Resistência de Bactérias a Antibióticos Catarina Pimenta, Patrícia Rosendo Departamento de Biologia, Colégio Valsassina Resumo O propósito deste trabalho é testar a resistência de bactérias (Escherichia coli) quando estas estão em contacto com antibiótico e diferentes concentrações do mesmo. Aplicamos um protocolo adaptado de Haddix et al. (2). Foi possível verificar o número de colónias existentes em cada placa e comparar o resultado com as variações de concentração do medicamento, tendo por base a teoria de Charles Darwin. Constatámos que a E. coli com o passar dos dias, foi manifestando uma certa adaptação às condições do meio com antibiótico. Palavras-Chave: Escherichia coli, Ampicilina, resistência, selecção natural Introdução Este trabalho tem como principal objectivo verificar a evolução da resistência de certas bactérias neste caso das E. Coli à Ampicilina e a relaciona-lo com a selecção natural. As bactérias são organismos unicelulares, procariontes, que podem ser encontrados na forma isolada ou em colónias. Estas são microrganismos constituídos por uma única célula, sem núcleo organizado nem organelos, que se reproduzem por reprodução assexuada através de mitoses sucessivas, diferindo-se, apenas, dos progenitores devido as mutações que ocorrem durante a divisão. Para combater estes organismos são usados antibióticos, porém o seu uso excessivo e um pouco desequilibrado tem feito com que as bactérias ganhem resistência a estes antibióticos. Esta é desenvolvida de várias formas dependendo dos modos de acção do antibiótico. Muitas pessoas pensam que a resistência aos antibióticos é somente um problema dos que abusam dos antibióticos, mas isso não é a realidade. Quando as pessoas não fazem um uso correcto dos antibióticos, é a saúde pública que está em risco. Mesmo que já não tome antibióticos há muito tempo, uma infecção causada por bactérias resistentes pode ser mais difícil de tratar. Um antibiótico é definido como sendo uma substância de origem tanto biológica como sintética que actua especificamente sobre uma etapa essencial do metabolismo das bactérias, tal como a síntese proteica ou de ácidos nucleícos, ou destruindo a sua membrana citoplasmática. Tal como diferentes tipos de bactérias têm formas distintas de acção, também os antibióticos resistam de maneiras diferentes à sua actuação, nomeadamente: mudando a permeabilidade da sua membrana celular podendo evitar a entrada do antibiótico, levando à sua saída do meio intracelular ou ainda adquirindo a habilidade de degradar e/ou inactivar o antibiótico. Esta resistência pode ser conseguida de duas maneiras: uma mutação espontânea num grupo de células que leva à formação de genes presentes nas bactérias mutantes que lhes conferem uma característica que permita os métodos de resistência referidos ou a transferência de genes entre microrganismos, que até podem ser de espécies de micróbios não relacionadas. Segundo Darwin, o antibiótico é um factor de selecção que seleciona as bactérias que resistem à acção dos antibióticos e elimina as bactérias que não apresentam resistência. Depois de um determinado tempo, tais bactérias remanescentes reproduzem-se, aumentam a sua população e, quando são submetidas a uma eventual acção de antibióticos, não são eliminadas, pois são resistentes, descendentes das bactérias iniciais. A Escherichia coli é uma bactéria bacilar. É a mais comum e uma das mais antigas bactérias simbiontes do homem. O seu habitat natural é o lúmen intestinal dos seres humanos e de outros animais de sangue quente. A E. coli é um dos poucos seres vivos capazes de produzir todos os componentes de que é feita, a partir de compostos básicos e fontes de energia suficientes. Para este trabalho utilizou-se uma colónia-mãe de E. coli para criar uma população de bactérias, sendo que, como já foi referido anteriormente como a multiplicação de bactérias se dá por mitose, todas as bactérias serão em princípio geneticamente iguais, sendo que apenas pode haver diferenças genéticas através da acumulação de mutações espontâneas, dependendo a frequência dessas bactérias mutantes da pressão selectiva do meio, neste caso concreto, a presença de antibiótico ou não no meio de cultura.
Material e Metodologia Os procedimentos usados neste projecto foram adaptados a partir de Haddix et al. (2) O protocolo foi modificado pela substituição da bactéria original pela E.coli, pelas técnicas de esterilização (teve-se que utilizar álcool para limpar as bancadas e alguns utensílios; usar chama de uma lamparina para esterilizar algum material antes do seu uso; e uma panela de água a ferver para goblés ou tinas, em que o uso da chama era inviável) e na preparação do meio LB visto não possuirmos hidrogenofosfato de sódio substituímos por o hidrogenofosfato de magnésio de modo a manter o par ácidobase responsável pelo efeito tampão. O design experimental utilizado encontra-se apresentado na fig. 1. 2 Figura 1: - Design experimental Apresentação e Tratamento de Resultados Abaixo estão apresentados os resultados obtidos na experiência e os respectivos gráficos que incluem o tratamento de resultados com base na média e desvio padrão dos valores. - AP A 1 ⁶ 1 ⁷ 1 ⁸ 1 ⁹ 1 ¹⁰ 37 21 24 21 19 M+Dv 57 35 36 4 28 M-Dv 17 7 12 2 11 Desvio 2 14 12 19 9 Tabela I: - AP A
3 +AP A 1 ² 1 ³ 1 ⁴ 1 ⁵ 1 ⁶ 46 62 42 47 151 M+Dv 79 148 1 99 273 M-Dv 12-24 -17-6 29 Desvio 34 86 58 52 122 Tabela II: +AP A -AP B 1 ² 1 ³ 1 ⁴ 1 ⁵ 1 ⁶ 8 1 15 1 9 M+Dv 12 14 29 16 14 M-Dv 3 5 3 3 Desvio 4 4 15 7 6 Tabela III: - AP B + AP B 1 ⁶ 1 ⁷ 1 ⁸ 1 ⁹ 1 ¹⁰ 25 35 15 86 17 M+Dv 59 58 248 16 23 M-Dv -9 11-38 65 1 Desvio 34 23 143 21 6 Tabela IV: +AP B Grupo A -AP 4 3 2 1-1 1 ⁶ 1 ⁷ 1 ⁸ 1 ⁹ 1 ¹⁰ - Desvio Figura 2: Grupo A -AP
4 Grupo A +AP 2 15 1 5-5 - Desvio 1 ² 1 ³ 1 ⁴ 1 ⁵ 1 ⁶ Figura 3: Grupo A +AP Grupo B -AP 3 2 1-1 1 ² 1 ³ 1 ⁴ 1 ⁵ 1 ⁶ - Desvio Figura 4: Grupo B -AP Grupo B +AP 8 6 4 2-2 -4 1 ⁶ 1 ⁷ 1 ⁸ 1 ⁹ 1 ¹⁰ - Desvio Figura 5: Grupo B +AP Discussão de Resultados Na colónia parental não existia nenhuma bactéria resistente ao antibiótico, visto que quando no dia1 foi adicionada ampicilina nas placas da cultura-mãe nenhuma sobreviveu. Pode-se especular que não havia, nas bactérias da amostra retirada da cultura-mãe, resistentes a este antibiótico. Mesmo assim o resultado é um pouco abrupto quando relacionado com os restantes grupos de placas, admite-se, portanto, que seja possível que tenham ocorrido erro na aplicação do protocolo. Ao contrário do esperado, a frequência de células resistentes nas culturas + AP foi elevada e verificou-se que as células presentes nas culturas +AP eram mais que nas AP. Nas culturas +AP, aquelas que continham ampicilina, onde se pensava que a resistência das bactérias ao antibiótico fosse menor, não o foi, mas sim o oposto.
A célula original não deveria ser resistente à ampicilina, visto que após a formação da cultura-mãe, nenhumas das células pertencentes à mesma, que foi toda gerada pela mesma célula, sobreviveu à acção do antibiótico. As bactérias multiplicam-se através de reprodução assexuada, normalmente por bipartição, sendo assim todas as células são geneticamente iguais, porém a ocorrência de mutações durante esse processo é uma explicação para o facto das células se terem tornado resistentes ao antibiótico ao longo do tempo. As diferenças entre os grupos A e B relacionam-se com a existência ou não de antibiótico nos tubos. O grupo A não contém antibiótico e o B contém. Esperava-se que, por ordem crescente de resistência, as bactérias resistissem menos no grupo B +AP, em seguida ou no grupo B AP ou então no grupo A +AP e por fim no grupo A AP, este último, não contém qualquer tipo de antibiótico. Todavia não ocorreu o esperado, o grupo onde as células bacterianas resistiram menos foi no B, sem ampicilina, de seguida no grupo A, também sem ampicilina, tal é pouco natural, devido ao grupo B, como já foi referido anteriormente, ser aquele que contém ampicilina no tubo, logo deveria ser o que não continha o antibiótico o mais resistente. Era esperado que a taxa de crescimento das bactérias fosse crescendo com o aumento da diluição. Este até foi bastante semelhante para as diferentes concentrações de placas dentro do mesmo grupo. Uma explicação pode ser devido ao tempo de incubação ter sido alargado face a não terem existido resultados no tempo previsto. Isso poderá ter conduzido a que as colónias de bactérias nas diferentes concentrações atingissem um estado terminal de crescimento onde se verifica uma estabilização do seu processo de multiplicação que a partir de um determinado momento se torna independente do tempo de incubação. Posteriormente, a nível de resistência as bactérias no grupo B com ampicilina, foram mais resistentes que as do grupo A, este resultado também não era esperado, visto que o grupo B tem mais antibiótico que o A. Embora nem todos os resultados obtidos sejam totalmente credíveis, já que, em alguns, existe alguma discrepância de valores, como se pode observar nos gráficos a cima representados, pode afirmar-se que foram cumpridas todas as normas mínimas contra a contaminação das placas e restantes materiais por parte de outras espécies bacterianas. Conclusão Este projecto permitiu-nos verificar a actuação das leis da selecção natural, desenvolvidas maioritariamente por Charles Darwin, e o modo como estas regem o mundo vivo que nos rodeia. Após a elaboração desta experiência e da análise dos seus resultados pôde concluir-se que os valores obtidos não foram os esperados. Este facto pode ser justificado com base na falta de meios para a esterilização do material ou mesmo a adaptação das bactérias ao antibiótico utilizado. O desenvolvimento deste trabalho foi-nos portanto fundamental para consolidar e aprofundar os conhecimentos que tinham sido anteriormente abordados numa vertente teórica e ainda nos permitiu comprovar que nem todas as experiências nos permitem alcançar os resultados inicialmente previstos. 5 Bibliografia http://pt.wikipedia.org/wiki/bact%c3%a9ria http://pt.wikipedia.org/wiki/escherichia_coli http://www.darwin29.pt/img/upload/resistencia_final(1).pdf Haddix, P.; Paulsen, E.; Werner, T. (2). Bioscene. v26, p1-21.