PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Solução tamponada contendo peróxido de hidrogênio, detergente e 0,015 mol/l de azido de sódio.

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1 PD-L1 IHC 28-8 pharmdx SK005 Cinquenta testes para uso com Autostainer Link 48 Uso pretendido Para uso com diagnóstico in vitro. O PD-L1 IHC 28-8 pharmdx é um ensaio imuno-histoquímico qualitativo que utiliza anticorpo monoclonal de coelhos anti-pd-l1, Clone 28-8 para uso na detecção da proteína PD-L1 em tecidos com câncer de pulmão de células não pequenas não escamosas (NSCLC) embebidas em parafina e fixadas em formalina (FFPE) utilizando o sistema de visualização EnVision FLEX no Autostainer Link 48. A expressão da proteína PD-L1 é definida como a porcentagem de células tumorais apresentando marcação positiva da membrana em qualquer intensidade. A expressão de PD-L1, conforme detectada pelo PD-L1 IHC 28-8 pharmdx em NSCLCs não escamosos, pode estar associada a uma maior sobrevida proporcionada pelo OPDIVO (nivolumab). Resumo e explicação A ligação dos ligantes PD-1, do PD-L1 e do PD-L2 com o receptor PD-L1 encontrados em células T inibe a proliferação de células T e a produção de citocinas. A regulação ascendente dos ligantes PD-1 ocorre em alguns tumores, e a sinalização por meio dessa via pode contribuir para com a inibição da vigilância de tumores imune a células T ativas (1). O OPDIVO (nivolumab) é um anticorpo monoclonal com imunoglobulina humana G4 (IgG4) que se liga ao receptor PD-1 e bloqueia a interação com o PD-L1 e o PD-L2, liberando a inibição mediada via PD-1 da resposta imunológica, incluindo a resposta imunológica antitumor (2). Nos modelos de tumores de camundongos singênicos, o bloqueio da atividade do PD-1 resultou em diminuição do crescimento do tumor (3). Os benefícios clínicos do OPDIVO e da utilidade clínica do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx foram investigados em NSCLCs. NSCLC não escamoso: A detecção de células tumorais com expressão de PD-L1 em pacientes vítimas de câncer de pulmão de células não pequenas e não escamosas pode indicar um maior benefício de sobrevida ao tratamento com OPDIVO (nivolumab) para o paciente. Amostras dos pacientes em estudos clínicos com OPDIVO patrocinados pela Bristol-Myers Squibb, foram testadas usando PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. O estudo clínico CA investigou a validade clínica do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx na avaliação do status do PDL1 em pacientes com NSCLC não escamoso tratados com OPDIVO (4,7). O efeito do tratamento imunoterapêutico anti-pd-l1 com OPDIVO foi correlacionado à expressão de PD-L1 em pacientes com NSCLC avançado. OPDIVO é uma marca registrada da Bristol-Myers Squibb. Princípio do procedimento O PD-L1 IHC 28-8 pharmdx contém reagentes otimizados e o protocolo necessário para executar procedimentos de marcação de IHC de amostras de FFPE usando Autostainer Link 48 e módulo de pré-tratamento PT Link (5). Após a incubação com o anticorpo monoclonal primário PD-L1 ou o reagente de controle negativo (NCR), as amostras são incubadas utilizando um anticorpo de vinculação específico às espécies hospedeiras do anticorpo primário e, em seguida, incubadas com reagente de visualização pronto para uso composto por moléculas de anticorpo secundário e moléculas de perioxidase de raiz-forte ligadas à espinha dorsal de um polímero dextrano. A conversão enzimática do cromogênio adicionado posteriormente resulta na precipitação de um produto de reação visível no local do antígeno. A cor da reação cromogênica é modificada por um reagente cromogênico de realce. A amostra pode, então, ser contrastada e recoberta com vidro. Os resultados são interpretados utilizando um microscópio de luz. São fornecidas lâminas de controle contendo duas linhagens celulares humanas embebidas em parafina e fixadas em formalina para validar as séries de marcação. Materiais fornecidos PD-L1 IHC 28-8 pharmdx (Código SK005) Os materiais listados abaixo são suficientes para 50 testes (50 lâminas incubadas com anticorpo primário para PD-L1 e 50 lâminas incubadas com o reagente de controle negativo correspondente; 100 lâminas de teste ao todo). Um anticorpo primário adicional ao PD-L1 é fornecido com o kit para marcação de lâminas de controle de 15 linhagens celulares. O número de testes se baseia no uso de 2 x 150 µl por lâmina de cada reagente, exceto DAB+ e solução de recuperação do alvo. O kit fornece materiais suficientes para, no máximo, 15 séries individuais de marcação. Quantidade Descrição 1 x 34,5 ml Reagente bloqueador da peroxidase PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Solução tamponada contendo peróxido de hidrogênio, detergente e 0,015 mol/l de azido de sódio. (placeholder) P04446BR_01/SK CA/ p. 1/14

2 1 x 19,5 ml Anticorpo primário: Anticorpo monoclonal de coelhos anti-pd-l1, Clone 28-8 MONOCLONAL RABBIT ANTI-PD-L1 CLONE 28-8 Anticorpo monoclonal de coelhos anti-pd-l1 em uma solução tamponada contendo proteína de estabilização e 0,015 mol/l de azido de sódio. 1 x 15 ml Reagente de controle negativo* NEGATIVE CONTROL REAGENT Anticorpo IgG de controle monoclonal de coelhos em uma solução tamponada contendo proteína de estabilização e 0,015 mol/l de azido de sódio. * O IgG de controle monoclonal de coelhos é vendido sob licença da Cell Signaling Technology. 1 x 34,5 ml VINCULADOR, anticorpo de coelhos LINKER, ANTI-RABBIT Anticorpo secundário de camondongos contra imoglobinas de coelhos em uma solução tamponada contendo proteína de estabilização e 0,015 mol/l de azido de sódio. 1 x 34,5 ml Reagente de visualização - HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextrano ligado a moléculas de peroxidase e moléculas de anticorpos secundários de cabras contra imunoglobulinas de coelho e camundongo em uma solução tamponada contendo proteína de estabilização e um agente antimicrobiano. 15 x 7,2 ml Tampão de substrato DAB+ DAB+ SUBSTRATE BUFFER Solução tamponada contendo peróxido de hidrogênio e um agente antimicrobiano. 1 x 5 ml Cromogênio DAB+ DAB+ CHROMOGEN 3,3 - tetracloridrato de diaminobenzidina em solvente orgânico. 1 x 34,5 ml Realçador DAB DAB ENHANCER Sulfato cúprico em água. 6 x 30 ml Solução de recuperação do alvo EnVision FLEX, baixo ph (50X) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Solução tamponada, ph 6.1, contendo detergente e um agente antimicrobiano. 15 lâminas Lâminas de controle PD-L1 IHC 28-8 pharmdx CONTROL SLIDES Cada lâmina contém seções de duas linhagens celulares granulares, embebidas em parafina e fixadas em formalina: NCI-H226** com expressão de proteína PD-L1 positiva e MCF-7 com expressão de proteína PD-L1 negativa. PD-L1, SK005 pharmdx XXXXX MCF-7: Negativo para PD-L1 NCI-H226: Positivo para PD-L1 **Dr. AF Gazdar e Dr. JD Minna da NIH são reconhecidos por sua contribuição no desenvolvimento do NCI-H226 (Número ATCC: CRL-5826 )(6) Observação: todos os reagentes incluídos são formulados especificamente para uso com este kit. De modo que a execução do teste ocorra de acordo com as especificações, nenhuma substituição, a não ser a solução de recuperação do alvo EnVision FLEX, baixo ph (50x) (Código K8005), poderá ser feita. O PD-L1 IHC 28-8 pharmdx foi especialmente criado para uso com o Autostainer Link 48. Consulte os Guias do Usuário do Autostainer Link 48 e do PT Link para obter informações adicionais. (placeholder) P04446BR_01/SK CA/ p. 2/14

3 Materiais necessários, mas não fornecidos Módulo de pré-tratamento PT Link (Código PT100/PT101) Autostainer Link 48 (Código AS480) Tampão de lavagem EnVision FLEX (20x) (Código K8007) Hematoxilina EnVision FLEX (Link) (Código K8008) Água destilada ou deionizada (água reagente) Temporizador Tecidos positivos e negativos para uso como controles de processo (consulte a seção Controle de qualidade e a Tabela 1) Lâminas microscópicas: Lâminas microscópicas Dako FLEX IHC (Código K8020) ou lâminas Fisherbrand Superfrost Plus carregadas Coberturas de vidro Reagentes médios e subordinados de montagem permanente necessários à montagem de coberturas de vidro Microscópio de luz (ampliação objetiva de 4x a 40x) Precauções 1. Para uso com diagnóstico in vitro. 2. Para usuários profissionais. 3. Este produto contém azido de sódio (NaN3), um produto químico altamente tóxico em forma pura. Nas concentrações do produto, embora não classificadas como perigosas, o NaN3 pode reagir com tubulações de chumbo e cobre para formar acúmulos altamente explosivos de azidos de metal. No descarte, lave com bastante água a fim de impedir o acúmulo de azido de metal na tubulação (8). 4. O anticorpo primário, o reagente de controle negativo, o vinculador e o reagente de visualização contêm material de origem animal. 5. As amostras, antes e após a fixação, e todos os materiais a elas expostos, devem ser tratados como capazes de transmitir infecções e descartados observando-se as devidas precauções (9). 6. Os tempos, temperaturas ou métodos de incubação que não sejam os especificados poderão gerar resultados errôneos. 7. Os reagentes foram perfeitamente diluídos. Outras diluições poderão resultar em perda de marcação do antígeno. 8. O reagente de visualização, o cromogênio DAB+ líquido e a solução cromogênea com substrato DAB+ preparado podem sofrer efeitos adversos se expostos a níveis excessivos de luz. Não armazene componentes do sistema nem execute a marcação em luz forte, como a luz direta do sol. 9. Resíduos de parafina poderão falsos negativos. 10. O uso de volumes de reagentes que não sejam os recomendados poderá resultar na perda de imunorreatividade visível do PD-L Grandes seções de tecido ocupando 2/3 da lâmina poderão requerer 3x150 µl de reagente. 12. Como regra geral, pessoas com menos de 18 anos de idade não podem trabalhar com este produto. Os usuários devem ser cuidadosamente orientados sobre os procedimentos de trabalho adequados, as propriedades perigosas do produto e as instruções de segurança necessárias. Consulte a folha de dados de segurança (SDS) para obter informações adicionais. 13. Utilize equipamento de proteção individual adequado a fim de evitar contato com os olhos e a pele. 14. Soluções não utilizadas devem ser descartadas de acordo com as regulamentações locais, nacionais e internacionais. 15. Folha de dados de segurança disponível para usuários profissionais mediante solicitação. Perigo Cromogênio DAB+: 1 a 5% de bifenilo-3,3', 4,4'-tetracloreto de tetrailtetra-amônio H350 Pode causar câncer. H341 Suspeito de provocar falhas genéticas. P201 Obtenha instruções especiais antes de usar. P202 Não manuseie antes de ler e compreender todas as precauções de segurança. P280 Use luvas de proteção. Use proteção para os olhos ou o rosto. Use roupas de proteção. P308 + P313 SE foi exposto ou tem alguma preocupação: procure auxílio médico. P405 Armazene em lugar seguro. P501 Faça o descarte de conteúdos e contêiners de acordo com todas as regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais. Aviso Solução de recuperação do alvo EnVision FLEX, baixo ph (50x): 1 a 5% de ácido cítrico H319 Causa graves irritações nos olhos. H411 Tóxico para a vida aquática com efeitos de longa duração. P280 Use proteção para os olhos ou o rosto. P273 Evite a liberação no meio ambiente. P264 Lave bem as mãos após o manuseio. P305 + P351 + P338 SE CAIR NOS OLHOS: Lave cuidadosamente com água durante alguns minutos. Tire suas lentes de contato se estiver usando alguma e não for difícil removê-las. Continue lavando. P337 + P313 Se a irritação nos olhos persistir: procure auxílio médico. P501 Faça o descarte de conteúdos e contêiners de acordo com todas as regulamentações locais, regionais, nacionais e internacionais. Armazenamento Armazene todos os componentes do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, incluindo as lâminas de controle, no contêiner original em local escuro à temperatura de 2 a 8 C quando não usados no Autostainer Link 48. (placeholder) P04446BR_01/SK CA/ p. 3/14

4 Não use o kit após a data de vencimento impressa na parte externa da caixa do kit. Se o armazenamento dos reagentes for realizado sob condições diferentes das especificadas na bula, o usuário deverá validá-las. Não há sinais óbvios para indicar a instabilidade deste produto; portanto, os controles negativos e positivos devem ser executados simultaneamente utilizando amostras dos pacientes. Preparação das amostras O manuseio de amostras deve visar à preservação do tecido para marcação de IHC. Os métodos padrão de processamento de tecidos devem ser usados em todas as amostras. Seções embebidas em parafina Os tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina são adequados para uso. As condições de manuseio e processamento recomendáveis são: Tempo de isquemia de <30 minutos antes da imersão em fixativo, e tempo de fixação de 24 a 48 horas em 10% de formalina tamponada neutra. Os fixativos alternativos não foram validados e podem gerar resultados errôneos. As amostras devem ser bloqueadas em uma espessura de 3 ou 4 mm, fixadas em 10% de formalina tamponada neutra e desidratadas e purificadas em uma série de alcoóis e xileno, seguido de uma infiltração com parafina derretida. A temperatura da parafina não deve exceder 60 C. As amostras de tecido devem ser cortadas em seções de 4 a 5 µm. Após o corte em seções, os tecidos devem ser montados no Fisherbrand Superfrost Plus, em lâminas carregadas ou em lâminas microscópicas Dako FLEX IHC (Código K8020), e colocados em um forno 58 ± 2 C durante 1 hora. Para preservar a antigenicidade, as seções de tecidos, após montadas em lâminas, devem ser armazenadas em local escuro à temperatura de 2 a 8 C ou a uma temperatura ambiente de até 25 C e marcadas em até 4 meses após o corte em seções. As condições de armazenamento e manuseio de lâminas não devem exceder 25 C em nenhum ponto após a montagem de modo a garantir a integridade e a antigenicidade do tecido. O uso do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx em tecidos descalcificados não foi validado nem é recomendável. Preparação do reagente Os seguintes reagentes devem ser preparados antes da marcação: Solução de recuperação do alvo EnVision FLEX, baixo ph (50x) Prepare uma quantidade suficiente de solução de recuperação do alvo 1x, baixo ph, diluindo a solução de recuperação do alvo, baixo ph (50x) 1:50 usando água reagente; o ph da solução de recuperação do alvo 1x deve ser 6,1 ± 0,2. Um frasco de 30 ml contendo solução de recuperação do alvo, baixo ph (50x), diluída a 1:50, fornecerá 1,5 l de reagente 1x, suficiente para encher um tanque PT Link, que tratará até 24 lâminas por uso. Descarte a solução de recuperação do alvo 1x após três utilizações e não mais do que 5 dias após a diluição. Soluções adicionais de recuperação do alvo EnVision FLEX, baixo ph (50x), se necessárias, estarão disponíveis como Código K8005. Tampão de lavagem EnVision FLEX (20x) Prepare uma quantidade suficiente de tampão de lavagem (20x) 1:20 usando água reagente de qualidade para as etapas de lavagem. Armazene as soluções 1x não utilizadas à temperatura de 2 a 8 ºC por não mais de um mês. Descarte tampões com aspecto turvo. Consulte os Guias do Usuário do Autostainer Link 48 para obter informações adicionais. O tampão de lavagem EnVision FLEX (20x) está disponível como Código K8007. Solução cromogênea com substrato DAB+ A solução deve ser bem misturada antes do uso. Qualquer sedimentação em desenvolvimento na solução não afeta a qualidade da marcação. Para preparar a solução cromogênea com substrato DAB+, adicione uma gota de cromogênio DAB+ líquido por ml de tampão de substrato DAB+ e misture. O cromogêneo com substrato preparado permanece estável por 5 dias se armazenado em local escuro à temperatura de 2 a 8 C. Observações importantes: Se estiver usando um frasco inteiro de tampão de substrato DAB+, adicione 9 gotas de cromogênio DAB+. Embora o rótulo informe 7,2 ml, este é o volume utilizável e não considera o "volume morto" do frasco. A cor do cromogênio DAB+ líquido no frasco pode variar de transparente a marrom-lavanda. Isso não afetará o desempenho do produto. Dilua de acordo com as diretrizes acima. A adição do excedente de cromogênio DAB+ líquido no tampão de substrato DAB+ resultará em deterioração do sinal positivo. Procedimento de marcação no Autostainer Link 48 Observações práticas O usuário deve ler cuidadosamente estas instruções e se familiarizar com todos os componentes e instrumentos antes de usá-los (consulte as Precauções). Todos os reagentes devem ser normalizados à temperatura ambiente (20 a 25 C) antes da imunomarcação. Do mesmo modo, todas as incubações devem ser realizadas à temperatura ambiente. Não deixe que as seções de tecidos se sequem durante o procedimento de marcação. Seções de tecido secas podem apresentar aumento de marcação não específica. Todas as etapas necessárias e os tempos de incubação para marcação são pré-programados no software Dako Link. Consulte os Guias do Usuário do Autostainer Link 48 e do PT Link para obter informações adicionais sobre como programar protocolos e carregar lâminas e reagentes. (placeholder) P04446BR_01/SK CA/ p. 4/14

5 Observação: os reagentes e as instruções fornecidas neste sistema foram projetados para proporcionar desempenho máximo quando usados com os reagentes e materiais recomendados. Outras diluições dos reagentes ou alterações nos tempos de incubação ou temperaturas poderão gerar resultados errôneos ou discrepantes. Protocolo de marcação Selecione o protocolo de marcação PD-L1 IHC 28-8 pharmdx no menu suspenso do DakoLink. Todas as etapas necessárias e os tempos de incubação para marcação são pré-programados no DakoLink. Se a lista de protocolos PD-L1 IHC 28-8 pharmdx adequados não estiver no seu servidor, entre em contato com o Representante de serviços técnicos local. Etapa 1: Procedimento de desparafinação, reidratação e recuperação do alvo (3 em 1) Procedimento recomendado: Para obter detalhes, consulte o Guia do Usuário do PT Link. Ajuste o pré-aquecimento e o resfriamento do PT Link (Código PT100/PT101) em 65 C. Ajuste o aquecimento em 97 C durante 20 minutos. Encha os tanques do PT Link com 1,5 l de solução de recuperação do alvo por tanque, baixo ph, solução de trabalho 1x para cobrir as seções de tecido. Pré-aqueça a solução de recuperação do alvo em 65 C. Submerja os racks do Autostainer contendo seções de FFPE montadas na solução de recuperação do alvo pré-aquecida, baixo ph (solução de trabalho 1x) no tanque do PT Link. Incube durante 20 minutos a 97 C. Tão logo o tempo de incubação da recuperação do alvo seja atingido e a temperatura resfrie para 65 C, remova cada um dos racks de lâminas do Autostainer com as lâminas do tanque do PT Link e coloque imediatamente o rack do Autostainer com as lâminas em um tanque (por ex., estação de lavagem do PT Link, Código PT109) contendo tampão de lavagem diluído à temperatura ambiente (Código K8007). Deixe as lâminas no tampão de lavagem diluído à temperatura ambiente durante 5 minutos. Etapa 2: Procedimento de marcação Após o procedimento de desparafinação, reidratação e recuperação do alvo (3 em 1), os racks do Autostainer com lâminas são colocados no Autostainer Link 48. Verifique se as lâminas permanecem úmidas com o tampão durante o carregamento e antes do início da série. O instrumento executará o processo de marcação aplicando o reagente adequado, monitorando o tempo de incubação e lavando as lâminas entre os reagentes. Os tempos do reagente são pré-programados no software Dako Link. Etapa 3: Corante de contraste As lâminas devem ser contrastadas durante 7 minutos com hematoxilina EnVision FLEX (Link) (Código K8008). O tempo de incubação da hematoxilina é pré-programado no protocolo. Etapa 4: Montagem É necessária uma mídia de montagem permanente não aquosa. Observação: com o tempo, as lâminas poderão perder um pouco da marcação, dependendo de diversos fatores, incluindo, mas não se limitado a, contrastação, materiais e métodos de montagem e condições de armazenamento das lâminas. Para reduzir o desbotamento, armazene as lâminas em ambiente escuro à temperatura ambiente (20 a 25 C). Controle de qualidade Os reagentes no PD-L1 IHC 28-8 pharmdx foram submetidos a controles de qualidade por imuno-histoquímica usando os procedimentos de marcação e de recuperação do alvo descritos acima. Desvios nos procedimentos recomendados de fixação, processamento e embebimento de tecidos no laboratório do usuário poderão produzir variações significativas nos resultados. Controles de qualidade deverão ser incluídos em cada série de marcação. Esses controles de qualidade são especificados na Tabela 1 e incluem: uma amostra de tecido de paciente marcado com H&E, tecidos de controle positivos e negativos fornecidos em laboratório e uma lâmina de controle fornecida pela Dako (11). Nos EUA, consulte as diretrizes de controle de qualidade do Programa de Certificação para Imuno-histoquímica da College of American Pathologists (CAP); consulte também o Controle de Qualidade para Imunocitoquímica da CLSI, Diretriz Aprovada (10), para obter informações adicionais. Verificação de ensaio Antes de usar inicialmente um sistema de marcação em determinado procedimento de diagnóstico, o usuário deve verificar o desempenho do ensaio testando-o em uma série de tecidos fornecidos em laboratório com características de desempenho de IHC conhecidas representando tecidos positivos e negativos conhecidos. Consulte os procedimentos de controle de qualidade descritos anteriormente nesta seção da bula do produto. Esses procedimentos de controle de qualidade devem ser repetidos em cada novo kit ou sempre que houver uma mudança nos parâmetros do ensaio. As opções de solução de problemas potenciais, suas causas e ações corretivas sugeridas estão descritas na Tabela 7. Interpretação da marcação - NSCLC não escamoso A avaliação de lâminas deve ser executada por um patologista usando um microscópio de luz. Para avaliar a pontuação e a marcação imunohistoquímica do PD-L1, é possível usar uma ampliação objetiva de 4x na avaliação inicial de toda a amostra, seguida dos objetivos 10 a 20x para pontuação (é possível usar 40x para fins de confirmação, se necessário). A marcação PD-L1 é indicada com produto de reação marrom (diaminobenzidina 3,3', DAB). Marcação positiva do PD-L1 é definida como uma marcação circunferencial completa ou linear parcial na membrana plasmática de células tumorais de qualquer intensidade. Toda a amostra deve ser avaliada. Todas as células tumorais viáveis em toda a lâmina do paciente com marcação de PD-L1 devem ser avaliadas e incluídas na avaliação de pontuação do PD-L1. Uma quantidade mínima de 100 células tumorais viáveis deve estar presente na lâmina do paciente com marcação de PD-L1 para determinar a porcentagem de células marcadas. A marcação citoplasmática, se existente, não é considerada para fins de pontuação. Células malignas e células imunológicas (por ex., infiltração de linfócitos ou macrófagos) também podem ser marcadas com PD-L1; no entanto, elas não devem ser incluídas na pontuação para determinação da positividade do PD-L1. Para cada série de marcação, as lâminas devem ser examinadas na ordem apresentada na Tabela 1 a fim de determinar a validade da série de marcação e possibilitar a avaliação da marcação do tecido de amostra. (placeholder) P04446BR_01/SK CA/ p. 5/14

6 Consulte o Manual de Interpretação do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx para obter informações sobre Câncer de pulmão de células não pequenas não escamosas para obter orientações adicionais. Tabela 1: Ordem recomendada para a avaliação de lâminas Amostras Base lógica Requisitos 1. H&E (fornecido em laboratório) Uma marcação de hematoxilina e eosina (H&E) da amostra do tecido é avaliada primeiro para analisar a histologia do tecido e a qualidade da preservação. 2. Lâmina de controle (fornecida pela DAKO) A lâmina de controle marcada com o anticorpo PD-L1 primário do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx deve ser examinada para averiguar se todos os reagentes estão funcionando corretamente. A lâmina de controle contém a pellet de linhagem de células positivas do PD-L1 e a pellet de linhagem de células negativas do PD-L1. A marcação de PD-L1 IHC 28-8 pharmdx e de H&E deve ser executada nas seções em série no mesmo bloco de parafina da amostra. As amostras de tecidos devem estar intactas, bem preservadas, e devem confirmar a indicação de tumor. Uma lâmina de controle deve ser marcada com o anticorpo primário no PD-L1 em cada série de marcação. Critérios de aceitação do NCI-H226 (linhagem de células de controle positivas do PD-L1): Marcação de membrana plasmática de 80% das células em uma intensidade de coloração média de 2 +. Intensidade de < 1+ de marcação não específica. Critérios de aceitação do MCF-7 (linhagem de células de controle negativas do PD-L1): Nenhuma marcação específica. Intensidade de < 1+ de marcação não específica. Veja que a marcação de algumas células na pallet de células MCF-7 pode ser observada ocasionalmente. Os seguintes critérios de aceitação são aplicáveis: a presença de 10 de células no total com diferentes marcações de membrana plasmática ou a marcação citoplasmática com 1+ de intensidade nos limites da pellet de células MCF-7 são aceitáveis. 3. Lâminas de tecido de controle positivo (fornecidas em laboratório) 4. Lâminas de tecido de controle negativo (fornecidas em laboratório) 5. Lâmina de tecido do paciente marcada com reagente de controle negativo As lâminas de tecido de controle positivo marcadas com anticorpo PD-L1 primário e reagente de controle negativo devem ser examinadas em seguida. Essas lâminas verificam se o método de fixação e o processo de recuperação do alvo são eficazes. Os controles de tecido positivo conhecidos devem ser usados apenas no monitoramento do desempenho correto dos tecidos processados e dos reagentes de teste, e NÃO como um a formulação auxílio na formulação de um diagnóstico específico das amostras dos pacientes. As lâminas de controle de tecido negativo (conhecidas como negativas para PD-L1) marcadas com anticorpo PD-L1 primário e reagente de controle negativo devem ser examinadas na sequência de modo a verificar a especificidade da indicação do antígeno alvo pelo anticorpo primário. Como alternativa, as partes negativas do tecido de controle positivo podem funcionar como o tecido de controle negativo, mas isso deve ser verificado pelo usuário. Examine amostras dos pacientes marcadas com o reagente de controle negativo do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. O reagente de controle negativo é usado em substituição ao anticorpo primário e ajuda na interpretação da marcação específica no local do antígeno. Se uma das linhagens de células de controle não atender a esses critérios, todos os resultados com as amostras do paciente deverão ser considerados inválidos. Os controles devem ser amostras de biópsias/cirúrgicas da mesma indicação de tumor da amostra do paciente, fixas, processadas e embebidas tão logo possível da mesma maneira que as amostras dos pacientes. Use amostras intactas na interpretação dos resultados de marcação, pois as células necróticas ou degeneradas frequentemente geram marcações de forma não específica. Os tecidos selecionados para uso como controles de tecido positivo devem gerar marcação positiva de fraca a moderada quando marcados com PD-L1 para auxiliar na detecção de mudanças sutis na sensibilidade do ensaio. Duas lâminas de controle de tecido positivo devem ser incluídas em cada série de marcação. Lâmina marcada com PD-L1: A presença de marcação de membrana plasmática marrom deve ser observada. A marcação não específica deve ser 1+. Lâmina marcada com reagente de controle negativo: Nenhuma marcação da membrana. A marcação não específica deve ser 1+. Se os controles de tecido positivo não demonstrarem a devida marcação positiva, os resultados com as amostras de teste deverão ser considerados inválidos. Os controles devem ser amostras de biópsias/cirúrgicas da mesma indicação de tumor da amostra do paciente, fixas, processadas e embebidas tão logo possível da mesma maneira que as amostras dos pacientes. Duas lâminas de controle de tecido negativo devem ser incluídas em cada série de marcação. Lâmina marcada com PD-L1: Nenhuma marcação da membrana em células tumorais. A marcação não específica deve ser 1+. Lâmina marcada com reagente de controle negativo: Nenhuma marcação da membrana. A marcação não específica deve ser 1+. Se for específico membrana plasmática marcação ocorre no lâminas de controle de tecido positivo, resultados com a amostra do paciente deve ser considerada inválida. A ausência da marcação da membrana plasmática verifica a identificação específica do antígeno alvo pelo anticorpo PD-L1 primário. A marcação não específica deve ser 1+. (placeholder) P04446BR_01/SK CA/ p. 6/14

7 6. Lâmina de tecido do paciente marcada com anticorpo PD-L1 primário Examine toda a lâmina das amostras dos pacientes marcadas com o anticorpo PD-L1 primário do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx por último. Consulte Resumo e explicação, limitações e características de desempenho para obter informações específicas sobre a imunorreatividade do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. A intensidade da marcação positiva deve ser avaliada no contexto de qualquer marcação de fundo não específica observada na lâmina do reagente de controle negativo na mesma série. Como em qualquer teste imuno-histoquímico, um resultado negativo significa que o antígeno não foi detectado, e não necessariamente que o antígeno estava ausente nas células/tecido ensaiados. Todas as células tumorais viáveis em toda a lâmina do paciente com marcação de PD-L1 devem ser avaliadas e incluídas na avaliação de pontuação do PD-L1. Uma quantidade mínima de 100 células tumorais viáveis deve estar presente na lâmina do paciente com marcação de PD-L1 para determinar a porcentagem de células marcadas. Limitações gerais 1. A imuno-histoquímica é um processo de diagnóstico em várias etapas que requer treinamento especializado na seleção dos reagentes adequados; seleção, fixação e processamento de tecidos; preparação da lâmina imuno-histoquímica, e interpretação dos resultados da marcação. 2. A marcação do tecido depende do manuseio e processamento do tecido antes da marcação. Fixação inadequada, congelamento, descongelamento, lavagem, secagem, aquecimento, corte em seções ou contaminação com outros tecidos ou fluídos podem produzir artefatos, aprisionamento de anticorpos ou resultados de falsos negativos. Resultados inconsistentes poderão ser motivados por variações nos métodos de fixação e embebimento ou irregularidades inerentes no tecido. 3. A contrastação excessiva ou incompleta poderá comprometer a interpretação correta dos resultados. 4. A interpretação clínica de qualquer marcação positiva ou sua ausência deve ser avaliada no contexto da apresentação clínica, da morfologia e de outros critérios histopatológicos. A interpretação clínica de qualquer marcação, ou sua ausência, deverá ser complementada por estudos morfológicos e controles adequados, bem como por outros testes de diagnóstico. É de responsabilidade do patologista qualificado, que esteja familiarizado com os anticorpos, reagentes e métodos utilizados, interpretar a lâmina marcada. A marcação deve ser realizada em laboratório certificado e licenciado sob a supervisão de um patologista responsável por analisar as lâminas marcadas e garantir a adequação de controles positivos e negativos. 5. Os tecidos de pessoas infectadas com o vírus da hepatite B e contendo antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) podem apresentar marcação não específica com peroxidase de raiz-forte (11). 6. A possibilidade de reações inesperadas nos tipos de tecidos testados não deve ser totalmente eliminada devido à variabilidade biológica da expressão do antígeno em neoplasmas ou outros tecidos patológicos. Entre em contato com Suporte Técnico da Dako com reações inesperadas devidamente documentadas. 7. Poderão ser constatados resultados de falsos positivos devido a ligações não imunológicas de proteínas ou produtos de reação de substrato. Estes poderão também ser causados por atividade de pseudoperoxidase (eritrócitos) e atividade de peroxidase endógena (citocromo c) (10). 8. Os reagentes e as instruções fornecidas neste sistema foram projetados para proporcionar desempenho máximo. Outras diluições dos reagentes ou alterações nos tempos de incubação ou temperaturas poderão gerar resultados errôneos ou discrepantes. Limitações específicas ao produto 1. Os resultados de falsos negativos podem ser causados pela degradação do antígeno nos tecidos com o passar do tempo. As seções de tecidos, após montadas em lâminas, devem ser armazenadas em local escuro à temperatura de 2 a 8 C ou a uma temperatura ambiente de até 25 C e marcadas em até 4 meses após o corte em seções. As condições de armazenamento e manuseio de lâminas não devem exceder 25 C em nenhum ponto após a montagem de modo a garantir a integridade e a antigenicidade do tecido. 2. Para obter resultados reproduzíveis e ideais, a proteína PD-L1 requer pré-tratamento de recuperação do alvo quando os tecidos são fixados de forma rotineira (formalina tamponada neutra) e embebidos em parafina. 3. Não substitua os reagentes de outros números de lote deste produto ou de kits de outros fabricantes. A única exceção é a solução de recuperação do alvo EnVision FLEX, baixo ph (50x), que, se necessária, está disponível como Código K As linhagens de células de controle marcadas devem ser usadas exclusivamente na validação da série de marcação, e não na pontuação da reação de marcação nas seções dos tecidos. 5. O uso do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx em tecidos com fixativos não correspondentes a 10% de formalina tamponada neutra não foi validado. 6. As biópsias excisionais, incisionais, por punção ou de agulha foram consideradas tipos de amostra aceitáveis para os ensaios clínicos usando o PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. As punções aspirativas com agulha fina ou outras amostras citológicas foram insuficientes para as análises do biomarcador e excluídas dos ensaios clínicos usando o PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Avaliação de desempenho não clínica Especificidade analítica do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx O anticorpo primário do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx é um anticorpo monoclonal de coelho anti-pd-l1 humano, clone O imunogênio usado na criação do anticorpo é um PD-L1 recombinante humano e purificado contendo o domínio extracelular (Phe19-Thr239) do PD-L1 humano. A marcação de IHC com o anticorpo PD-L1 primário não apresentou nenhuma reatividade cruzada para o PD-L2 expressa de forma exógena em células do ovário de hamsters chineses (CHO). O PD-L1 IHC 28-8 pharmdx detecta especificamente a proteína da membrana do PD-L1 expressa em células tumorais em tecidos FFPE, que pode ser totalmente eliminada pela adição do antígeno do PD-L1. O PD-L1 IHC 28-8 pharmdx não detecta a proteína da membrana do PD-L1 em células tumorais knock-out do PD-L1, nas quais o gene do PD-L1 é geneticamente excluído. Tecidos normais e neoplásicos A tabela 2 resume a imunorreatividade do anticorpo monoclonal de coelhos anti-pd-l1 humano no painel recomendado dos tecidos normais. A tabela 3 resume a imunorreatividade do anticorpo monoclonal de coelhos anti-pd-l1 humano sobre os tecidos neoplásticos em micromatrizes de tecidos multitumor. Todos os tecidos foram fixados em formalina, embebidos em parafina e marcados com PD-L1 IHC 28-8 pharmdx de acordo com as instruções desta bula. O PD-L1 IHC 28-8 pharmdx detectou a proteína PD-L1 localizada na membrana plasmática dos tipos de células que expressam o antígeno do PD-L1, como, por exemplo, células imunológicas e células de origem epitelial, principalmente células tumorais. (placeholder) P04446BR_01/SK CA/ p. 7/14

8 Tabela 2: Resumo da reatividade de tecidos normais do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Tipo de tecido (qtd. testada) Marcação de membrana plasmática positiva: Elementos do tecido Marcação citoplasmática positiva: Elementos do tecido Amígdala (3) 3/3 Epitélio cripta 0/3 3/3 Centro germinal (células imunológicas) Baço (3) 1/3 Macrofágos 0/3 3/3 Célula litoral Células mesoteliais (3) 0/3 0/3 Cerebelo (3) 0/3 0/3 Cérebro (3) 0/3 0/3 Colo do útero (3) 1/3 Epitélio 1/3 Epitélio Cólon (3) 2/3 Macrofágos 0/3 Esôfago (3) 0/3 0/3 Estômago (3) 0/3 0/3 Fígado (3) 2/3 Células imunológicas 2/3 Células imunológicas Glândula pituitária (3) 1/3 Adenohipófise anterior 1/3 Adenohipófise anterior 3/3 Neurohipófise posterior Glândula salivar (3) 0/3 0/3 Intestino delgado (2) 0/2 0/2 Mama (3) 0/3 0/3 Medula óssea (3) 3/3 Megacariócitos 3/3 Megacariócitos Músculo, cardíaco (3) 0/2 0/2 Músculo, esquelético (3) 0/2 0/2 Nervo, periférico (3) 0/3 0/3 Ovário (3) 0/3 0/3 Pâncreas (3) 3/3 Epitélio (principalmente ilhotas) 3/3 Epitélio (principalmente ilhotas) Paratireoide (3) 3/3 Epitélio 0/3 Pele (3) 0/3 1/3 Epitélio Próstata (2) 0/2 0/2 Pulmão (3) 3/3 Macrófagos alveolares 0/3 Rim (3) 3/3 Epitélio tubular 3/3 Epitélio tubular Suprarrenal (3) 3/3 Células medulares 3/3 Células medulares Testículo (3) 0/3 2/3 Célula de Leydig Timo (3) 3/3 Epitélio medular 0/3 Tireoide (3) 0/3 0/3 Útero (3) 0/3 0/3 Tabela 3: Resumo da reatividade de tecidos neoplásticos do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Tipo de tumor Localização/órgão Positivo para PD-L1/total (N = 162) Apêndice 1/1 Mama, DCIS 0/2 Mama, ductal invasivo 3/7 Mama, ductal invasivo metastático com o linfonodo 1/1 Carcinoma broncoalveolar, pulmão 0/1 Colo do útero, tipo endocervical 0/1 Cólon 2/5 Cólon, metastático com o fígado 1/1 Cólon, mucinoso 0/1 Esôfago 1/1 Vesícula biliar 2/4 GI, metastático com o pulmão 0/1 Cabeça e pescoço, palato duro 0/1 Pulmão 2/5 Ovário 0/1 Adenocarcinoma Ovário, endometrioide 0/1 Ovário, mucinoso 0/1 Ovário, secreção serosa 0/1 Pâncreas 1/2 Pâncreas, ductal 0/3 Próstata 2/4 Reto 2/4 Glândula salivar/glândula parótida 0/2 Intestino delgado 0/2 Estômago 1/6 Estômago, mucinoso 0/1 Tireoide, folicular 0/1 Tireoide, folicular-papilar 0/1 Tireoide, papilar 0/3 Útero, células claras 1/1 Útero, endométrio 1/3 Astrocitoma Cérebro 0/3 (placeholder) P04446BR_01/SK CA/ p. 8/14

9 Tipo de tumor Localização/órgão Positivo para PD-L1/total (N = 162) Carcinoma Nasofaríngeo, NPC 0/1 Células claras Rim 0/6 Papilar Rim 0/1 Carcinoma adrenocortical Suprarrenal 0/1 Carcinoma da célula basal Pele 0/1 Carcinoma no ovário de células em anel de sinete do cólon Carcinoma de células em anel de 0/1 metatástico sinete Cólon 0/1 Carcinoma em nódulo linfático de células escamosas esofaguianas metastáticas 1/1 Colo do útero 2/4 Carcinoma de células escamosas Esôfago 4/7 Cabeça e pescoço 0/2 Pulmão 1/3 Pele 1/2 Útero 1/1 Carcinoma de células grandes Pulmão 1/1 Carcinoma de células pequenas Pulmão 1/2 Carcinoma de células renais Carcinoma de células transicionais Bexiga 3/6 Rim 0/1 Carcinoma do embrião Testículo 0/1 Carcinoma hepatocelular Fígado 1/5 Carcinoma medular Tireoide 0/1 Cordoma Cavidade pélvica 0/1 Ependimoma Cérebro 0/1 Espermatocitoma Testículo 0/2 Glioblastoma Cérebro 0/1 Hepatoblastoma Fígado 0/1 Cólonnnnnnn 0/1 Intersticialoma Reto 0/1 Intestino delgado 0/1 Linfoma Célula B difusa Nódulo linfático 2/4 Célula grande anaplásica Nódulo linfático 1/1 Hodgkin Nódulo linfático 2/2 Não de Hodgkin Nódulo linfático 1/1 Lipossarcoma Cavidade abdominal, mucinosa 0/1 Medulablastoma Cérebro 0/1 Melanoma Retooooooooo 0/1 Melanoma Cavidade nasal 0/1 Meningioma Cérebro 0/2 Mesotelioma Peritônio 0/1 Neuroblastoma Retroperitônio 0/1 Neuroectodermal primitivo Retroperitônio 0/1 Neurofibroma Tecido mole, parte inferior das costas 0/1 Sarcoma Células claras Parede abdominal 0/1 Condrossarcoma Osso 0/1 Leiomiossarcoma Tecido mole, parede torácica 0/1 Bexiga 0/1 Lipossarcoma Cavidade abdominal, mucinosa 0/1 Osteossarcoma Osso 0/2 Tecido mole, embrionário 0/1 Rabdomiossarcoma Próstata 0/1 Retroperitônio 0/1 Sarcoma sinovial Cavidade pélvica 0/1 Seminoma Testículo 0/2 Timoma Mediastino 1/1 Tumor na ilhota Pâncreas 0/1 Sensibilidade analítica: NSCLC não escamoso A sensibilidade analítica do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx foi testada em 112 casos únicos de amostras de melanoma exclusivo FFPE não escamoso divididos em estágios de I a IV com o uso de um lote de produção fabricado. A avaliação da expressão do PD-L1 demonstrou marcações em um intervalo de 0 e 100% de células tumorais positivas e uma intensidade de marcação de 0 a 3. Repetibilidade/ Reprodutibilidade externa: NSCLC não escamoso A repetibilidade e a reprodutibilidade externa do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx foi avaliada na DAKO em três locais de teste externos, respectivamente. Os dados de desempenho são fornecidos nas Tabelas 4 e 5. Concordância percentual negativa (NPA) concordância percentual positiva (PPA) e concordância percentual geral (OA) de comparação de pares independentes dos testes foram determinadas (placeholder) P04446BR_01/SK CA/ p. 9/14

10 para cada nível de expressão do PD-L1 avaliado. A observação mais frequente foi aplicada como uma referência para calcular a NPA, PPA, a OA e a o intervalo de confiança de 95% da Pontuação Wilson; portanto, um dos resultados com essa observação foi excluído da comparação em pares. Tabela 4: Repetibilidade de PD-L1 IHC 28-8 pharmdx - NSCLC não escamoso % de concordância (95% CI) Repetibilidade Método Nível de expressão 1% Nível de expressão 5% Nível de expressão 10% Inter-instrumento Cada uma das 10 amostras de NSCLC NPA 100 (82,4, 100) NPA 100 (86,2, 100) NPA 100 (91,6, 100) não escamoso com uma variedade de PPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (90,4, 100) PPA 100 (82,4, 100) expressões do PD-L1 IHC foi testada com três réplicas em cada um dos três instrumentos Autostainer Link 48. Um total de 60 comparações em pares foram realizadas. OA 100 (94,0, 100) OA 100 (94,0, 100) OA 100 (94,0, 100) Interanalista Inter-dia Inter-lote Intrassérie Cada uma das 12 amostras de NSCLC não escamoso com uma variedade de expressões do PD-L1 IHC foi testada com três réplicas por três analistas em um instrumentos Autostainer Link 48. Um total de 72 comparações em pares foram realizadas. Cada uma das 10 amostras de NSCLC não escamoso com uma variedade de expressões do PD-L1 IHC foi testada com três réplicas por cinco dias consecutivos em um instrumentos Autostainer Link 48. Um total de 80 comparações em pares foram realizadas. Cada uma das 20 amostras de NSCLC não escamoso com uma variedade de expressões do PD-L1 IHC foi testada com duas réplicas, cada uma com três lotes de reagente, no instrumentos Autostainer Link 48. Um total de 160 comparações em pares foram realizadas. Cada uma das 10 amostras de NSCLC não escamoso com uma variedade de expressões do PD-L1 IHC foi testada com oito réplicas em uma série em um instrumentos Autostainer Link 48. Um total de 70 comparações em pares foram realizadas. NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (94,3, 100) PPA 100 (96,2, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (84,5, 100) PPA 100 (92,7, 100) OA 100 (94,8, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (88,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (89,3, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (95,4, 100) PPA 100 (95,4, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (87,9 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,8, 100) NPA 100 (93,4, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 98,2 (90,6, 99,7) PPA 100 (86,2, 100) OA 98,8 (93,3, 99,8) NPA 100 (96,4, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (92,7, 100) PPA 100 (84,5, 100) OA 100 (94,8, 100) Tabela 5: Reprodutibilidade do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx - NSCLC não escamoso, testado em três locais externos % de concordância (95% CI) Reprodutibilidade Método Nível de expressão 1% Nível de expressão 5% Ensaio inter-local (três locais) Cada uma das 10 amostras de NSCLC não escamoso com uma variedade de expressões do PD-L1 IHC foi testada em cinco dias consecutivos. A Inter-análise foi realizada em três locais com um total de 140 comparações em pares independente. Ensaio intra-local Cada uma das 10 amostras de NSCLC não escamoso com uma variedade de expressões do PD-L1 IHC foi testada em cinco dias consecutivos em cada um dos três locais do estudo. A análise intra-local foi realizada para três locais em um total de 120 comparações em pares independentes. Inter-observador (um observador em cada um dos três locais) Intra-observador (um observador em cada um dos três locais) Pontuação de 15 amostras de NSCLC não escamoso com uma variedade de expressão do PD-L1 IHC, marcado com PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, foi realizado por três patologistas, um em cada um dos três locais de estudo, em três dias nãoconsecutivos. A análise inter-observador foi realizada em três locais com um total de 120 comparações em pares independente. Pontuação de 15 amostras de NSCLC não escamoso com uma variedade de expressão do PD-L1 IHC, marcado com PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, foi realizado por três patologistas, um em cada um dos três locais de estudo, em três dias nãoconsecutivos. A análise intra-observador foi realizada para três locais em um total de 90 comparações em pares independentes. NPA 100 (93,6, 100) PPA 98,8 (93,6, 99,8) OA 99,3 (96,1, 99,9) NPA 100 (92,6, 100) PPA 98,6 (92,5, 99,8) OA 99,2 (95,4, 99,9) NPA 96,9 (89,3, 99,1) PPA 100 (93,6, 100) OA 98,3 (94,1, 99,5) NPA 95,8 (86,0, 98,8) PPA 100 (91,6, 100) OA 97,8 (92,3, 99,4) NPA 91,4 (82,5, 96,0) PPA 97,1 (90,2, 99,2) OA 94,3 (89,1, 97,1) NPA 96,4 (87,9, 99,0) PPA 95,3 (87,1, 98,4) OA 95,8 (90,6, 98,2) NPA 100 (94,3, 100) PPA 89,3 (78,5, 95,0) OA 95,0 (89,5, 97,7) NPA 100 (93,1, 100) PPA 100 (90,8, 100) OA 100 (95,9, 100) (placeholder) P04446BR_01/SK CA/ p. 10/14

11 Avaliação do desempenho clínico: NSCLC não escamoso A utilidade clínica do PD-L1 IHC 28-8 pharmdx foi avaliada no CA209057, um estudo de fase 3, randomizado aberto de nivolumab em comparação com docetaxel em pacientes adultos ( 18 anos) com NSCLC avançado ou metastático após insucesso no tratamento anterior com quimioterapia com base em platina. Um total de 582 pacientes foram randomizados em 112 locais em 22 países (Argentina, Austrália, Áustria, Brasil, Canadá, Chile, República Tcheca, França, Alemanha, Hong Kong, Hungria, Itália, México, Noruega, Peru, Polônia, Romênia, Federação Russa, Cingapura, Espanha, Suíça e Estados Unidos). Os pacientes foram randomizados 1:1 e estratificados de acordo com 1) uso anterior de terapia de manutenção x sem uso de terapia de manutenção e 2) terapia de segunda linha x terceira linha. Amostras pré-estudo do tecido tumoral (linha de base) foram coletadas antes de randomização e antes do primeiro tratamento para realizar a análise de eficácia pré-planejada de acordo com os níveis de expressão predefinidos do PD-L1 (objetivo secundário). O desfecho primário foi a sobrevida geral (SG). Outros desfechos secundários foram a taxa de resposta objetiva (ORR), sobrevida livre de progressão (PFS) e melhora dos sintomas relacionados à doença por 12 semanas, como medido pela Escala de Sintomas de Câncer Pulmonar (LCSS). As características basais demográficas e da doença foram equilibradas entre os pacientes randomizados nos grupos de nivolumab e docetaxel. A média de idade foi de 62 anos (faixa: 21 a 85) com 34% 65 anos de idade e 7% mais de 75 anos de idade. A maioria dos pacientes eram brancos (92%) e do sexo masculino (55%); linha de base do status do desempenho ECOG era 0 (31%) ou 1 (69%). Setenta e nove por cento dos pacientes eram fumantes/ex-fumantes. Foram coletadas amostras tumorais de tumores NSCLC não escamoso, consistente com os requisitos de inclusão para o estudo. As frequências da expressão do PD-L1 em cada um dos os níveis de expressão predefinidos da linha de base para todos os pacientes randomizado no CA são apresentados na Tabela 6. Tabela 6: Frequência da expressão pré-estudo do PD-L1 expressão em indivíduos randomizados com NSCLC não escamoso - CA Categoria da expressão do PD-L1 na População Nivolumab 3 mg/kg (N = 292) Docetaxel (N = 290) Total (N = 582) Geral PD-L1 quantificável na linha de base (N(%)) 231 (79,1) 224 (77,2) 455 (78,2) Expressão do PD-L1 1% 123/231 (53,2) 123/224 (54,9) 246/455 (54,1) Linha de base para a expressão do PD-L1 < 1% 108/231 (46,8) 101/224 (45,1) 209/455 (45,9) Linha de base para a expressão do PD-L1 5% 95/231 (41,1) 86/224 (38,4) 181/455 (39,8) Linha de base para a expressão do PD-L1 < 5% 136/231 (58,9) 138/224 (61,6) 274/455 (60,2) Linha de base para a expressão do PD-L1 10% 86/231 (37,2) 79/224 (35,3) 165/455 (36,3) Linha de base para a expressão do PD-L1 < 10% 145/231 (62,8) 145/224 (64,7) 290/455 (63,7) PD-L1 não quantificável (N(%)) 61 (20,9) 66 (22,8) 127 (21,8) Pacientes com expressão do PD-L1 em todos os níveis predefinidos de expressão no grupo OPDIVO foram associados a uma melhor sobrevida em comparação com o docetaxel, enquanto a sobrevida foi semelhante ao do docetaxel em pacientes com nenhuma expressão do PD-L1. Diferenças significativas na mediana da SG foram observadas em nivolumab em comparação com os subgrupos docetaxel quando analisado pelo nível de expressão do PD-L1. A mediana de SG foi 17,1, 18,2 e 19,4 meses para indivíduos tratados com nivolumab em comparação com 9,0, 8,1 e 8,0 meses para indivíduos tratados com docetaxel níveis de expressão de PD-L1 de 1%, 5% e 10%, respectivamente. Não houve diferenças na SG entre os grupos de tratamento em pacientes com níveis de expressão < 1 %, < 5% e < 10%, com intervalos de mediana de SG de 9,7 a 10,4 meses para nivolumab e 10,1 a 10,3 meses para docetaxel. A razão de risco (HR) não estratificada e a média de sobrevida geral (SG) são apresentados na Figura 1. O Gráfico de Kaplan-Meier para subgrupos por nível de expressão de PD-L1 é mostrado na Figura 2 e na Figura 3. Figura 1: Forest Plot - SG baseada na expressão do PD-L1 em pacientes com NSCLC - CA Mediana de SG (meses) Nível de expressão de PD-L1 HR não OPDIVO Docetaxel estratificado 1% (n = 246) 0,59 17,1 9,0 <1% (n = 209) 0,90 10,4 10,1 5% (n = 181) 0,43 18,2 8,1 <5% (n = 274) 1,01 9,7 10,1 10% (n = 165) 0,40 19,4 8,0 <10% (n = 290) 1,00 9,9 10,3 0,25 0,5 1,0 2,0 Favorece OPDIVO (placeholder) P04446BR_01/SK CA/ p. 11/14

12 Observação: a razão de risco não estratificada e o IC 95% correspondente foram estimados em um modelo de risco proporcional de Cox usando o braço randomizado como uma única covariável Figura 2: Sobrevida geral - pacientes com NSCLC não escamoso com expressão do PD-L1 1% - CA ,0 0,9 0,8 Probabilidade de sobrevida 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 OPDIVO Docetaxel 0, Sobrevida geral (meses) Número de risco OPDIVO Docetaxel Figura 3: Sobrevida geral - pacientes com NSCLC não escamoso com expressão do PD-L1 <1% - CA ,0 0,9 0,8 Probabilidade de sobrevida 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 OPDIVO Docetaxel 0, Sobrevida geral (meses) Número de risco OPDIVO Docetaxel (placeholder) P04446BR_01/SK CA/ p. 12/14