VIABILIDADE DE Metarhizium anisopliae IMPREGNADO EM PANOS PRETOS EXPOSTOS A CONDIÇÕES AMBIENTAIS VISANDO O CONTROLE DE Aedes aegypti

VIABILIDADE DE Metarhizium anisopliae IMPREGNADO EM PANOS PRETOS EXPOSTOS A CONDIÇÕES AMBIENTAIS VISANDO O CONTROLE DE Aedes aegypti Aline Teixeira Carolino, Adriano Rodrigues de Paula, Simone Azevedo Gomes, Anderson Ribeiro, Richard Ian Samuels Universidade Estadual do Norte Fluminense-RJ, Laboratório de Entomologia e Fitopatologia teixeira_a@yahoo.com.br; biodepaula@yahoo.com.br; simoneazgomes@yahoo.com.br; anderson.ribeirorj@yahoo.com.br; richard@uenf.br Resumo Fungos entomopatogênicos são potenciais candidatos para o controle de mosquitos em condição de laboratório e semicampo. Entretanto, no campo efeitos ambientais podem diminuir a persistência e viabilidade dos conídios. O presente estudo investigou a viabilidade da formulação do fungo (F) formulado com óleo vegetal (V) e óleo isoparafina (I) [50:50] impregnado em panos pretos mantidos por diferentes períodos numa varanda e depois testados contra fêmeas de A. aegypti. As infecções dos insetos foram feitas em condição de laboratório. Os panos pretos com F+V+I foram mantidos em condições ambientais sem radiação solar direta por 2, 6, 12, 18, 24 e 30 dias. Após cada período de tempo 1 cm 2 do pano foi colocado em eppendorfs com 1 ml de Tween 80 (0,05%). A suspensão foi misturada vigorosamente e pulverizada sobre fêmeas de A. aegypti utilizando uma Torre de Potter. As infecções feitas com F+V+I oriundo do pano mantido por 2, 6 ou 12 dias na varanda resultaram nas menores taxas de sobrevivência de insetos comparado com outros tratamentos. A formulação F+V+I reduziu significativamente a sobrevivência de A. aegypti. Palavras-chave: Fungo entomopatogênico. Panos pretos. Aedes aegypti. Dengue. Área do Conhecimento: Ciências Biológicas. Introdução A dengue representa uma das maiores preocupações dos órgãos de saúde, fato esse devido ao crescente número de casos notificados (PORTAL DA SAÚDE, 2013). A doença é transmitida por mosquitos do gênero Aedes, principalmente pelo Aedes aegypti. A intensa utilização de inseticidas químicos contra mosquitos tem ocasionado o desenvolvimento de insetos resistentes (RANSON et al., 2001; BRAGA & VALLE, 2007; WONDJI et al., 2008). O controle biológico tem sido amplamente estudado.as bactérias entomopatogênicas são os agentes de controle de larvas mais utilizados em todo o mundo com destaque para as espécies Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) e Bacillus sphaericus que possuem elevadas propriedades larvicidas (WIRTH et al., 2000). Os fungos entomopatogênicos também se mostram promissores. Diferente das bactérias, a ação dos fungos não está restrita somente às larvas. Há a possibilidade de infecção desde o ovo até o estágio adulto do inseto (SCHOLTE et al., 2004; LUZ et al., 2008; PAULA et al., 2008; PEREIRA et al., 2009; PAULA et al., 2013). Entretanto, um dos maiores desafios da utilização de fungos em condições de campo são às condições ambientais, que podem reduzir viabilidade dos conídios (BRAGA, et al., 2001; HEDIMBI et al., 2011). Panos pretos impregnados com fungo têm sido utilizados em condição de laboratório, semicampo e campo contra mosquitos vetores da dengue (PAULA et al., 2008, PAULA et al., 2013) e malária (SCHOLTLE et al., 2005). Estudos têm mostrado que a combinação do fungo com óleo vegetal ou mineral pode melhorar a eficácia desses microorganismos em ambientes hostis, protegendo os conídios de fatores deletérios, principalmente dos raios UV (ALVES et al., 1998; WRIGHT et al., 2004; BUKHARI et al., 2011). O presente estudo teve como objetivo investigar a viabilidade do fungo M. anisopliae formulado em óleo vegetal e óleo isoparafina impregnado em pano preto e exposto a condições ambientais. Metodologia Criação de Aedes aegypti Os mosquitos A. aegypti foram criados no insetário do Laboratório de Biotecnologia do Centro de Biociências e Biotecnologia (CBB/UENF). Para a manutenção da colônia, um camundongo imobilizado em malha de arame foi exposto aos mosquitos para alimentação sanguínea. As fêmeas realizaram a postura de ovos em papel filtro forrados no interior de copos de plásticos com 100 ml com 50mL de água. A 1

eclosão das larvas foi estimulada com a imersão do papel filtro em bandejas com água de torneira, previamente tratada com ração de gato moída (0,05 g) até atingirem a fase de pupa. Após o surgimento das pupas (2 a 3 dias) estas foram retiradas das bandejas, adicionadas em copos de plásticos com água e mantidas em gaiolas (20 x 20 x 30 cm) para a emergência dos adultos. Fêmeas com idade entre 2 e 3 dias foram usadas nos ensaios. Preparação da suspensão fúngica O fungo M. anisopliae isolado ESALQ 818 descrito como de alta virulência contra A. aegypti em condições de semicampo (CAROLINO, 2012) foi utilizado nos testes. Primeiro o fungo foi cultivado em meio SDA (Dextrose, Peptona, Extrato de levedura, Ágar e água destilada) a 27 durante 14 dias. Posteriormente os conídios foram removidos das placas e adicionados a Erlenmeyers contendo 25 g de arroz parboilizado com 10 ml de água destilada previamente autoclavados a 121 por 20 min. Os frascos foram incubados em câmara de germinação a 27 C por 14 dias e posteriormente os conídios foram separados do arroz utilizando uma máquina separadora (Mycoharvester Inglaterra). As suspensões foram preparadas utilizando 4 g do fungo na concentração 1x10 8 conídios/ml -1 previamente determinada utilizando a câmara de Neubauer. pulverizada, utilizando uma Torre de Potter (Burkhart Ltd. Reino Unido), diretamente sobre fêmeas de A. aegypti, previamente adormecidas com CO 2. Após a pulverização os insetos foram colocados em potes de plástico (12 cm de diâmetro x 7 cm de altura) com 10 insetos/pote recobertos com pano organza branco. Para todos os grupos foram oferecidos diariamente discos de papel filtro embebido em sacarose a 10% colocado sobre a superfície dos potes. Sobrevivência dos insetos foi determinada diariamente por 7 dias e os insetos mortos foram removidos durante as observações. Todas as experimentos foram realizadas três vezes, com um mínimo de 30 insetos por tratamento ou controle. A homogeneidade dos experimentos replicados foi determinada pelo teste de Log-rank no nível de significância de 95% e, posteriormente, os resultados foram agrupados para análise da curva de sobrevivência (teste de Gehan-Breslow- Wilcoxon). Infecção de fêmeas de A. aegypti com F+V+I impregnado em panos pretos mantidos numa varanda A virulência do fungo M. anisopliae (F) formulado em óleo vegetal de girassol (V) - Sadia Ltd. Brasil + óleo sintético isoparafma (I) - BroadLub Ltd. Brasil foi avaliada ao longo do tempo contra fêmeas de A. aegypti. Panos de algodão pretos (20 x 10 cm) foram esterilizados e imersos numa suspensão de conídios (200 ml). Os panos foram em seguida deixados a secar durante 16 horas numa sala com temperatura controlada (26 ºC, 71 ± 7% de HR e 12h L). A concentração final de conídios no pano foi aproximadamente de 1x10 8 conídios cm 2. Os panos pretos foram pendurados em uma estante e mantidos em uma varanda coberta, sem exposição à luz solar direta, por seguintes períodos: 2, 6, 12, 18, 24 e 30 dias (Figura 1). Após cada período de tempo, peças de 1cm 2 do centro dos panos foram removidas e colocadas em eppendorfs com 1 ml de Tween 80 (0,05%). A suspensão de esporos foi agitada vigorosamente utilizando um vortex e a suspensão foi Figura 1 Panos pretos pendurados e mantidos numa varanda coberta, sem exposição à luz solar direta por: 2, 6, 12, 18, 24 e 30 dias. Resultados A Tabela 1 mostra que os mosquitos pulverizados com a suspensão de F+V+I oriunda do pano preto mantido na varanda por 2 dias apresentaram a menor taxa de sobrevivência (28,8%) e o menor valor de S 50 (5 dias), comparado com os outros tratamentos e grupo controle [F 6,20 = 20,42 (p<0,01)]. A maior porcentagem de sobrevivência (75,5%) ocorreu quando os insetos foram pulverizados com a suspensão de conídios oriundos de panos 2

Sobrevivência (%) formulados com V+I mantido por 30 dias na varanda. A análise de variância (ANOVA) e o teste post-hoc de Duncan mostraram que as taxas de sobrevivência de A. aegypti expostas aos panos mantidos por 2, 6 e 12 dias na varanda foram significativamente diferentes da sobrevivência do controle [F 6,20 = 20,42 (p<0,01)]. Entretanto os períodos subseqüentes (18, 24 e 30 dias) resultaram em taxas de sobrevivência iguais ao controle (p>0,01). O maior valor de S 50 dos insetos foi de 7 dias, resultado encontrado quando a infecção foi feita usando suspensão do F+V+I do pano mantido por 12 dias na varanda. Para os demais períodos (18, 24 e 30 dias) não foi possível determinar o valor de S 50. A Figura 2 mostra as taxas de sobrevivência diárias dos mosquitos A. aegypti pulverizados com suspensão de F+V+I Tabela 1 Sobrevivência (%) ± Desvio Padrão (DP) e Tempo Médio de Sobrevivência (S 50 ) das fêmeas de A. aegypti pulverizados com F+V+I oriundo de panos pretos mantidos em uma varanda por diferentes períodos. O tratamento controle foi feito com V+I. Períodos em que os panos foram mantidos numa varanda % Sobrevivência ± DP S 50 2 dias 28,8 ± 8,35c 5 6 dias 41,1 ± 7,29cb 6 12 dias 48,8 ± 6,26b 7 18 dias 60,0 ± 4,70a ND 24 dias 70,0 ± 3,43a ND 30 dias 75,5 ± 2,47a ND CONTROLE 76,6 ± 2,08a ND DP = Desvio padrão. ND = Dados não determinados. Valores seguidos de mesma letra não apresentam diferença estatística pelo teste post-hoc de Duncan (5% probabilidade). 100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 DIAS 0 dias 6 dias 12 dias 18 dias 24 dias 30 dias Controle Figura 2 Sobrevivência diária (%) de fêmeas pulverizadas com F+V+I oriundo de panos pretos mantidos em uma varanda por diferentes períodos. O tratamento controle foi feito V+I. Discussão Os resultados mostraram progressivos e graduais efeitos negativos das condições ambientais na viabilidade de conídios causando redução da eficiência do fungo ao longo do tempo contra o mosquito da dengue. Suspensões de F+V+I oriundo de panos que ficaram até 12 dias expostos às condições ambientais resultaram nas menores taxa de sobrevivência de insetos. Isso sugere que panos pretos impregnados com F+V+I devam ser substituídos de residências por volta de 12 dias. O óleo vegetal e o óleo isoparafina aqui utilizados mostraram-se promissores e já foram relatados como adjuvantes potenciais na proteção aos conídios do fungo M. anisopliae (ALVES et al., 1998; ALVES & FARIA, 2010). Superfícies pretas são conhecidas por atrair uma gama de espécies de mosquitos (HECHT & HERNANDEZ-CORZO, 1963), embora outros estudos tenham mostrado que os objetos de baixa reflexão e de cor sólida foram os mais atraentes para o sexo masculino e feminino de A. aegypti (MUIR et al.,1992). A eficiência da utilização dos panos pretos impregnados com fungo contra A. aegypti tem sido observado em condição de laboratório e semicampo (PAULA et al., 2008; PAULA et al., 2013b). A persistência do fungo impregnado em pano preto contra o mosquito da dengue foi recentemente observada numa simulação de um cômodo residencial onde panos com F+V+I reduziu significativamente a sobrevivência de fêmeas de A. aegypti, comparado com tratamento controle (CAROLINO, 2012). Estudos utilizando panos pretos com F+V+I em residências estão em andamento. Entretanto, ainda existem algumas preocupações da eficiência de fungos no campo, principalmente em países de clima tropical e subtropical, fato esse atribuído pela influência dos raios UV na redução da persistência e virulência dos conídios (RANGEL et al., 2005; LEUCONA et al., 2001). Nesse estudo a redução da viabilidade e virulência do fungo foi observada a partir do 12 dia e pode ter tido influência por altas temperaturas encontradas durante o período experimental. A cidade de Campos dos Goytacazes se caracteriza por ter altas temperaturas e durante os experimentos registramos valor de temperatura de 36.6 ºC. Howard et al. (2011) observaram que a perda da viabilidade de conídios de B. bassiana ocorreu quando a temperatura no campo chegou a atingir 38.6 C. Redução de viabilidade de conídios também foi relatada por Darbro & Thomas (2009) que, em laboratório, evidenciaram zero viabilidade dos conídios do fungo M. anisopliae a partir do 21 dia. Frente a esse problema, estratégias de engenharia genética vêm aos poucos ganhando 3

espaço e se mostrando promissora, sendo o principal objetivo das pesquisas o de melhorar a termotolerância dos conídios e consequentemente seu rendimento no campo (LENG et al., 2011). O presente estudo mostrou a redução da sobrevivência dos mosquitos A. aegypti infectados com suspensões de F+V+I oriundos de pano preto mantidos em condições ambientais. Taxas de sobrevivência menores que 50% foram observadas nos panos que ficaram na varanda por até 12 dias. A formulação F+V+I impregnada em pano preto provavelmente reduzirá a sobrevivência do mosquito da dengue em condição de campo. Conclusão Panos pretos impregnados com fungo e mantidos em condições ambientais causaram por até 12 dias significativa redução da sobrevivência de fêmeas de A. aegypti. Panos pretos usando F+V+I apresenta potencial para ser colocados em residências visando o controle do mosquito da dengue. Agradecimentos À UENF e FAPERJ projetos: E-26/111.586 /2008, E-26/110.341/2010 e E-26/102.860/2011. Referências - ALVES, R.T., BATEMAN, R. P., PRIOR, C., LEATHER, S. R. Effects of simulated solar radiation on conidial germination of Metarhizium anisopliae in different formulations. Crop Protection. V. 17, p.675-679, 1998. - ALVES, R.T., FARIA, M. Pequeno manual sobre fungos entomopatogênicos. Documentos. 1 ed. Planaltina: Ed. Embrapa Cerrado, 2010. - BRAGA, G. U. L., FLINT, S. D., MILLER, C. D., ANDERSON, A. J., ROBERTS, D. W. Variability in response to UV-B among species and strains of Metarhizium isolated from sites at latitudes from 61 N to 54 S. Journal of Invertebrate. V. 78, p. 98-108, 2001. - BRAGA, I.A., VALLE, D. Aedes aegypti: histórico do controle no Brasil. Epidemiologia e Serviços de Saúde. V. 16, n.2, p. 113 118, 2007. - BUKHARI, T., TAKKEN, W., KOENRAADT, C.J.M. Development of Metarhizium anisopliae and Beauveria bassiana formulations for control of malaria mosquito larvae. Parasites & Vectors.V. 4, p.1-14, 2011. - CAROLINO, A. T. Formulação em óleo aumenta a persistência do fungo entomopatogênico para uso no controle do mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). 2012. 68f. Dissertação (Mestrado em Produção Vegetal) Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, 2012. - DARBRO, J.M., THOMAS, M. Spore Persistence and Likelihood of Aeroallergenicity of Entomopathogenic Fungi Used for Mosquito Control. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. V. n.6, p. 992 997, 2009. - HECHT, O., HERNANDEZ-CORZO, J. On the visual orientation of mosquitoes in their search of resting places. Entomologia Experimentalis et Applicata. V. 6, p. 63-74, 1963. - HEDIMBI, M., NDEUYEKA, E., CHINSEMBU, K.C. Effects of sunscreens on germination of fungi Metarhizium anisopliae with a view to enhance conidia survival under field conditions. Journal of Microbiology and Antimicrobials. V. 3, p. 248-253, 2011. - HOWARD, A.F.V., N GUESSAN. R., KOENRAADT, C.J.M., ASIDI, A., FARENHORST, M., AKOGBÉTO, M., KNOLS, B.G.J., TAKKEN, W. First report of the infection of insecticide-resistant malaria vector mosquitoes with an entomopathogenic fungus under field conditions. Malaria Journal. V.10, p. 1-8, 2011. - LENG, Y., PENG, G., CAO, Y., XIA, Y. Genetically altering the expression of neutral trehalase gene affects conidiospore thermotolerance of the entomopathogenic fungus Metarhizium acridum. BMC Microbiology. V. 11, p. 1-8, 2011. - LEUCONA, R.E., EDELSTEIN, J.D., BERRETTA, M.F., ROSSA, F.R.L., ARCAS, J.A. Evaluation of Beauveria bassiana (Hyphomycetes) Strains as Potential Agents for Control of Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae). Journal of Medical Entomology. V. 38, p. 172-179, 2001. - LUZ, C., TAI, M.H.H., SANTOS, A.H., SILVA, H.H.G. Impact of moisture on survival of Aedes aegypti eggs and ovicidal activity of Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz.V.103, n.2, p.214-215, 2008. 4

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