Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18 Clone EP17/EP30 Referência M3652 Finalidade Para utilização em diagnóstico in vitro. O Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP30, destina-se à utilização em imunohistoquímica. Os anticorpos da citoqueratina 8/18 podem ser úteis para a identificação de tumores de origem epitelial (1). A interpretação clínica de qualquer coloração ou da sua ausência deve ser complementada com estudos morfológicos utilizando controlos adequados e deve ser avaliada no contexto do historial clínico do doente e através de outros testes de diagnóstico por um patologista qualificado. Sinónimos de antigénio Resumo e explicação Reagente fornecido Imunogénios Especificidade Queratina 8/18 (K8/18) (1), CK8/18 (2). A citoqueratina 8/18 (CK8/18) pertence à família dos filamentos intermédios, um grupo diversificado de proteínas heteropoliméricas compostas por 54 genes diferentes. Os polipéptidos da citoqueratina (CKs) podem ser classificados em duas subfamílias: acídicos (tipo I) e básicos neutros (tipo II). Os polipéptidos dos tipos I e II emparelham-se para formar um heteropolímero tetramérico maduro. A CK18 é uma CK de 45 kda pertencente à subfamília de CKs acídicas de tipo I normalmente associada à citoqueratina CK8 de tipo II de 54 kda. No seu conjunto, a CK8/18 é uma das citoqueratinas de baixo peso molecular (LMW-CK). A CK8/18 é expressa em epitélios simples não estratificados, células basais e superficiais de epitélios de transição, células luminais/secretórias de epitélios complexos e mesotélios, podendo também estar presente em alguns tipos de células mesenquimais (1). Vários membros da família das citoqueratinas podem ser expressos numa determinada célula e são característicos do tipo de célula e do estado de diferenciação (1). Praticamente todos os carcinomas de origem epitelial e mesoteliomas expressam a CK8/18 (2), pelo que os anticorpos da CK8/18 constituem uma ferramenta importante na classificação de tumores de origem desconhecida e carcinomas deficientemente diferenciados (1). Os anticorpos da CK8/18 apresentam um padrão de coloração citoplasmático e/ou membranoso. Pode também observar-se uma expressão focal fraca no caso de tumores mesenquimais, incluindo leiomiomas, rabdomiossarcomas, melanomas malignos, schwannomas, sarcomas de Ewing, tumores desmoplásicos de células redondas pequenas, carcinomas das células escamosas e linfomas (3, 4). Consulte as General Instructions for Immunohistochemical Staining (Instruções gerais para coloração imunohistoquímica) da Dako ou as instruções do sistema de deteção para instruções quanto aos procedimentos de IHC. Uma mistura de dois anticorpos monoclonais de coelho fornecidos na forma líquida como sobrenadante da cultura de células em 0,05 mol/l de Tris-HCl, 0,015 mol/l de azida de sódio, ph 7.2. Este produto contém proteína estabilizadora. Clone: EP17 (CK8) e EP30 (CK18). Isotipo: IgG de coelho. Concentração de lgg de coelho mg/l: consulte a etiqueta do frasco. A concentração de proteína pode variar entre lotes sem influenciar a diluição ideal. O título de cada lote individual é comparado e ajustado face a um lote de referência visando garantir um desempenho da coloração imunohistoquímica consistente entre lotes. CK8: um péptido sintético correspondente a resíduos no terminal C da proteína de citoqueratina 8 humana. CK18: proteína de citoqueratina 18 humana isolada de células HT-29. A CK8/18 é um cocktail com dois anticorpos monoclonais. Em análises Western Blotting de lisados celulares A431, o anti-ck8, clone EP17, reconhece uma banda principal de 52 kda correspondente ao peso molecular esperado da CK8; e o anti-ck18, clone EP30, reconhece uma banda principal de 45 kda correspondente ao peso molecular esperado da CK18. (124412-002) P02831PT_02_M3652/2013.12 p. 1/5
Precauções 1. Para utilizadores profissionais. 2. Este produto contém azida de sódio (NaN 3), um produto químico altamente tóxico na forma pura. Em situações de concentração do produto, embora não sendo classificada como perigosa, a azida de sódio pode reagir com as canalizações de chumbo e de cobre, formando acumulações de azidas metálicas altamente explosivas. Adicionar água abundantemente ao eliminar o produto para evitar a acumulação de azida metálica na canalização. 3. Tal como com qualquer produto de origem biológica, deverão seguir-se procedimentos de manuseamento adequados. 4. Usar equipamento de proteção pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos. 5. A solução não utilizada deverá ser eliminada em conformidade com as regulamentações locais, nacionais e comunitárias. Conservação Conservar entre 2 e 8 C. Não utilizar após o fim d a data de validade impressa no frasco. Se os reagentes forem conservados em condições diferentes das especificadas, o utilizador deverá verificar essas mesmas condições. Não existem sinais óbvios que indiquem a instabilidade deste produto. Por isso, devem processar-se controlos positivos e negativos simultaneamente com as amostras do doente. Caso se observe uma coloração inesperada que não possa ser explicada pela variação nos procedimentos laboratoriais e se suspeite da existência de um problema com o anticorpo, contactar a Assistência técnica Dako. Guia rápido* Etapa Comentários Fixação Formol N/D Pré-tratamento EnVision FLEX, High ph (referências K8000/K8004) 20 min. HIER, 3 em 1 utilizando PT Link e PT Link Rinse Station Diluição 1:50 Incubação de 20 min. Tampão de diluição Controlo negativo Visualização Dako Antibody Diluent (referência S0809) Negative Control, Rabbit IgG (referência X0936) EnVision FLEX, High ph (referências K8000/K8010) Diluir imediatamente antes da utilização Incubação de 20 min. Incubação de 20 min., incubação com DAB+ 2x5 min. Contraste EnVision FLEX Hematoxylin Incubação de 5 min. (referências K8008/K8018) Tecido de controlo Fígado normal Coloração citoplasmática/membranosa Lâminas Meio de montagem FLEX IHC Microscope Slides (referência K8020) Necessário meio de montagem permanente, não aquoso Recomendadas para maior aderência dos cortes de tecido às lâminas de vidro. Após a coloração, os cortes têm de ser desidratados, limpos e montados com um meio de montagem permanente. Instrumentação Autostainer Link 48 e Autostainer Plus Utilizar frascos específicos para o instrumento (referências SK200-SK203 e S3425) *O utilizador deve ler sempre o folheto informativo para instruções detalhadas sobre o procedimento de coloração e manuseamento do produto. Preparação das amostras Cortes de parafina: o anticorpo pode ser utilizado para marcar cortes de tecido impregnados em parafina, fixados em formol. As amostras de tecido devem ser cortadas em secções de aproximadamente 4 µm. Pré-tratamento: é necessário proceder ao pré-tratamento de cortes de tecidos impregnados em parafina e fixados em formol com recuperação antigénica induzida por calor (HIER). Obtêm-se resultados ótimos ao pré-tratar os tecidos com HIER utilizando a solução EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (referência K8004) diluída. A desparafinação, a reidratação e a recuperação antigénica podem ser efetuadas no Dako PT Link (referências PT100/PT101). Para informações detalhadas, consulte o manual do utilizador do PT Link. Para o PT Link, devem ser utilizados os seguintes parâmetros: temperatura de pré-aquecimento: 65 C; temperatura e tempo da recuperação antigénica: 97 C durante 20 ( ±1) minutos; arrefecer até 65 C. Retirar o suporte de lâminas do tanque PT e mergulhar, imediatamente, as lâminas num frasco/tanque (por exemplo, PT Link Rinse Station [referência PT109]) contendo EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (referência K8007) diluído e à temperatura ambiente. Deixar as lâminas no Wash Buffer durante 1 a 5 minutos. Os cortes de tecido não devem secar durante o tratamento nem durante o procedimento de coloração imunohistoquímica seguinte. Para uma maior aderência dos cortes de tecido às lâminas de vidro, recomenda-se a utilização de FLEX IHC Microscope Slides (referência K8020). Após a coloração, os cortes têm de ser desidratados, limpos e montados com um meio de montagem permanente. (124412-002) P02831PT_02_M3652/2013.12 p. 2/5
Procedimento de coloração Interpretação da coloração Diluição: a diluição recomendada do Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP30, referência M3652, é de 1:50. Diluir o anticorpo em Dako Antibody Diluent (referência S0809). Incubar os cortes de tecido pré-tratados durante 20 minutos à temperatura ambiente. Estas indicações servem apenas de orientação. As condições ideais poderão variar dependendo das amostras e do método de preparação, devendo ser validadas individualmente por cada laboratório. Controlo negativo: o reagente de controlo negativo recomendado é o Dako Negative Control, Rabbit IgG (referência X0936), diluído na mesma concentração da IgG que o anticorpo primário. A não ser que a estabilidade do anticorpo diluído e do controlo negativo tenha sido estabelecida no procedimento de coloração efetivo, diluir estes reagentes imediatamente antes da utilização. Os controlos positivos e negativos devem processar-se simultaneamente com as amostras do doente. Visualização: o sistema de visualização recomendado é o EnVision FLEX, High ph (referências K8000/K8010) utilizando um período de incubação de 20 minutos à temperatura ambiente. Seguir o procedimento fornecido no sistema de visualização selecionado. Automatização: o anticorpo é adequado para coloração imuno-histoquímica utilizando plataformas automatizadas, tais como Dako Autostainer, Autostainer Plus e Autostainer Link assim como PT Link para o pré-tratamento. Contrastação: o contraste recomendado é o EnVision FLEX Hematoxylin (referências K8008/K8018). Para obter resultados ótimos, é recomendado um meio de montagem não aquoso e permanente. Controlos: os tecidos de controlo positivos e negativos devem ser processados em simultâneo com o mesmo protocolo das amostras do doente. O tecido de controlo positivo deve incluir fígado normal e as células/estruturas devem apresentar padrões de reação conforme os descritos para este tecido na secção "Características de desempenho". O padrão de coloração celular é citoplasmático/membranoso. (124412-002) P02831PT_02_M3652/2013.12 p. 3/5
Características de desempenho Tecidos normais: As células epiteliais apresentam uma reação de coloração citoplasmática e/ou membranosa moderada a forte (5). É de salientar que a coloração das células reticulares pode ser observada nos tecidos linfoides. Suprarrenal 3/3 Pâncreas 3/3 Medula óssea 0/3 Paratiroide 3/3 Mama 3/3 Pituitária 1/3 Cerebelo 0/3 Próstata 3/3 Cérebro 0/3 Glândula salivar 3/3 Colo do útero 1/3 Músculo-esquelético 0/3 Cólon 3/3 Pele 3/3 Esófago 3/3 Intestino delgado 3/3 Coração 0/3 Baço 3/3 Rim 3/3 Estômago 3/3 Fígado 3/3 Testículos 2/3 Pulmão 3/3 Timo 3/3 Células mesoteliais 2/3 Tiroide 3/3 Nervos, periféricos 0/3 Amígdalas 3/3 Ovários 3/3 Útero 1/3 Tecidos anormais: As células epiteliais apresentam uma reação de coloração citoplasmática e/ou membranosa moderada a forte (41/56) (6). Carcinoma hepatocelular 3/3 Melanoma 0/3 Carcinoma de células claras 3/3 Carcinoma indiferenciado 1/3 renais Carcinoma papilar renal 3/3 Leiomiossarcoma (1) 0/1 Adenocarcinoma pulmonar 2/2 Rabdomiossarcoma (1) 0/1 (2) Carcinoma das células 1/1 Carcinoide intestinal (2) 2/2 escamosas do pulmão (1) Carcinoma pulmonar das 3/3 Carcinoma do ovário (2) 2/2 células pequenas Adenocarcinoma gástrico 3/3 Tecido fibrótico (2) 0/2 Adenocarcinoma pancreático Carcinoma papilar da tiroide Carcinoma ductal da mama Carcinoma lobular da mama Adenocarcinoma da próstata Adenocarcinoma do cólon 3/3 Teratoma - maduro (1) 0/1 3/3 Teratoma - imaturo (1) 0/1 3/3 Leiomioma (2) 1/2 3/3 Linfoma de células B grandes 0/2 difusas (2) 2/3 Linfoma das células T (2) 0/2 3/3 Linfoma folicular (2) 0/2 (124412-002) P02831PT_02_M3652/2013.12 p. 4/5
Referências 1. Moll R, Divo M, Langbein L. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol 2008;129: 705-33. 2. Dabbs DJ. Diagnostic Immunohistochemistry. Philadelphia,PA: Churchill Livingstone, 2002. 3. Adams H, Schmid P, Dirnhofer S, Tzankov A.Cytokeratin expression in hematological neoplasms: A tissue microarray study on 866 lymphoma and leukemia cases. Pathol Res Pract 2008;204:569-73. 4. Lane EB, Alexander CM. Use of keratin antibodies in tumor diagnosis (review). Semin Cancer Biol 1990; 1:165-79. 5. Yu J. Report of Normal Tissue Immunohistochemical Testing Using Dako Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP30. 2013. Report on file, D19056. 6. Yu J. Report of Cancer Tissue Immunohistochemical Testing Using Dako Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP30. 2013. Report on file, D19756. O Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18 (CK8/18), Clone EP17/EP30 foi criado pela Epitomics Inc., utilizando tecnologia de anticorpos monoclonais de coelho exclusiva da Epitomic e coberta pelas patentes n.º 5 675 063 e 7 402 409. Edição 04/14 (124412-002) P02831PT_02_M3652/2013.12 p. 5/5