EFICIÊNCIA DE ESTIRPES DE Bacillus thuringiensis CONTRA Spodoptera frugiperda (*)

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1 EFICIÊNCIA DE ESTIRPES DE Bacillus thuringiensis CONTRA Spodoptera frugiperda (*) José Dijair Antonino de Souza Junior (UFPE), João Batista dos Santos (EBDA), Claudia Maria Fontes de Oliveira (Centro de Pesquisas Ageu Magalhães), Eugênia Rios (Bioticom Ltda), José Ednilson Miranda (Embrapa Algodão), Wagner Alexandre Lucena (Embrapa Algodão / wagner@cnpa.embrapa.br) RESUMO - O algodão é a fibra vegetal mais utilizada e cultivada no mundo, devido às poucas exigências de solo e clima, podendo ser produzido praticamente em todos os continentes. O algodoeiro é hospedeiro de um complexo de pragas, que podem ocasionar danos nas raízes, caule, folhas, botões florais, flores, maçãs e capulhos. A lagarta-militar, Spodoptera frugiperda, é conhecida no Brasil por causar grandes danos ao milho, porém é praga também do algodão e arroz. Nos últimos anos a S. frugiperda tem atacado cada vez mais o algodoeiro provocando sérios danos principalmente nos estados de Mato Grosso, Goiás, Bahia e Paraíba. Biolarvicidas a base de bactérias entomopatogênicas tem sido utilizados em larga escala em diversos programas de controle de pragas e vetores com grande sucesso. Neste trabalho foram avaliadas 13 cepas autóctones de Bacillus thuringiensis (Bt), com o objetivo de detectar novas toxinas contra S. frugiperda. Duas cepas apresentaram eficiência de controle superior a produtos comerciais, com mortalidades de 94,4% e 64,4% dos insetos ensaiados. Palavras-chave: Bacillus thuringiensis, proteínas Cry, bioloarvicidas. EFFICIENCY OF STIRPIS OF Bacillus thuringiensis AGAINST Spodoptera frugiperda ( * ) ABSTRACT - Cottons is the vegetal fiber most used and cultivated in the world, mainly because it demands low requirements regarding weather and sole conditions, being able to be produced in almost all continents. The cotton is host of a pest complex, which can cause damage to the roots, stem, leaves, flowers and fruits. The armworm, Spodoptera frugiperda, is known in Brasil by causing major corn damages, but it s also a cotton and rice pest. In the last years, S. frugiperda has attacked more and more cotton causing serious damage mainly in Mato Grosso, Goiás, Bahia and Paraíba states. Entomopathogenic bacteria biolarvicides has been applied in a wide range in many pest and vectors control programs with great success. This work analyzed 13 Bacillus thuringiensis (Bt) local strains, with the objective of detecting new toxins against S. frugiperda. Two strains showed higher control efficiency than commercial products, with mortality ranging from 64.4% to 94.4% of the tested insects. Key words: Bacillus thuringiensis, Cry proteins, bioloarvicide. INTRODUÇÃO O cultivo do algodão (Gossypium hirsutum L.), como toda cultura agrícola, apresenta uma série de riscos. O algodoeiro é atacado por um complexo de pragas que, sem as devidas medidas de controle, podem reduzir significativamente a produção. Uma praga cuja importância econômica tem crescido ano a ano na cultura do algodão, principalmente nas áreas agrícolas do cerrado brasileiro é a lagarta-militar, Spodoptera spp. (Lepidoptera: Noctuidae), cujos ataques severos podem reduzir significativamente a produção de fibra (MIRANDA e SUASSUNA, 2004).

2 Em plantas de algodão, após três a quatro dias da postura, dos ovos eclodem as lagartas que iniciam a alimentação raspando o parênquima das folhas. À medida que vão crescendo, as lagartas passam a se alimentar com maior voracidade, perfurando folhas, brácteas, flores e maçãs do algodão. No início da fase larval, o inseto destrói a epiderme das brácteas dos botões, flores e maçãs. Lagartas maiores danificam o interior das flores ou a base das maçãs (OLIVEIRA et al., 2001). A possibilidade de introdução no país de plantas geneticamente modificadas e seu cultivo em larga escala faz com que as preocupações acerca dos danos ocasionados por estes insetos sejam ainda maiores, visto que, dentre os lepidópteros-praga que atacam o algodão, a lagarta militar é um dos insetos menos suscetíveis às endotoxinas do Bacillus thuringiensis kurstaki, expressas pelo algodão transgênico (MACINTHOSH et al., 1990). O presente estudo visou avaliar a eficiência de estirpes de Bacillus thuringiensis no controle de Spodoptera frugiperda. MATERIAL E MÉTODOS Treze cepas de Bacillus thuringiensis foram coletadas em campo e conduzidas ao Laboratório de Biologia Molecular de Insetos/Embrapa Algodão. As bactérias, mantidas inicialmente em ampolas de vidro, foram inoculadas em 5mL de meio seletivo nas seguintes condições: 200rpm/30ºC/48h. A esporulação, a liberação dos cristais e a presença de contaminantes foram monitoradas por visualização de amostragens ao microscópio óptico. Em Erlenmeyers de 125 ml, com 30 ml de meio, foram adicionados três mililitros, retirados do pré-inóculo (descrito acima). O meio foi incubado sob agitação a 30 C/250rpm/12horas. Posteriormente, cinco Erlenmeyers de 500 ml, com 100mL de meio cada foram inoculados com 5 ml do cultivo anterior e incubados a 30 C/250rpm/48 horas. Após este período, a esporulação e a presença de contaminantes foram avaliadas por observação ao microscópio óptico. Uma vez obtida uma cultura esporulada de boa qualidade, o meio foi centrifugado (8000g/4 C/15min) e o sobrenadante foi descartado. Posteriormente, o precipitado foi ressuspendido em 100mL de NaCl 1M, incubado a 37 C/125 rpm/30min, centrifugado novamente nas mesmas condições descritas anteriormente, e ressuspendido em aproximadamente 800mL de água destilada esterilizada. Em seguida, o precipitado foi lavado três vezes com água destilada (ressuspensão e centrifugação). Finalmente, o precipitado foi ressuspendido em 250 ml de PBS ( ) e utilizado nos bioensaios. Para armazenamento a -70 C, às suspensões de esporos foi adicionado glicerol 20% v/v e estas foram repartidas em alíquotas de 6-7mL. Posteriormente, as concentrações das cepas foram ajustadas para 1x 10 8 esporos/ml. Os bioensaios foram realizados a 25 C e 70% ± 10 de umidade relativa em sala climatizada. As 13 cepas utilizadas foram I9A19, I4A7, I14A24, II-005-1, 301, 204, I19A38, I5A8, I18A32, I19A35, I5A10, I20A39 e I15A25, com um tratamento testemunha. Os dados foram analisados pelo teste de Duncan (p<5%). Posteriormente, as estirpes que apresentaram alta toxicidade contra as espécies de lagartas foram cultivadas para a obtenção de uma suspensão de esporos, a fim de serem empregadas em bioensaios mais acurados. Os bioensaios com cinética de concentração foram realizados de acordo com a metodologia descrita a seguir: A partir das suspensões de esporos foram preparadas diluições seriadas com o objetivo de obter uma curva de concentração variando entre 0,1ng/µL a 1,0µg/µL,

3 aproximadamente. Uma alíquota de cada diluição (±50µL) foi adicionada à superfície da dieta. As larvas de 1º estádio foram colocadas isoladamente nos poços das placas e a mortalidade foi aferida após 72 horas. Foram utilizadas 3 repetições de 24 indivíduos para cada concentração e a curva foi composta por cinco concentrações. Os resultados foram tabulados e a regressão linear para obtenção da Concentração Letal para 50% dos indivíduos (LC50) foi calculada utilizando a análise de Probits. RESULTADOS E DISCUSSÃO Os bioensaios foram realizados a 25 C e 70% ± 10 de umidade relativa em sala climatizada. Após a exposição das lagartas de 2º ínstares às dietas contaminadas com as cepas de B. thuringiensis, determinou-se a letatidade das formulações. Os isolados mais eficientes foram I4A7, 204 e comercial, com 94,4; 69,4 e 59,7% de mortalidade, respectivamente (Tab. 1). Tabela 1. Letalidade de cepas de B. thuringiensis sobre indivíduos de 2º ínstar de Spodoptera frugiperda verificada após exposição em laboratório dos insetos à dieta contendo as bactérias. Campina Grande, Isolado Nº indivíduos testados Mortalidade média (%) Desviopadrão Comercial 71 59,70 6,42 b I14A ,52 2,42 c I4A ,43 2,37 a ,63 12,45 c ,34 7,24 d ,43 6,36 b ,55 6,37 d I4A9 71 4,16 4,17 d I2A6 70 2,77 2,40 d I13A ,77 2,40 d I9A3 68 4,16 4,17 d ,16 4,17 d Controle negativo 69 0,00 0,00 d CV% 21,32 Médias seguidas das mesmas letras não diferem entre si (Tukey, p<0,05). Pelos dados analisados pelo teste de Duncan pode-se comprovar que a mortalidade provocada pela cepa I4A7 foi superior às demais. As cepas 204 e comercial não diferem entre si. Estas três cepas apresentaram valores superiores ao obtido com os demais isolados. Este fato pode estar relacionado à especificidade existente entre cepas e hospedeiros. As duas cepas selecionadas foram isoladas de insetos doentes de Spodoptera sp. e comprovaram assim sua especificidade. Entretanto, outros fatores como a infectividade e virulência foram determinantes para destacarem estas cepas de outras testadas e também isoladas de Spodoptera sp. A especificidade está relacionada com a capacidade de solubilização dos cristais produzidos pelo Bt e com os tipos de proteínas Cry presentes no isolado (GE et al., 1991; CARAMORI et al., 1991). A espécie

4 Spodoptera sp. apresentam ph menos alcalino que outras espécies de Noctuidae, condição que limita o processo de solubilização de várias proteínas (MONERAT e BRAVO, 2000). Determinação da CL 50 Os bioensaios foram realizados em sala climatizada a 25±1 C, 70% ± 10 de umidade relativa e fotoperíodo de 12 horas. Foram utilizadas seis concentrações para cada produto (1, 50, 100, 200, 300 e 400 µg/ml). Em bioensaios de resposta binária (morte ou sobrevivência), a seleção de concentrações de um produto é baseada em sua letalidade sobre indivíduos-alvo, a qual deve estar funcionalmente relacionada com a concentração, de modo que o aumento desta implique em maior suscetibilidade dos organismos envolvidos (ROBERTSON e PREISLER, 1992). De fato, as respostas de Spodoptera sp. às aplicações dos formulados I4A7 e 204 de Bacillus thuringiensis (coleção da Embrapa Algodão) mostraram-se dose-dependentes (Fig. 1). Concentração (ug/ml) Mortalidade (%) 204 y = 13,24x - 324,42 R2 = 0,82 I4A7 y = 12,33x - 319,43 R2 = 0,75 Comercial y = 9,63x - 166,66 R2 = 0,80 Figura 1. Relação concentração-mortalidade de indivíduos de Spodoptera sp. expostos a dieta contendo cepas de Bacillus thuringiensis. Campina Grande, 2004 Os testes estatísticos componentes da análise de Probit são apresentados na Tabela 2. Os valores preditos pela análise diminuíram a medida em que o intervalo de tempo entre a aplicação e a avaliação aumentou. 72 horas após a aplicação, registrou-se a menor DL 50, correspondente.

5 Tabela 2. Testes estatísticos componentes da análise de Probit e CL 50 predita com base nos dados de resposta de Spodoptera frugiperda à exposição oral a formulados de Bacillus thuringiensis. Campina Grande, Formulado CL 50 (µg/ml) Teste t χ 2 (g.l.) Teste g (0,95) I4A7 20,1 3,94 * 32,18(23) 0, ,1 7,11 * 34,02(23) 0,23 Comercial 241,5 6,10 * 29,38(23) 0,18 * Significativo (p<0,05) Os testes t, χ 2 e o índice de significância g, testaram o conjunto de dados submetido à análise de Probit (FINNEY, 1971). Pelo teste t, que experimentou a linearidade da função doseresposta, verificou-se que todos os valores observados foram significativos e esta hipótese foi aceita em todos os casos. O teste χ 2 comprovou a adequabilidade dos dados ao modelo de análise de Probit (ROBERTSON e PREISLER, 1992). Finalmente, o índice de significância g estimou os limites de confiança dos valores médios de cada dose. Segundo Robertson e Preisler (1992), se g é maior que 0,5, o valor da dose letal pode sair fora dos limites de confiança. No presente estudo, os valores mostraram-se apropriados. Os formulados I4A7, 204 e comercial apresentaram as CL50 de 20,1; 17,1 e 241,5 µg/ml, respectivamente. Com a plotagem em gráfico dos valores obtidos com diferentes concentrações dos formulados, percebe-se que os formulados I4A7 e 204 apresentaram comportamentos semelhantes, refletindo modos de ação similares, e tendo seu efeito potencial mais elevado que o do formulado (Fig.1). Os formulados I4A7 e 204 demonstraram, assim, eficiência maior que o comercial, sendo estes promissores para o uso em campo contra esta importante praga. Posteriormente, estes isolados serão testados a campo para serem avaliados diante de fatores externos ambientais. CONCLUSÃO Entre os formulados com Bacillus thuringiensis testados contra Spodoptera frugiperda, os mais eficientes foram I4A7 e 204, os quais se destacaram dos demais e demonstraram eficiência maior que o produto comercial no controle desta praga. (*) Trabalho financiado pelo Fundo de Desenvolvimento do Agronegócio do Algodão FUNDEAGRO

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS CARAMORI, T.; ALBERTINI, A. M.; GALIZZI, A. In vivo generation of hybrids between two Bacillus thuringiensis insect-toxin-encoding genes. Gene, v. 98, n , FINNEY, D. J. Probit analysis. Cambridge: Cambridge University Press, p. FREIRE, E. C.; SOARES, J. J.; FARIAS, F. J. C. Cultura do algodoeiro no Estado de Mato Grosso. Campina Grande: Embrapa CNPA, p GE, A. Z.; RIVERS, D.; MILNE, R.; DEAN, D. H. Functional domais of Bacillus thuringiensis insecticidal crystal proteins: refinement of Heliothis virescens and Trichoplusia ni specificity domain of CryIA(c). Journal of Biological Chemistry, v. 304, p , MaCINTOSH, S.C.; STONE, T. G.; SIMS, S. R.; HURST, P. L.; GREENPLATE, J. T.; MARRONE, P. G.; PERLAK, F. J.; FUCHS, R. L. Specificity and efficacy of purified Bacillus thuringiensis proteins against agronomically important insects. Journal of Invertebrate Pathology, v. 56, p , MIRANDA, J.E.; SUASSUNA, N.D. Guia de identificação e controle das principais pragas e doenças do algodoeiro. Campina Grande: Embrapa CNPA, p. MONERAT, R.; BRAVO, A. Proteínas bioinseticidas produzidas pela bactéria Bacillus thuringiensis: modo de ação e resistência. In: MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L. (Eds.). Controle biológico. Embrapa Meio Ambiente, p OLIVEIRA, E. A. R. de; VIEIRA, B. da S.; FERNANDES, P. M.; CZEPAK, C.; ALVES, E. P. Eficácia dos inseticidas thiodicarb e methoxifenozide no controle de Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) na cultura do algodão. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE ALGODÃO, 3, 2001, Campo Grande. Anais... Campina Grande: Embrapa CNPA, p ROBERTSON, J. L.; PREISLER, H. K. Pesticide bioassays with arthropods. London: CRC Press, p.