ESTUD FITQUÍMIC DA ESPÉCIE VEGETAL Physalis angulata Lin. (CAMAPÚ) PR HPLC Luziane da Cunha BRGES 1 (IC) (Bolsista PIBIC/CNPq) luziane_borges22@yahoo.com Wannigleice de Sousa AMRIM 1 (IC) (Bolsista PIBIC/CNPq) Geyse do Carmo Diniz SAMPAI 2 (PG) Danila Teresa Valeriano ALVES 2 (PG) Prof. Dr. Milton Nascimento da SILVA 3 (PQ) (rientador) yumilton@yahoo.com.br 1 Instituto de Ciências Exatas e Naturais/UFPA, Faculdade de Química, Curso de Química Industrial. 2 Instituto de Ciências Exatas e Naturais/UFPA, Faculdade de Química, Pós-graduação em Química. 3 Instituto de Ciências Exatas e Naturais/UFPA, Faculdade de Química, Pesquisador-CNPq/UFPA. RESUM No Pará encontram-se diversas espécies vegetais usadas popularmente para fins terapêuticos. Dentre essas espécies encontra-se Physalis angulata Lin. (Família Solanaceae) que é uma planta considerada daninha conhecida popularmente como camapú, dispersa em vários estados do Brasil e em vários continentes, esta espécie P. angulata é amplamente utilizada na medicina popular devido possuir metabolitos secundários, os quais apresentam propriedades anticoagulante, antileucêmica, anti-inflamatória, anticâncer, analgésica e entre outras. Por esta razão, este trabalho buscou realizar o estudo fitoquímico do extrato etanólico de todas as partes de P. angulata Lin. extrato foi fracionado em coluna cromatográfica via úmida filtrante (Cromatografia clássica), obtendo seis frações (v/v): Hex/AcEt (90:10), Hex/AcEt (70:30), Hex/AcEt (50:50), AcEt (100) e AcEt/MeH (80:20) e MeH (100). E estas foram analisadas por cromatografia em camada delgada comparativa (CCDC) e por HPLC. Após o desenvolvimento e otimização de um método, duas substâncias presentes no extrato foram isoladas: fisalina D (S1), fisalina G (S2). As substâncias isoladas pertencem à classe dos vitaesteróides, sendo suas estruturas posteriormente elucidadas através de técnicas espectroscópicas de RMN uni e bidimensionais. Palavras-chave: Physalis angulata Lin., vitaesteróides e fisalina. Área: Química Sub-área: Química rgânica Área temática: PRDUTS NATURAIS (PNAT) 1- INTRDUÇÃ Brasil, com a grandeza de seu litoral, de sua flora e, sendo o detentor da maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta, não pode abdicar de sua vocação para os produtos naturais. A Química de Produtos Naturais (QPN) é, dentro da Química brasileira, a área mais antiga e a que, talvez ainda hoje, congregue o maior número de pesquisadores (PINT et al., 2002). As plantas são fontes indispensáveis da medicina popular desde tempos imemoriais. uso de plantas para fins medicinais são considerados como as primeiras formas de uso de medicamentos que se tem conhecimento (MTA, 2004). Registros apontam que o uso de plantas medicinais já era evidenciado há 60.000 anos tanto na cultura ocidental como na oriental, como também em países desenvolvidos e não desenvolvidos. 684
De maneira indireta, este tipo de cultura medicinal desperta o interesse de pesquisadores em estudos envolvendo áreas multidisciplinares, como por exemplo, botânica, farmacologia e fitoquímica, que juntas enriquecem os conhecimentos sobre a inesgotável fonte medicinal natural: a flora mundial (MACIEL et al., 2002). Plantas da família Solanaceae têm sido usadas como medicamentos desde a antiguidade como: Mandragora officinarum e Antropa belladonna. Espécies do gênero Physalis (Solanaceae), têm sido amplamente utilizadas na medicina popular devido as suas propriedades anticâncer e antileucêmica, (CHIANG et al., 1992a, 1992b), imunomodulatórias, (LIN et al., 1992), assim como no tratamento da dermatite e reumatismo. Estudos recentes avaliam a potente ação dessa família no tratamento da leishmaniose (GUIMARÃES, 2009). De acordo com a literatura diversas atividades na espécie Physalis angulata Lin. já foram estudadas e comprovadas. Na medicina popular, os extratos ou infusos da planta tem sido utilizado em vários países para o tratamento de diversas doenças, como malária, asma, hepatite, dermatite e reumatismo (LIN et al., 1992). A partir destas considerações e diante da importância da pesquisa química de produtos naturais para a obtenção de novos compostos com finalidade terapêutica, este trabalho trata da avaliação do perfil químico do extrato etanólico de P. angulata Lin. buscando isolar e identificar as substâncias presentes no extrato. 2- BJETIVS 2-1 - GERAL Estudar o perfil químico do extrato etanólico da espécie Physalis angulata Lin. (camapú) por HPLC e fornecer base para a produção de fitoterápicos. 2-2 - ESPECÍFICS Estudar quimicamente o extrato etanólico de Physalis angulata, visando isolar os principais constituintes químicos, utilizando a técnicas cromatográficas; Identificar as estruturas isoladas utilizando técnicas espectrométricas de RMN (uni e bidimensionais); 3- METDLGIA 3-1 - CLETA D MATERIAL VEGETAL PARA ANÁLISE FITQUÍMICA Espécies de Physalis angulata Lin. foram coletados no município de Boa Vista do Acará, no estado do Pará. 3-2 - BTENÇÃ D EXTRAT BRUT material botânico de Physalis angulata L. foi seco em estufa com temperatura máxima de 40ºC, em um período de sete dias, sendo posteriormente trituradas em moinho de facas, obtendo-se um total de material seco e moído de 500 g. Este material foi submetido a cinco extrações (com 100g cada extração) a quente por Sohxlet com solvente etanol grau PA em um tempo de 5 dias por 7 horas cada. solvente foi eliminado em evaporador rotativo sob pressão reduzida obtendo o extrato etanólico bruto (50 g). 3-3 - FRACINAMENT CRMATGRÁFIC D EXTRAT ETANÓLIC DE P. angulata Lin. extrato etanólico bruto (50 g) foi fracionado por CCVU (Coluna Cromatográfica por Via Úmida filtrante), utilizando-se misturas de solventes com polaridade crescente, obtendo seis frações (v/v): Hex/AcEt (90:10), Hex/AcEt (70:30), Hex/AcEt (50:50), AcEt (100) e AcEt/MeH (80:20) e MeH (100) (Tabela 1). 685
Extrato etanólico Frações (v/v) Massa F1 Hex/AcEt (90:10) 2,25 g F2 Hex/AcEt (70:30) 1,94 g 50 g F3 Hex/AcEt (50:50) 826,7 g F4 AcEt (100) 4,25 g F5 AcEt/MeH (80:20) 16,6 g F6 MeH (100) 8,07 g Tabela 1 Tabela com a massa inicial do extrato e suas respectivas frações após o fracionamento. Rendimento de 67,9 %. Após um pré-tratamento as três últimas frações foram analisadas no HPLC (por apresentar mais massa), numa eluição em gradiente (com fase móvel composta por solvente A = Água e B = Acetonitrila, variando-se de 5 a 100% do modificador orgânico (B), no tempo de 60 minutos de análise), obtendo-se os cromatogramas; como resultados, estes mostraram que a fração F4 (Acetato de etila 100 %), mostrou ser promissora por apresentar maior concentração de compostos. E como esta detinha da maior concentração de compostos julgou-se necessário refraciona-la. A fração F4 (4,25 g) foi refracionada por CCVU, utilizando-se misturas de solventes com polaridade crescente, em um volume calculado de 500 ml de cada sistema: Hexano/Acetato de etila/metanol (50:47,5:2,5; 50:45:5; 50:40:10; 30:60:10), Acetato de etila/metanol (90:10) e Metanol (100). Foram obtidas 78 frações, as quais foram analisadas por CCDC (Cromatografia em Camada Delgada Comparativa) e a partir dos resultados algumas frações foram reunidas, foi observado que alguns compostos de interesse encontravam-se na reunião 39-41 (169,9 mg), na fração 43 (30 mg) e na fração 49 (20,1 mg) que provavelmente apresentou uma substância isolada de acordo com analises por HPLC. Com o objetivo de otimizar o método para o isolamento das substâncias de interesse, realizou-se o perfil cromatográfico das frações Fr.39-41, Fr.43 e Fr.49 do refracionamento da fração F4 (Acetato de etila 100%), relatado anteriormente. Considerando o estudo de SNYDER e colaboradores (1997), é possível propor valores desejáveis para o fator de retenção k (k = 5; k = 10; k = 20), com base nos tempos de retenção da última banda. tempo de retenção para a reunião 39-41 foram próximos a 27 minutos. Com isso, foi calculado um valor teórico para o percentual do modificador orgânico baseado nos estudos de SNYDER. Para se estimar um valor de percentual do modificador orgânico, optou-se por uma separação com k = 10 e foi sugerido um sistema isocrático. s sistemas propostos por SNYDER, entretanto, não foram eficientes, uma vez que não foi observado uma boa seletividade entre os compostos, havendo a necessidade de uma otimização. Com isso foi escolhido o seguinte sistemas: 36% (Fração 39-41). A análise em um sistema no modo isocrático ainda não foi realizada para a fração 49 já que a mesma possui uma substância isolada de acordo com analises espectrométricas de RMN. 4- RESULTADS E DISCUSSÃ 4-1 - PERFIL CRMATGRÁFIC D EXTRAT ETANÓLIC DE P. angulata Lin. Para realizar o perfil cromatográfico, uma alíquota de 10 miligramas do extrato foi submetida à um pré-tratamento por Extração em Fase Sólida (SPE), objetivando-se reter as impurezas e/ou interferentes, deixando apenas passar os componentes de interesse. A solução obtida foi posteriormente analisada por HPLC, obtendo o perfil cromatográfico na busca do melhor sistema para isolamento das substâncias. 686
25.555/86849 3.630/187719 mau Ch2-227nm,4nm (1.00) 200 175 150 125 100 75 50 25 0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 min Figura 1- Perfil cromatográfico do extrato etanólico. Fase móvel composta por H 2/ACN variando de 5 a 100% em um tempo de 60 minutos, em modo linear e vazão de 1 ml/min. Detecção de UV, = 227 nm. a- ANÁLISE DAS TRÊS ULTIMAS FRAÇÕES BTIDAS PR CCVU. uv 450000 400000 350000 300000 250000 Azul: F4 (AcEt 100%) Vermelho: F5 (Hex/AcEt 20%) Verde: F6 (MeH 100%) 200000 150000 100000 50000 0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0 32.5 35.0 37.5 40.0 42.5 min Figura 2- Sobreposição dos cromatogramas obtidos a partir das análises das frações F4, F5, F6. Fase móvel composta por H 2 /ACN variando de 5 a 100% em um tempo de 60 minutos, em modo linear e vazão de 1 ml/min. Detecção de UV, = 227 nm. Analisando os cromatogramas obtidos das três últimas frações da CCVU, bem como suas absorções no ultravioleta, foi observado que a F4 (Acetato de etila 100 %) detinha da maior concentração de compostos no comprimento de onda de 227 nm. Com isso, o isolamento das substâncias foi realizado mediante análise apenas dessa fração, a qual foi refracionada como relatado anteriormente. 4-2 - ISLAMENT DAS SUBSTÂNCIAS DE INTERESSE DA REUNIÃ 39-41 PR HPLC-DAD. Depois de determinado o melhor sistema de separação das substâncias no modo isocrático, a substância presente na reunião 39-41 foi isolada em um cromatógrafo liquido em escala semi-preparativa. Como fase estacionária, utilizou-se uma coluna semipreparativa Gemini C18 5 μm (250 x 10 mm), com fluxo de 4,7 ml/min. Como fase móvel, utilizou-se mistura composta pelos solventes H 2 /ACN 64:36 v/v. 687
25.648/1216351 9.675/41516 45.0 Até o presente momento foram isoladas as substâncias S1 da reunião 39-41 e S2 da fração 49. mau Ch1-227nm,4nm (1.00) 42.5 40.0 37.5 S1 35.0 32.5 30.0 27.5 25.0 22.5 20.0 17.5 15.0 12.5 10.0 7.5 5.0 2.5 0.0-2.5-5.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 min Figura 3- Cromatograma no modo de eluição isocrático da reunião 39-41. Fase móvel H 2 /ACN 64:36 e vazão de 1 ml/min. Detecção de UV, = 227 nm. 2500 mau Ch1-227nm,4nm (1.00) 2250 2000 1750 1500 S2 1250 1000 750 500 250 0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 min Figura 4- Cromatograma no modo de eluição em gradiente da fração 49. Fase móvel H 2 /ACN variando de 5 a 100% em um tempo de 60 minutos, em modo linear e vazão de 1 ml/min. Detecção de UV, = 227 nm. 688
4-3 - CNSTITUINTES QUÍMICS ISLADS DS TALS DE Physalis angulata Lin. Na investigação química das partes de P. angulata Lin. foram isoladas duas substâncias, pertencentes a classe dos vitaesteróides (fisalinas). Todas foram isoladas via HPLC em escala semi-preparativa. A determinação estrutural das substâncias isoladas foi feita com base na análise dos dados espectrométricos de RMN de 1 H, 13 C, DEPT, HSQC, HMBC e CSY 1 H x 1 H e por comparação com informações encontradas na literatura. 4-3-1 ESTRUTURAS DAS SUBSTÂNCIAS ISLADAS H H H Elucidação estrutural da fisalina D H H Elucidação estrutural da fisalina G 5- CNCLUSÕES As duas substâncias isoladas no presente estudo: substância S1 e substância S2, foram identificadas estruturalmente através de análises espectrométricas de RMN como fisalina D e fisalina G respectivamente, todas pertencentes a classe dos vitaesteróides. 689
6- REFERÊNCIAS ALVES, D. T. V. Estudo fitoquímico de Physalis angulata Lin. (CAMAPÚ) por HPLC, Dissertação de mestrado, UFPA, 2012. BALANDRIN, M.F., KLCKE, J. A., WURTELE, E. S., BLLINGER, W. H., Natural plant chemicals: sources of industrial and medicinal materials. Science, v. 228, Issue 4704, 1154-1160. BRESLIN, T. M. B.; FILH, V.C. Ciências Farmacêuticas: Contribuição ao Desenvolvimento de Novos Fármacos e Medicamentos. Itajaí: UNIVALI, 2003. 239p. HAWKES, J. G. Solanaceae III taxonomy chemistry evolution. Richmond, Surrey, UK: The Royal Botanic Gardens Kew, 1991. LRENZI, H., MATS, F. J. A., Plantas medicinais no Brasil nativas e exóticas. 1. Ed. Nova dessa. SP: Instituto Plantarum de Estudos da Flora, 2002. MACIEL, M. A. M., PINT, A. C., JUNIR, V. F. V. Plantas medicinais: a necessidade de estudos multidisciplinares. Química Nova, vol. 25, Nº.3, 429-438, Rio de Janeiro, 2002. MTA, D. K. A. S.; JAYME, L. S. G.; CARM, F. M.; RIBEIR, J. B. C.; SUZA, R. B. L.; LIVEIRA, T. L. S.; SANTS, E. N. Plantas medicinais indicadas como antiinflamatórios por raizeiros da região de Goiânia. Infarma, Brasília, v. 16, n. 1-2, p. 81-82, 2004. PINT, A. C. et al. Produtos Naturais: Atualidade, desafios e perspectivas. Química Nova, v.25, p.45-61, 2002. SILVA, M. T. G., SIMAS, S. M., BATISTA, T. G. F. M., CARDARELLI, P., TMASSINI, T. C. B., Studies on antimicrobial activity, in vitro, of Physalis angulata L. (Solanaceae) fraction and physalin B bringing out the importance of assay determination. Mem. Inst. swaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 100(7): 779-782, November 2005. SNYDER, L. R., KIKERLAND, J., GLAJCH, J. L. Pratical HPLC Method Development. 2ª ed. Jonh Wiley & Sons, inc. p. 282-287, 1997. TMASSINI, T. C. B, BARBI, N. S., RIBEIR, I. M., XAVIER, D. C. D., Gênero Physalis Uma revisão sobre vitaesteróides. Química Nova, v. 23 n. one, p.47-57, Rio de Janeiro - RJ, 2000; 690