TÍTULO: AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS ENVOLVIDOS NA SÍNTESE DA NANOPARTÍCULAS DE PRATA PARA APLICAÇÃO COMO AGENTE ANTIMICROBIANO

TÍTULO: AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS ENVOLVIDOS NA SÍNTESE DA NANOPARTÍCULAS DE PRATA PARA APLICAÇÃO COMO AGENTE ANTIMICROBIANO CATEGORIA: CONCLUÍDO ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE SUBÁREA: FARMÁCIA INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE DE RIBEIRÃO PRETO AUTOR(ES): VINÍCIUS MARQUES DA SILVA ORIENTADOR(ES): CARLOS EDUARDO SARAIVA MIRANDA COLABORADOR(ES): ANDRÉ PITONDO DA SILVA, BRUNA DE SOUZA ALTOÉ ADORNO, JOÃO FELIPE BONATTO BRUNIERA, MARILISA GUIMARÃES LARA, THAÍSA MARQUES DOMENCH, YARA TERESINHA CORREA SILVA SOUSA

1 1. RESUMO As nanopartículas de prata têm sido utilizadas em diversas áreas envolvendo biossensores (HABOUTI et al. 2010), eletrônica (ALSHEHRI et al. 2012), antimicrobianos (CHEN et al. 2014). Esta última, notadamente, tem despertado muito interesse em função do largo espectro antimicrobiano das nanopartículas de modo que esses materiais têm sido empregados na indústria têxtil, em embalagens de produtos alimentícios, sprays antissépticos, cateteres e curativos. A atividade antimicrobiana das nanopartículas depende de seu tamanho, forma e revestimento superficial. Portanto, a produção de nanopartículas com propriedades físicoquímicas e morfológicas bem controladas é essencial para a obtenção de materiais que possam ser aplicados na área da saúde em função de sua biocompatibilidade (WEI et al. 2015). Assim, o presente estudo teve como objetivo a avaliação dos parâmetros envolvidos na síntese da nanopartículas de prata visando a sua aplicação como agente antimicrobiano. Dentre os parâmetros que afetam a formação das nanopartículas foram estudados a temperatura, velocidade e tempo de reação. As nanopartículas de prata foram obtidas a partir da redução de nitrato de prata por maltose. A caracterização dessas nanopartículas foi feita por meio do efeito Tyndall, espectrofotometria na região do visível e espalhamento dinâmico de luz. Para a determinação das concentrações de prata nas soluções coloidais de nanopartículas de prata, foi utilizada a espectrometria de absorção atômica. 2. INTRODUÇÃO Muitos métodos de síntese têm sido relatados na literatura visando à obtenção de nanopartículas. No entanto, alguns deles apresentam sérias ameaças à saúde humana e ao ambiente em função dos reagentes utilizados e/ou resíduos produzidos. Os métodos têm sido propostos para a obtenção de nanopartículas de prata incluem fotorredução (DARROUDI et al., 2009), ablação por laser (DARROUDI et al., 2011), redução química em meio aquoso com diferentes polímeros surfactantes (AIHARA et al., 1998; LIN et al., 2003) e redução de produtos químicos em meio brando (ZHUANG et al., 2010; DARROUDI et al., 2010; HEBEISH et al., 2010). Dentre estes métodos, o mais utilizado na produção de nanopartículas de prata com dimensões reduzidas são aqueles que envolvem a redução de nitrato de prata empregando diferentes reagentes, tais como: borohidreto de sódio, citrato de

2 sódio, borohidreto de tetrabutilamônio e dimentilformamida (NICKEL et al., 2000; LEOPOLD & LENDL, 2003; KHANNA & SUBBARAO, 2003; SONDI et al., 2003). Entretanto, tais reagentes podem ser responsáveis por problemas relacionados à toxicidade ambiental e/ou riscos biológicos. Uma vez que uma das principais aplicações das nanopartículas é relacionada à atividade antimicrobiana e, por conseqüência, à área da saúde, a rota sintética para obtenção desses materiais é um ponto crítico. Nesse sentido, muitos trabalhos têm sido desenvolvidos visando a total eliminação ou, pelo menos, minimização dos problemas relacionados à produção de resíduos que levem à poluição ambiental e/ou risco biológico durante a síntese das AgNPs. Tais esforços vão de encontro, portanto, aos conceitos vinculados à Química Verde (MURPHY, 2008; DAHL et al., 2007). Para que seja possível obter nanopartículas com dimensões adequadas para utilização como agente antimicrobiano, é preciso avaliar parâmetros como tempo de reação, concentração dos reagentes e temperatura de reação, os quais afetam a formação das nanopartículas. Assim, neste trabalho, avaliaram-se tais parâmetros visando à obtenção de nanopartículas com dimensões reduzidas. 3. OBJETIVOS 3.1 Objetivo principal Avaliar os parâmetros envolvidos na síntese da nanopartículas de prata 3.2 Objetivos específicos a) Avaliar a influência de parâmetros como temperatura, velocidade de reação e tempo de reação na síntese de nanopartículas de prata. b) Caracterizar as nanopartículas de prata obtidas por meio do efeito Tyndall, espectrofotometria UV e espalhamento dinâmico de luz. c) Determinar as concentrações de prata nas amostras obtidas por espectrometria de absorção atômica 4. METODOLOGIAS 4.1 Avaliação dos parâmetros que influenciam a síntese das nanopartículas de prata

3 As nanopartículas de prata foram obtidas a partir da redução de nitrato de prata por maltose. Durante a etapa de síntese das nanopartículas, foram avaliados o tempo de reação para obtenção das nanopartículas, a temperatura e a concentração das soluções de nitrato de prata e de maltose. 4.2 Caracterização A caracterização das nanopartículas de prata foi feita empregando-se o efeito Tyndall, a espectrofotometria de absorção molecular e o espalhamento dinâmico de luz. 4.3 Quantificação das nanopartículas de prata As nanopartículas de prata obtidas foram analisadas por espectrometria de absorção com chama para a determinação da concentração total de prata. 5. Desenvolvimento 5.1 Avaliação dos parâmetros que influenciam a síntese das nanopartículas de prata 5.1.1 Efeito do tempo de reação Para a síntese das nanopartículas de prata, inicialmente, foi preparada uma solução dissolvendo-se 1,0 g de gelatina em 80 ml de água ultrapura, sob aquecimento. Posteriormente, foram adicionados a essa solução 5 ml de solução de nitrato de prata com concentração de 0,25 mol/l. Subseqüentemente, foram adicionados 10 ml de solução de maltose com concentração de 0,5 mol/l. A solução permaneceu sob aquecimento a 75 o C por 30 min. O mesmo procedimento foi repetido empregando-se os tempos de 1, 2 e 3 h. Todas as soluções coloidais obtidas foram analisadas por espectrofotometria de absorção molecular para obtenção dos espectros de absorção e por espectrometria de absorção atômica com chama para determinação das concentrações de prata. A única solução coloidal a gerar o espectro de absorção característico das nanopartículas de prata foi aquela obtida com um tempo de reação de 3 h, o qual foi então selecionado para o teste subsequente.

4 5.1.2 Efeito da concentração dos reagentes As concentrações dos reagentes levaram à formação de soluções coloidais com grande intensidade de cor que poderia comprometer a coloração do elemento dentário durante o tratamento endodôntico. Assim, foram avaliadas concentrações menores das soluções de nitrato de prata, maltose e gelatina. Para efeito de comparação, foram incluídas todas as concentrações de reagentes estudadas, inclusive aquelas de concentrações mais altas que se revelaram inadequadas. Neste estudo, foi adotada também uma redução proporcional da quantidade de gelatina empregada. Inicialmente, foi preparada uma solução dissolvendo-se 1 g de gelatina em 80 ml de água ultrapura, sob aquecimento. Posteriormente, foram adicionados 5 ml de solução de nitrato de prata com concentração de 0,5 mol/l. Subseqüentemente, foram adicionados 10 ml de solução de maltose com concentração de 1 mol/l. A solução permaneceu sob aquecimento a 75 o C por 3 h (Solução coloidal 1). O mesmo procedimento foi repetido mantendo-se a temperatura e tempo de reação e alterando as concentrações dos reagentes: Soluções coloidais 2, 3, 4 e 5: 0,5; 0,25; 0,125 e 0,0625 g de gelatina em 80 ml de água ultrapura, 5 ml de solução de nitrato de prata com concentração de 0,25; 0,125; 0,0625 e 0,03125 mol/l e 10 ml de solução de maltose com concentração de 0,5; 0,25; 0,125 e 0,0625 mol/l, respectivamente. Todas as soluções coloidais obtidas foram analisadas por espectrofotometria de absorção molecular para obtenção dos espectros de absorção e por espectrometria de absorção atômica com chama para determinação das concentrações de prata. Os resultados obtidos indicaram que a solução coloidal de menor concentração foi a mais adequada, uma vez que a coloração apresentada por essa solução coloidal não comprometeria a coloração do elemento dentário, além de apresentar atividade antimicrobiana. 5.1.3 Efeito da temperatura Para assegurar a formação das nanopartículas de dimensões próximas a 10 nm, foi avaliado o efeito da temperatura de reação com variação no intervalo de 75 o C a 95 o C.

5 Solução coloidal 1A: foi preparada dissolvendo-se 0,062 g de gelatina em 80 ml de água ultrapura, sob aquecimento. Posteriormente, foram adicionados 5 ml de solução de nitrato de prata com concentração de 0,031 mol/l. Subseqüentemente, foram adicionados 10 ml de solução de maltose com concentração de 0,062 mol/l. A solução permaneceu sob aquecimento a 75 o C por 3 h. O mesmo procedimento foi repetido para as soluções coloidais 1B e 1C, empregando-se as temperaturas de 85 o C e 95 o C, respectivamente, mantendo-se fixos os demais parâmetros. Todas as soluções coloidais foram analisadas por espectrofotometria de absorção molecular para obtenção dos espectros de absorção e por espectrometria de absorção atômica com chama para determinação das concentrações de prata. Os resultados indicaram que a solução coloidal obtida à temperatura de 85 o C foi a mais adequada, uma vez que apresentou uma coloração que não comprometeria o elemento dentário durante o tratamento endodôntico, além de apresentar atividade antimicrobiana. 5.2 Estudo da alteração da proporção das concentrações das soluções de nitrato de prata e de maltose Em função da repetibilidade deficiente do processo de síntese das nanopartículas de prata, a concentração da solução de maltose foi dobrada visando garantir a máxima eficiência na redução do íon prata. Desse modo, a concentração de maltose passou de 0,062 mol/l para 0,12 mol/l. 5.3 Caracterização 5.3.1 Espectrofotometria de absorção molecular UV-Vis Após a síntese, as soluções de prata coloidal foram analisadas em um espectrofotômetro CARY 1E (VARIAN, Melbourne, Australia), para obtenção do espectro de absorção na região do visível, no intervalo de 350 a 550 nm. 5.3.2 Efeito Tyndall As formulações, armazenadas em frascos transparentes, foram expostas a um feixe de LASER vermelho. 5.3.3 Espalhamento dinâmico de luz As formulações de nanopartículas de prata foram submetidas à análise por espalhamento dinâmico de luz (Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments Ltd.

6 Worcestershire, Inglaterra) para determinar as dimensões das partículas e o potencial zeta. 5.4 Quantificação das nanopartículas de prata As análises foram feitas em um espectrômetro SpectraAA-200 (VARIAN, Melbourne, Austrália) equipado com uma lâmpada de cátodo oco de prata. Foi utilizado o comprimento de onda de 328 nm e preparado um conjunto de soluções para obtenção da curva analítica com as seguintes concentrações: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 g/ml. 6. Resultados 6.2 Efeito da concentração 6.2.1 Caracterização por espectrofotometria de absorção molecular É possível observar, de acordo com a figura 1, que foi obtido o espectro característico das nanopartículas de prata, entretanto, observa-se que ocorreu uma distorção do perfil do pico, embora o máximo de absorção desse pico fosse próximo ao comprimento de onda característico de 400 nm. Figura 1: espectro de absorção da solução coloidal (Solução 5; 0,031 mol/l de prata; 0,0625 mol/l de maltose, 3 h de reação a 75 o C) 6.2.2 Quantificação por espectrometria de absorção atômica De acordo com a tabela I, as concentrações das soluções coloidais de 1 a 5 sofreram uma redução, como esperado, uma vez que as concentrações dos reagentes foram reduzidas, com manutenção da temperatura de reação. Tabela II: concentração média e desvio padrão das soluções coloidais de prata Solução Média Desvio Concentração ( g/ml) coloidal ( g/ml) padrão 1 1.856,74 1.900,30 1.890,50 1.888,00 22,85 2 879,18 877,37 875,19 877,24 1,99 3 627,74 627,26 617,94 624,31 5,52 4 336,98 359,00 358,76 351,58 12,64 5 150,04 144,35 145,56 146,65 2,99

7 6.3. Efeito da temperatura 6.3.1 Caracterização por espectrofotometria de absorção molecular Em função dos resultados obtidos no testes anterior com relação à coloração da solução e atividade antimicrobiana, definiu-se que a solução coloidal de menor concentração dos reagentes (solução coloidal 5) seria utilizada neste teste. O melhor perfil foi obtido quando se empregou a temperatura de 95 o C (figura 2), tendo sido obtido, nessa temperatura, o comprimento de onda mais próximo de 400 nm. Figura 2: espectro de absorção da solução coloidal (Solução 1C; 0,031 mol/l de prata; 0,0625 mol/l de maltose, 3 h de reação a 95 o C) 6.4 Estudo da alteração da proporção das concentrações das soluções de nitrato de prata e de maltose O aumento da concentração de maltose para 0,12 mol/l permitiu a obtenção das nanopartículas de prata, fato confirmado pelo espectro de absorção com máximo em torno de 400 nm, conforme a figura 3, além de assegurar a repetibilidade do processo. Figura 3: espectro de absorção da solução coloidal (0,031 mol/l de prata; 0,12 mol/l de maltose, 3 h de reação a 85 o C) 6.5 Efeito Tyndall e espalhamento dinâmico da luz Na caracterização por meio do efeito Tyndall, foi observado o trajeto do feixe luminoso evidenciado pela refração da luz. As análises por espalhamento dinâmico de luz, empregando-se as condições descritas na figura 3, revelaram que cerca de 0,9% das nanopartículas produzidas apresentavam dimensões no intervalo de 7 a 20 nm e potencial zeta obtido de 3,16 mv.

8 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS A obtenção das nanopartículas de prata (AgNP) foi baseada na reação proposta por OLUWAFEMI et al. (2013). Essa é uma reação redox, na qual ocorre a redução do nitrato de prata a nanopartículas de prata pela ação da maltose, o agente redutor, que é levada a ácido glicônico. Nessa reação, a hidrólise da maltose resulta em duas moléculas de glicose, um aldeído, que reduz o íon Ag + a Ag o, produzindo ácido glicônico. A gelatina foi incluída como agente estabilizante em função em sua boa biocompatibilidade e biodegradabilidade. Além disso, os grupos amina ligado à estrutura da gelatina estabilizam as nanopartículas impedindo-as de se agregarem novamente (DARROUDI et al., 2011). Durante a etapa de síntese das nanopartículas, foram avaliados o tempo de reação para obtenção das nanopartículas, a temperatura e a concentração das soluções de nitrato de prata e de maltose. Essas variáveis podem influenciar o tamanho e a morfologia das nanopartículas (PAUL et al., 2012; SHUKLA et al., 2011) e, portanto, suas propriedades. As concentrações propostas por OLUWAFEMI et al. (2013), embora apresentassem atividade antimicrobiana se mostraram inviáveis, uma vez que a coloração intensa das soluções coloidais obtidas, de vermelho intenso a cinza escura, impediriam a sua aplicação em tratamentos endodônticos como pretendido. Desse modo, foi proposta uma redução das concentrações dos reagentes e variação do tempo de reação. Entretanto, com a redução da concentração, somente o tempo de reação de 3 h, o maior intervalo de tempo avaliado neste trabalho, permitiu a formação das nanopartículas. Com relação à concentração dos reagentes, foram obtidos neste trabalho resultados semelhantes a OLUWAFEMI et al. (2013). À medida que a concentração aumentou, ocorreu uma tendência ao aumento do sinal de absorbância. Embora DARROUDI et al. (2011) afirmem que concentrações maiores permitem a obtenção de nanopartículas de menores dimensões, esta não seria uma alternativa viável, uma vez que concentrações maiores produzem soluções coloidais de coloração intensa, a qual é incompatível com a proposta de aplicação em endodontia. Na avaliação do efeito da temperatura, a temperatura de 95 o C permitiu a formação de nanopartículas, cujo espectro de absorção apresentou melhor perfil, maior magnitude do sinal de absorbância no máximo de absorção e maior proximidade do comprimento de onda de 400 nm. Entretanto, a coloração da

9 solução coloidal se mostrou excessivamente intensa. Por essa razão, foi selecionada a temperatura de 85 o C. Durante os estudos, verificou-se que a razão de concentração agente redutor/agente oxidante de apenas duas vezes não era suficiente para assegurar a máxima eficiência no processo de síntese das nanopartículas e sua repetibilidade. Desse modo, elevou-se a razão para quatro vezes, passando a concentração de maltose a 0,12 mol/l. A avaliação dos parâmetros envolvidos na síntese da nanopartículas como o tempo de reação, concentração dos reagentes e temperatura de reação permitiu a obtenção de nanopartículas de dimensões reduzidas. No procedimento de caracterização das nanopartículas, a espectrofotometria de absorção molecular UV- Vis permitiu a devida caracterização das nanopartículas com a obtenção de um espectro de absorção com máximo em torno de 400 nm. As análises por espalhamento dinâmico de luz revelaram que cerca de 0,9% das nanopartículas produzidas apresentavam dimensões no intervalo de 7 a 20, as quais permitiriam ação antimicrobiana, uma vez que poderiam atravessar a parede celular das bactérias. O potencial zeta obtido foi de 3,16 mv, o que, de acordo com a análise, é um resultado de boa qualidade. A quantificação de prata, por sua vez, foi feita por espectrometria de absorção atômica, a qual permite a quantificação de prata total. 8. REFERÊNCIAS CONSULTADAS AIHARA, N.; TORIGOE, K.; ESUMI, K.; Langmuir 14, 4945, 1998. ALSHEHRI, A.H. et al. ACS Appl. Mater. Interfaces 4, 7007 7010, 2012. CHEN, G. et al. Analyst 139, 5793 5799, 2014. DAHL, J.A.; MADDUX, B.L.; HUTCHISON, J.E., Chem. Rev., 107, 2228, 2007. DARROUDI, M.; AHMAD, M.B.; ABDULLAH, A.H.; IBRAHIM, N.A. Int. J. Nanomed. 6, 569, 2011. DARROUDI, M.; AHMAD, M.B.; ABDULLAH, A.H.; IBRAHIM, N.A.; SHAMELI, K. Int. J. Mol. Sci. 11, 3898, 2010. HABOUTI, S. et al. J. Mater. Chem. 20, 5215 5219, 2010. HEBEISH, A.A.; EL-RAFIE, M.H.; ABDEL-MOHDY, F.A.; ABDEL-HALIMAND, E.S.; EMAM, H.E. Carbohydr. Polym. 82, 933, 2010. KHANNA, P.K.; SUBBARAO, V.V.V.S. Mater. Lett. 57, 2242, 2003. LEOPOLD, U.; LENDL, B.; J. Phys. Chem. B 107, 5723, 2003.

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