrutura quaternária desta proteína? (Use a Tabela 1) A mutação que leva à anemia falciforme ocorre na posição 6 das cadeias betas ( chains B e D). Clique no VMD main em Extension -> Analysis->Sequence viewer. Com esta opção você pode 4
identificar o resíduo da posição 6 das cadeias B e D. O resíduo esperado nesta posição é um glutamato (Glu). Qual o resíduo da posição 6 da cadeia beta? O resíduo modificado encontra-se na superfície da proteína? Por que esta mutação causa a patologia conhecida como anemia falciforme? 4) Visualização da Protease do HIV A AIDS surgiu como pandemia há algumas décadas atrás e causou grande temor, pois inicialmente não havia conhecimento da sua causa. O estudo da AIDS registra um dos maiores sucessos da moderna abordagem do desenho de fármacos, usando-se recursos computacionais. A AIDS é causada pelo HIV. Os vírus são formados por uma capa de proteína que envolve seu material genético, no caso do HIV é o RNA. Aqui descreveremos o uso da protease do HIV, como alvo para o desenvolvimento de fármacos contra a AIDS. As proteases são enzimas que catalisam a clivagem de outras proteínas, a protease do HIV catalisa tal clivagem. Esta protease realiza uma importante etapa no ciclo da infecção viral. Como em outros vírus, o HIV leva a célula infectada a produzir muitas cópias de suas proteínas. Tais proteínas apresentam-se inicialmente como uma cadeia polipeptídica (poliproteína), que apresenta várias proteínas coladas numa cadeia. A função da protease do HIV é catalisar a clivagem da poliproteína em unidades menores funcionais. A correta execução de tal clivagem é crítica para o processo de infecção viral. A poliproteína intacta é necessária no início do processo de infecção, quando monta a forma imatura do vírus. Em seguida a poliproteína tem que ser clivada, para formar o vírus maduro, que pode então infectar uma nova célula. As reações de clivagem da poliproteína têm que ser coordenadas perfeitamente, o que permite a montagem do vírus. Devido a tal sensibilidade e seu papel essencial para infecção viral, a protease do HIV é um alvo importante para o desenho de fármacos contra a AIDS. A inibição da protease do HIV impede a maturação do vírus, cessando a progressão da infecção. Repita o procedimento visto anteriormente para as outras estruturas e visualize a estrutura da protease do HIV, arquivo hiv_prot.pdb. Referências: ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Célula. 4a edição. Artmed editora, Porto Alegre, 2004 (Capítulo 3). DE AZEVEDO WF, LECLERC S, MEIJER L, HAVLICEK L, STRNAD M, KIM SH. Inhibition of cyclin-dependent kinases by purine analogues: crystal structure of human cdk2 complexed with roscovitine. Eur J Biochem. 1997; 243(1-2): 518-26. CANDURI F, DE AZEVEDO WF Jr. Curr Computer-Aided Drug Design 2005; 1(1): 53-64. LESK, A. M. Introduction to Protein Architecture. Oxford University Press, New York, 2001. BRANDEN, c. & TOOSE, J. Introduction to Protein Structure. 2nd Ed. Garland Publishing, Inc. New York, 1999. http://www.ks.uiuc.edu/research/vmd/ http://www.fi.muni.cz/usr/mejzlik/mirrors/www.nyu.edu/pages/mathmol/software.html http://www.rcsb.org/pdb/ 5