Fusão da proteína cry com a proteína poleidrina

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1 Fusão da proteína cry com a proteína poleidrina ¹Karolene Miranda da Silva; ²Berghem Moraes Ribeiro 1 Aluna do Curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi ; e- mail:karol.aps@uft.edu.br PIBIC/UFT 2 Orientador(a) do Curso de Engenharia de Biprocessos e Biotecnologia; Campus de Gurupi; Berghem@uft.edu.br RESUMO O teste de patogenicidade e Bioensaios seletivo com isolados de Bacillusthuringiensis efetivos sobre fases imaturas Sitophiluszeamaisfoi estado com 66 estirpes de B. thuringiensisfoi determinado pelo presente trabalho. O isolamento das linhagens de Bacillusthuringiensis foi realizado a partir de amostras de solo, provenientes dediferentes localidades rurais dos xx municípios do estado do Tocantins onde se verificou o formato de margens irregulares, opacas e esbranquiçadas. Na criação de Sitophiluszeamaisfoi feita em frascos de vidro com uma porcentagem de milho e com setentainsetosnão-sexados. O teste de patoginecidade foi realizado com dói protocolos de bioensaois. Os bioensaios constituíram inicialmente na triagem das estirpes de B thuringiensis, na busca de selecionar as estirpes que obtiverem um caráter patogênico para o controle de S.zeamais.As estirpes foram cultivadas em meio NYSM. Já no bioensaio seletivo foi selecionadas vinte gramas de milho e colocada em copos descartáveis e vinte adultos S.zeamaisnão-sexado e foi inoculado por um minuto em um meio contendo B.thuringiensise a avaliação foi feita em intervalos de 25 a 60 dias após o tratamento. A taxa de mortalidade foi calculada pela diferença entre o número de insetos emergidos dos tratamentos e os emergidos da testemunha. As estirpes que obtiveram taxa de mortalidade acima de 50% serão novamente testadas através de bioensaios com suspensão de B.thuringiensisde3x10 8 esporos/ml. Palavras chaves: Bt,Sitophiluszeamais,Patogenicidade

2 INTRODUÇÃO No Brasil, são produzidas, em média, 30 milhões de toneladas de grãos de milho (Zeamays) porano, provenientes de, aproximadamente, 57% da área nacional ocupada com cultivo de cereais. o milho não somente é utilizado de forma direta na dieta humana e de animais, como também tem valor industrial para produção de bebidas,medicamentos, tintas,plásticos, explosivos, etc. (LOGUERCIO Et.al,2012) e muito utilizado na produção de biodiesel(dantas 2006 a;santos,n.a.,2006 e PARENTE,2003) Perdas qualitativas e quantitativas ocorrem durante o armazenamento de sementes e grãos pela ação de pragas. Estima-se que as perdas quantitativas anuais causadas por pragas durante o período de armazenamento de grãos são da ordem de 10% da produção mundial, sendo similares no Brasil, conforme LORINI (1993). Dentre as principais culturasque sofrem ataques de pragas durante o período de armazenamento está o milho (ZeamaysL.)que é considerado um ingrediente básico das rações, e pode sofrer grandes perdas e variações em sua qualidade e quantidade devido à infestação de insetos e ácaros, infecção fúngica, presença de micotoxinas, tipo de híbrido, e condições climáticas (LAZZARI, 1997).Causando inúmeros prejuízos, como: redução da massa e daqualidade dos grãos (GUEDES, 1990/91; LORINIe SCHNEIDER, 1994) e redução da germinaçãodas sementes (SANTOS et al, 1990). As toxinas bacterianas com atividade inseticidas potencialmente aplicadas no controle de insetos- praga das plantas cultivadas e vetores de doenças animais e humanas foram casualmente descobertasno final do século XIX, Como característica de bactérias entomopatogênicas potencialmente aplicadas no controle microbianode insetos destacase as espécies que apresentam alta virulência, elevada capacidade invasorae produção de toxinas, causando toxemias nos insetos alvo. Com essas características, na categoriade bactérias esporulantes destacam-se como gêneros de maior importância: Bacilluse Clostridium Steinhaus (1947).

3 MATERIAIS E METODOS Linhagens e isolamento de linhagens de Bacillusthuringiensis O isolamento das linhagens de Bacillusthuringiensis foi feito a partir de amostras de solo, provenientes de diferentes localidades rurais dos xx municípios do estado do Tocantins e fez a correção do solo onde foram feitas analises químicas. Para o isolamento a partir de solo, um grama de cada amostra, foi colocado em tubos esterilizados, com 10 ml de solução salina esterilizada e agitado em agitador tipo vortex`` por 2 minutos. Em seguida, 1,5 ml foram transferidos para tubo tipo eppendorf`` esterilizado e submetido a aquecimento por 12 minutos a 80 C e 5 minutos no gelo, para a eliminação de células vegetativas. As amostras forma diluídas 10 e 100 vezes em solução salina esterilizada, uma alíquota de 100 µl da ultima diluição foi distribuída em placa de petri contendo ágar nutritivo. O material foi mantido em uma câmera incubadora Biological Oxigen Demand(B.O.D.), 30 ± 0,5 ºC por 48 horas. E posteriormente a incubação as colônias isoladas de Bacillus spp. Foram selecionadas, levando em consideração aspectos morfológicos, como forma circular, bordas ondulados, elevação, estrutura, tamanho e coloração (World Health Organization, 1985). Testes de Patogenicidade Foi realizado dois bioensaios no qula um era seletivo inicialmente selecionamos as estirpes que poderiam ter alta patogenicidade para o controle de S.zeamais.As estirpes foram cultivadas em meio NYSM por 48 horas Após o cultivo, a suspensão foi submetida à centrifugação para a obtenção do sedimento, sendo o mesmo submetido a três centrifugações (1.800 x g por 30 min) consecutivas com água destilada e esterilizada a fim de lavá-lo e eliminar o meio de cultura. Em seguida, foram preparadas suspensões, onde uma alíquota de 0,5 ml foi diluída 100 vezes em água destilada e esterilizada, foi padronizado através de contagemde esporos em hematocitômetro na concentração final de 3x10 8 esporos/ml.no bioensaio seletivo foi utilizado copos descartáveis que continham furo na tampa para a passagem de oxigênio e vedada por um tecido fino Onde que em cada copo continha vinte gramas de milho com vinte

4 adultos S.zeamais não-sexado para a ovoposição durante três dias.depois desse período os insetos foram retirados e submersos por um minuto em suspensão preparada contendo B.thuringiensis.Em seguida foi transferida para uma câmera laminar para a retirada de excesso de umidade e depois foi mantida em temperatura ambiente.a avaliação foi feita no período de 25 a 60 dias após a aplicação do tratamento.ataxa de mortalidade foi calculada pela diferença entre o numero de insetos emergidos dos tratamentos e os emergidos da testemunha. RESULTADOS E DISCUSSÃO Foram testadas 66 estirpes de B. thuringiensis para os bioensaios seletivos. Dessas, 22 ocasionaram uma percentagem significativa de mortalidade em S.zeamais. Ao passo que dentre essas, oito ocasionaram mortalidade acima de 50%. Em especial, as estirpes 5814XII com 84% de mortalidade, 12I com 76,1%; Miranorte com 69,05% e KCL II com 67,3%, que mostraram um grande potencial entomopatogênico.. Podem-se notar diferenças notórias entre os efeitos de mortalidade entre as estirpes testadas, como é o caso da estirpe 8414XIII, com 84,69% e a estirpe 8414XVIII, com 28,5%. Essas diferenças de efetividade das estirpes sobre S.zeamais pode ser explicada por vários fatores como inserção na membrana da bactéria, grupo de enzimas destoxificadoras que degradam a toxina, não ativação da protoxina (Da Silva, 2008). Os testes seletivos utilizando a suspensão de B.thuringiensisde3x10 8 esporos/ml estão em andamento e posteriormente será determinada a CL50. Após os ensaios de mortalidade utilizando a CL50, as estirpes que mostrarem grande potencial de mortalidade para S.zeamais, serão selecionadas para ensaios moleculares com o objetivo de amplificar o gene da toxina. Com relação aos ensaios com larvas de A. aegypti, enfrentamos vários obstáculos para manter os objetivos iniciais desse projeto como falta de estrutura dos laboratórios, falta de recursos para compra de reagentes para os ensaios moleculares, a limitação de espaço para criação de A. aegypti como também o baixo número disponível de indivíduos desse inseto, visto que outros pesquisadores também utilizam da criação de para seus trabalhos. Dessa forma, buscando alternativas viáveis para a condução de um projeto que pudesse ser exequível em tempo hábil, optamos por desenvolver o trabalho utilizando estirpes isoladas de B. thuringiensise o gorgulho do milho S.

5 zeamais visto que essa espécie tem grande importância como uma das principais pragas do milho e por ser fácil sua criação e manutenção em laboratório. LITERATURA CITADA ARAUJO, A.P., MELO-SANTOS M.A.V., CARLOS, S. O., RIOS E.M.M., REGIS LÊDA. Evolution of an experimental product based on Bacillus thuringiensis sorovar. Israelensis against Aedes aegypti larvae (Diptera: Culicidae). Biological Control. v.41, p BANGS, M,J., LARASATI, R.P., CORWIN, A.L., WURYADI, S. Climatic factors associated with epidemic dengue in Palembang, Indonesia: implications of short-term meteorological events on virus transmission. Southeast Asian Journal Tropic Medicine Public Health. v.37, p , BESERRA, E. B., FERNANDES, C. R.M., QUEIROGA, M. F. C., CASTRO JR. F. P. Resistência de Populações de Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae) ao Organofosforado Temefós na Paraíba. Neotropical Entomology, v. 36, p , 2007 BERNHARD, K., JARRET, P., MEADOWS, M., BUTT, J., ELLIS, D.J. ROBERTS, G. M., PAULI, S., RODGERS, P. BURGES, H.D. Natural isolates of Bacillus thuringiensis: Worldwide distribution, characterization, and Active against insect pest. Journal of Invertebrate Pathology BRAGA, I.A., JOSÉ BENTO PEREIRA LIMA, J.B.P., SOARES, S.S., VALLE, D. Aedes aegypti Resistance to Temephos during 2001 in Several Municipalities in the States of Rio de Janeiro, Sergipe, and Alagoas, Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. v.99, p , AGRADECIMENTOS "O presente trabalho foi realizado com o apoio da UFT