AMACR: Coenzima racemase alfa-metilacil A, α-metilacil-coa, P504S Citoqueratina de elevado peso molecular (HMW): Queratina 903

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1 DuoFLEX Cocktail Anti-AMACR Anti-Cytokeratin HMW Anti-Cytokeratin 5/6 Ready-to-Use (Link) Referência IC004 Finalidade Sinónimos de antigénio Resumo e explicação Reagente fornecido Para utilização em diagnóstico in vitro. O cocktail DuoFLEX constituído pelos anticorpos Monoclonal Rabbit Anti-Human AMACR, Clone 13H4, Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin, High Molecular Weight, Clone 34ßE12 e Monoclonal Mouse Anti- Human Cytokeratin 5/6, Clone D5/16 B4 (Link), é indicado para utilização em imuno-histoquímica em conjunto com os instrumentos Autostainer Link. Este cocktail de anticorpos é utilizado como teste de diagnóstico auxiliar para a confirmação do carcinoma prostático, neoplasia intra-epitelial prostática e as respectivas lesões de simulação benigna em tecidos da próstata fixados em formol e impregnados em parafina (1-5) após o diagnóstico primário por exame morfológico de coloração de lâminas com H&E. A interpretação clínica de qualquer coloração ou da sua ausência deve ser complementada com estudos morfológicos utilizando controlos adequados e deve ser avaliada dentro do contexto do historial clínico do doente e através de outros testes de diagnóstico por um patologista qualificado. AMACR: Coenzima racemase alfa-metilacil A, α-metilacil-coa, P504S Citoqueratina de elevado peso molecular (HMW): Queratina 903 AMACR: O anti-amacr monoclonal de coelho, Clone 13H4 reconhece um aminoácido de proteína 382 identificado pela subtracção do banco de cadn em conjunto com a análise de micromatrizes de alta finalidade ao adenocarcinoma da próstata (6). O anticorpo de alfa-metilacil-coa racemase (AMACR) é uma enzima envolvida na biossíntese dos ácidos biliares e na β-oxidação dos ácidos gordos de cadeia ramificada (7). O AMACR é expresso em células de neoplasia intra-epitelial de alto grau de pré-malignidade (HGPIN) e no adenocarcinoma da próstata, mas está presente em níveis baixos ou indetectáveis nas células epiteliais glandulares da próstata normal e da hiperplasia prostática benigna (6,8 13). CK HMW: O Cytokeratin, High Molecular Weight, Clone 34ßE12, consiste em proteínas do citoesqueleto de filamento intermédio, essenciais para o desenvolvimento e diferenciação das células epiteliais. Foram identificadas aproximadamente vinte citoqueratinas diferentes, tendo sido classificadas e numeradas de acordo com o seu peso molecular e os pontos isoeléctricos (14). No geral, a maioria das citoqueratinas de baixo peso molecular (40 a 54 kda) está distribuída pelo epitélio não escamoso e, no catálogo Moll, correspondem aos números 7 a 8 e/ou 17 a 20 (15). As citoqueratinas de elevado peso molecular (48 a 67 kda) são detectadas no epitélio escamoso e, no catálogo Moll, correspondem aos números 1 a 6 e/ou 9 a 16 (15). Citoqueratina 5/6: O Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin 5/6, Clone D5/16 B4 é uma citoqueratina do tipo básico de elevado peso molecular, com uma massa molecular de 58 kda, expressa nas camadas celulares basal, intermédia e superficial dos epitélios estratificados, bem como nos epitélios de transição, nos epitélios complexos e nas células mesoteliais e nos mesoteliomas. A CK 5 não tem, salvo raras excepções, sido encontrada nos epitélios simples e nas células não epiteliais. A CK 6 é igualmente uma citoqueratina do tipo básico de elevado peso molecular, com uma massa molecular de 56 kda, expressa pelo epitélio escamoso proliferativo aparecendo muitas vezes em conjunto com a CK 16 (48 kda) (16,17). Consultar as Instruções Gerais para Coloração Imuno-histoquímica da Dako ou as instruções do sistema de detecção quanto aos procedimentos de IHC para obter informação sobre: 1) Princípio do procedimento, 2) Materiais necessários, mas não fornecidos, 3) Conservação, 4) Preparação das amostras, 5) Procedimento de coloração, 6) Controlo de qualidade, 7) Resolução de problemas, 8) Interpretação da coloração, 9) Limitações gerais. Cocktail de anticorpo monoclonal de coelho e anticorpo monoclonal de ratinho pronto a utilizar, fornecido na forma líquida num tampão com proteína estabilizadora e 0,015 mol/l de NaN 3. Monoclonal Rabbit Anti-Human AMACR, Clone 13H4, Isotipo: IgG1, kappa Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin, High Molecular Weight, Clone 34ßE12, Isotipo: IgG1, kappa Monoclonal Mouse Anti-Human Cytokeratin 5/6, Clone D5/16 B4, Isotipo: IgG1, kappa Imunogénio AMACR: P504S, recombinante de comprimento total (6) CK HMW: Queratina de imunogénio solubilizado extraído da camada córnea humana Citoqueratina 5/6: Citoqueratina 5 isolada Especificidade A especificidade do anti-amacr monoclonal de coelho foi avaliada por imuno-citoquímica e pela análise Western blot. O anti-amacr liga-se positivamente às células HEK293 fixadas em formol que sobrexpressaram AMACR, mas não foi reactivo com as células transfectadas com um plasmídeo vazio. Nas análises Western blot dos lisados de amostras do carcinoma da próstata primário, o anti-amacr monoclonal de coelho identificou uma proteína de 54 kda consistente com o peso molecular esperado de AMACR (9). ( ) PT_001 p. 1/5

2 Foi demonstrado que o anti-ck HMW, 34βE12 reagia com as proteínas de 66, 57, 51 e 49 kda (1), que correspondem às citoqueratinas 1, 5, 10 e 14 no catálogo Moll (14,15,18). Shah et al. (19) sugeriram a utilidade clínica do anti-ck HMW, 34ßE12 como auxiliar na diferenciação das doenças de Paget e Bowen (carcinoma in situ) do melanoma de difusão superficial pagetóide. A positividade ao anti-ck HMW, 34βE12 foi relatada na doença de Paget da mama (5/5) e na doença de Bowen (10/10), embora 25% (1/4) dos casos de doença de Paget da vulva e 0/6 dos casos de melanomas de difusão superficial pagetóides tenham apresentado coloração (19). Para o anti-citoqueratina 5/6, Clone D5/16 B4, na análise Western blot de preparações citoesqueléticas da epiderme e do epitélio não queratinizante, o anticorpo marca a citoqueratina 5. Marca ainda a citoqueratina 6 e marca, de forma fraca, a citoqueratina 4. Não foi observada uma reacção cruzada com as citoqueratinas 1, 7, 8, 10, 13/14, 18 e 19. Precauções 1. Para utilizadores profissionais. 2. Este produto contém azida de sódio (NaN 3), um produto químico altamente tóxico na forma pura. Em situações de concentração do produto, embora não sendo classificada como perigosa, a azida de sódio pode reagir com as canalizações de chumbo e de cobre, formando acumulações de azidas metálicas altamente explosivas. Ao eliminar o produto, adicionar água abundante para evitar a acumulação de azidas metálicas na canalização. 3. Tal como acontece com qualquer produto de origem biológica, deverão utilizar-se procedimentos de manuseamento adequados. 4. Usar equipamento de protecção pessoal adequado para evitar o contacto com a pele e os olhos. 5. A solução não utilizada deverá ser eliminada em conformidade com as regulamentações locais e nacionais. Conservação Preparação das amostras incluindo materiais necessários, mas não fornecidos Procedimento de coloração incluindo materiais necessários, mas não fornecidos Conservar entre 2 8 C. Não utilizar após o fim do prazo de validade impresso no frasco. Se os reagentes forem conservados em condições diferentes das especificadas, o utilizador deverá verificar essas mesmas condições. Não existem sinais óbvios que indiquem a instabilidade deste produto. Por isso, devem processar-se controlos positivos e negativos simultaneamente com as amostras do doente. Caso se observe uma coloração inesperada que não possa ser explicada pela variação nos procedimentos laboratoriais e se suspeite da existência de um problema com o anticorpo, contactar a Assistência Técnica da Dako. O cocktail de anticorpos pode ser utilizado para marcar secções de tecido fixadas em formol e impregnadas em parafina. As amostras de tecidos devem ser cortadas em secções de aproximadamente 4 µm. É necessário proceder ao pré-tratamento com recuperação do epítopo induzida por calor (HIER). Obtêm-se resultados óptimos ao pré-tratar os tecidos com EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (Referência K8004). Secções desparafinizadas: É recomendado o pré-tratamento das secções desparafinizadas de tecido fixado em formol e impregnado em parafina utilizando o Dako PT Link (Referência PT100/PT101). Para informações detalhadas, consultar o Guia do Utilizador PT Link. Seguir os procedimentos de pré-tratamento delineados no folheto informativo do EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (Referência K8004). Para o PT Link, devem ser utilizados os seguintes parâmetros: Temperatura de pré-aquecimento: 65 C; temperatura e tempo da recuperação do epítopo: 97 C durante 20 (±1) minutos; arrefecer até 65 C. Retir ar cada suporte de lâminas Autostainer com as lâminas do tanque do PT Link e mergulhar, imediatamente, as lâminas num frasco/tanque (por exemplo, PT Link Rinse Station, Referência PT109) com EnVision FLEX Wash Buffer (20x), (Referência K8007), diluído e à temperatura ambiente. Deixar as lâminas em Wash Buffer durante 1 5 minutos. Secções impregnadas em parafina: A utilização de um meio de montagem aquoso (Dako Faramount, Referência S3025) é o método de cobertura preferencial. Como uma alternativa à preparação das amostras, a desparafinização e a recuperação do epítopo podem ser realizadas no PT Link, utilizando um procedimento modificado. Para obter instruções, consultar o Guia do Utilizador PT Link. Após a conclusão do procedimento de coloração, as secções têm de ser secas ao ar a 60 C, mergulhadas em xilol e montadas com um meio de montagem permanente. O álcool deve ser evitado com as montagens permanentes uma vez que pode reduzir a reactividade do cromogénio vermelho. Antes da montagem, as secções de tecido não devem secar durante o pré-tratamento ou durante o processo de coloração imuno-histoquímica seguinte. Para uma maior aderência das secções de tecido às lâminas de vidro, recomenda-se a utilização de Dako FLEX IHC Microscope Slides (Referência K8020). O sistema de visualização recomendado é o EnVision DuoFLEX Doublestain System, (Link) (Referência SK110). As etapas de coloração e os tempos de incubação são pré-programados no software Autostainer Link. Consultar o Guia do Utilizador do Autostainer Link para obter instruções detalhadas sobre a colocação das lâminas e dos reagentes. Se os protocolos não estiverem disponíveis na plataforma Autostainer utilizada, contactar o Serviço Técnico da Dako. Todas as etapas de incubação devem ser realizadas à temperatura ambiente. As condições ideais poderão variar dependendo das amostras e dos métodos de preparação, devendo ser determinadas por cada laboratório. Se o patologista que procede à avaliação pretender uma intensidade de coloração diferente, pode ser contactado um Especialista de Aplicações/Especialista do Serviço Técnico da Dako, para se obterem informações acerca da re-programação do protocolo. Certificar-se de que o desempenho do protocolo ajustado ainda é válido, avaliando se o padrão de coloração é idêntico ao padrão de coloração descrito nas Características de desempenho. ( ) PT_001 p. 2/5

3 Interpretação da coloração Características de desempenho Recomenda-se a contrastação em hematoxilina com o EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (Referência K8008). É recomendado um meio de montagem não aquoso e permanente. Para a montagem permanente, as lâminas devem ser secas ao ar durante 1 hora a 60 C e posteriormente mergulhadas em xilol durante 5 minutos. O álcool deve ser evitado com as montagens permanentes uma vez que pode reduzir a reactividade do cromogénio vermelho. Os controlos positivos e negativos devem processar-se simultaneamente com o mesmo protocolo das amostras do doente. O tecido de controlo positivo deve incluir a próstata (normal ou com hiperplasia) e as células/estruturas devem apresentar padrões de reacção conforme os descritos para este tecido nas Características de desempenho em todas as amostras positivas. As células de carcinomas marcadas pelo anti-amacr apresentam uma coloração citoplásmica granular vermelha. As células marcadas pelo anti-citoqueratina de elevado peso molecular apresentam uma coloração citoplásmica castanha. As células marcadas pelo anti-citoqueratina 5/6 apresentam uma coloração citoplásmica castanha. Tecidos normais: Anti-AMACR: Tipo de Elementos de tecidos com coloração positiva tecido (nº testados) (8,9,12) Rim (12) 8 12/12 Células epiteliais tubulares Fígado (15) 8 15/15 Hepatócitos Pulmão (12) 8 12/12 Células epiteliais brônquicas Vesícula biliar ((10) 8 10/10 Células epiteliais Cólon (20) 9 20/20 Epitélio de superfície colónica, focal e luminal Cólon hiperplásico (28) 12 1/28 Próstata, benigno (194) 9 23/194 Supra-renal (12) 8 0/12 Bexiga (7) 8 0/7 Encéfalo (5) 8 0/5 Mama (12) 8 0/12 Endométrio (12) 8 0/12 Coração (5) 8 0/5 Nódulo linfático (7) 8 0/7 Pâncreas (15) 8 0/15 Próstata (19) 8 0/19 Ovários (12) 8 0/12 Intestino delgado (18) 8 0/18 Glândula salivar (7) 8 0/7 Pele (7) 8 0/7 Baço (12) 8 0/12 Estômago (13) 8 0/13 Tiróide (5) 8 0/5 Testículos (5) 8 0/5 O anti-ck HMW, 34βE12 é reactivo com tecidos epiteliais normais que incluem: epitélio escamoso e ductos sudoríparos na pele (18), todas as camadas epiteliais incluindo o epitélio luminal e basal e as células ductais na mama (20), alguns pneumócitos, mesotélio e epitélio brônquico no pulmão, epitélio do ducto colector no rim e células ductais no pâncreas, ductos biliares no fígado, mesotélio e uma porção do epitélio (células com uma localização mais basal) do tracto gastrointestinal (18). Os hepatócitos, as células acinares pancreáticas, os túbulos renais proximais e os tecidos normais não epiteliais, não são marcados pelo anti-ck HMW, 34βE12 (18). O anti-ck HMW, 34βE12 corou a glândula mamária, os epitélios escamosos do colo do útero, a glândula prostática, o ducto excretório da glândula salivar lingual, os epitélios escamosos da pele, as células reticulares e os corpúsculos de Hassall do timo, bem como o epitélio escamoso da amígdala. Não se observou coloração na supra-renal, medula óssea, cerebelo ou cérebro, cólon, coração, rim, fígado, pulmão, células mesoteliais, ovário, pâncreas, paratiróide, pericárdio, nervo periférico, pituitária, músculo-esquelético, intestino delgado, baço, estômago, testículos, tiróide e útero. O anticorpo citoqueratina 5/6 marca o epitélio escamoso estratificado. No epitélio complexo, na maioria dos casos, as células basais expressam a CK 5. As células do epitélio simples e as células não epiteliais, geralmente, não são marcadas pelo anticorpo. Tecidos anormais: O anti-amacr apresenta imuno-reactividade com a maioria dos carcinomas da próstata testados (8 13). Tipo de tecido (nº testados) Tumores com coloração positiva Adenocarcinoma da próstata (18) 8 17/18 Carcinoma hepatocelular (21) 8 17/21 Carcinoma do rim (24) 8 18/24 Carcinoma das células transitórias da bexiga (29) 8 9/29 Adenocarcinoma do estômago (15) 8 4/15 Adenocarcinoma da mama (61) 8 9/61 Colangiocarcinoma do ducto biliar (14) 8 2/14 ( ) PT_001 p. 3/5

4 Adenocarcinoma do pulmão (23) 8 3/23 Carcinoma neuroendócrino; GI, pulmão e fígado (9) 8 1/9 Sarcoma epitelióide dos tecidos moles (12) 8 1/12 Adenocarcinoma dos ovários (27) 8 2/27 Adenocarcinoma do pâncreas (13) 8 1/13 Tumor cortical supra-renal (20) 8 1/20 Tumores das glândulas salivares (28) 8 1/28 Carcinomas do cólon (176) /176 Bem diferenciados (58) 12 45/58 Moderadamente diferenciados (88) 12 66/88 Deficientemente diferenciados (30) 12 11/30 Tumores das células germinativas (14) 8 0/14 Tumores carcinóides; pulmão e GI (10) 8 0/10 Carcinoma da célula pequena; pulmão e pele (15) 8 0/15 Mesotelioma pleural (16) 8 0/16 Carcinoma indiferenciado (27) 8 0/27 Melanoma (20) 8 0/20 Carcinoma da célula escamosa; pele e mucosas (25) 8 0/25 Carcinoma da célula basal da pele (20) 8 0/20 Sarcoma sinovial (6) 8 0/6 Tumores da tiróide (54) 8 0/54 Timoma (8) 8 0/8 Carcinoma endometrióide (10) 8 0/10 Foi relatada positividade com o anticorpo anti-ck HMW, 34βE12 nas células escamosas e nos carcinomas de células transitórias ou ductais, incluindo: carcinoma das células escamosas da pele, pulmão e nasofaringe, carcinoma ductal da mama, pâncreas, canal biliar e glândula salivar, bem como carcinomas de células transitórias da bexiga, nasofaringe e timomas (21,22). O anti-ck HMW, 34βE12 corou os mesoteliomas epiteliais, mas não mostrou reacção com os mesoteliomas sarcomatóides ou desmoplásicos (23). Os tumores epiteliais negativos ao anti-ck HMW, 34βE12 são ou adenomas do tipo "acinar" (por exemplo, pituitária) ou adenocarcinomas de epitélios simples (por exemplo, carcinomas do endométrio, carcinomas renais e hepatocelulares) ou tumores neuroendócrinos (18,22,24). Assim, o anti-ck HMW, 34βE12 pode ser utilizado como auxiliar na subclassificação de carcinomas (22). Foi também sugerida a utilidade do anti-ck HMW, 34βE12 no diagnóstico diferencial de lesões acinares pequenas da glândula prostática (20). O seu valor diagnóstico reside na identificação de células basais. O Malley et al. (25) observaram coloração positiva das células basais em 47 casos de lesões prostáticas benignas, incluindo hiperplasia adenomatosa atípica (26), hiperplasia das células basais (21) atrofia (20), hiperplasia pós esclerótica (19) e nódulo fibroepitelial (14), enquanto 21 casos de adenocarcinomas acinares pequenos não demonstraram reactividade. Foi salientado que a perda da camada de células basais não é uniforme em todos os adenocarcinomas da próstata. A perda de células basais só se verifica nos adenocarcinomas acinares pequenos. Foi recomendado que a ausência completa de coloração de lesões da próstata com anti-ck HMW, 34βE12 seja considerada como muito sugestiva, mas não indicativa de malignidade. O anticorpo citoqueratina 5/6 marcou 56/61 (92%) dos mesoteliomas pleurais epitelióides, marcando, ao mesmo tempo, 9/63 (14%) dos adenocarcinomas metastásicos. O mesotélio reactivo também foi marcado (27). Noutro estudo (28), todos os 23 mesoteliomas com diferenciação epitelióide ou acinar foram fortemente marcados pelo anticorpo, ao passo que a marcação nas áreas sarcomatóides dos tumores com uma morfologia mista foi fraca ou ausente. Um caso de mesotelioma sarcomatóide apresentou uma reacção equívoca, ao passo que os mesoteliomas do tipo desmoplásico ou sarcomatóide foram negativos. Dos 27 casos de adenocarcinomas secundários da pleura, 22 foram negativos, 4 foram fracos ou equívocos e 1 foi focalmente positivo. Através da utilização do anticorpo foram demonstrados níveis elevados de positividade da citoqueratina 5/6 na hiperplasia ductal do tipo normal e a coloração negativa da maioria dos casos de hiperplasia ductal atípica e carcinoma ductal in situ (29). Referências 1. 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5 8. Jiang Z, Fanger GR, Woda BA, Banner BF, Algate P, Dresser K, Xu J, Chu PG. Expression of α-methylacyl- CoA racemase (P504S) in various malignant neoplasms and normal tissues: A study of 761 cases. Human Pathology. 2003; 34(8): Jiang Z, Woda BA, Rock KL, Xu Y, Savas L, Khan A, Pihan G, Cai F, Babcook JS, Rathanaswami P, Reed SG, Xu J, Fanger GR. P504S: a new molecular marker for the detection of prostate carcinoma. Am J Surg Pathol. 2001; 25(11): Jiang Z, Wu C, Woda BA, Dresser K, Xu J, Fanger GR, Yang XJ. P504S/α-methylacyl-CoA racemase: a useful marker for diagnosis of small foci of prostatic carcinoma on needle biopsy. Am J Surg Path. 2002; 26(9): Yang XJ, Wu C, Woda BA, Dresser K, Tretiakova M, Fanger GR, Jiang Z. Expression of α-methylacyl-coa racemase (P504S) in atypical adenomatous hyperplasia of the prostate. Am J Surg Path. 2002; 26(7): Jiang Z, Fanger GR, Banner BF, Woda BA, Algate P, Dresser K, Xu J, Reed SG, Rock KL, Chu PG. A dietary enzyme: alpha-methylacyl-coa racemase/p504s is overexpressed in colon carcinoma. Cancer Detect Prev. 2003;27(6): Beach R, Gown AM, de Peralta-Venturina MN, Folpe AL, Yaziji H, Salles PG, Grignon DJ, Fanger GR, Amin MG. P504S immunohistochemical detection in 405 prostatic specimens including gauge needle biopsies. Am J Surg Pathol. 2002; 26(12): Moll R, Franke WW, Schiller DL. The catalog of human cytokeratins: Patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell 1982; 31: Miettinen M. Keratin immunohistochemistry: update of applications and pitfalls. Pathol Ann 1993; 28: Moll R, Franke WW, Schiller DL. The catalog of human cytokeratins: Patterns of expression in normal epithelia, tumors and cultured cells. Cell 1982;31: Moll R, Löwe A, Laufer J, Franke WW. Cytokeratin 20 in human carcinomas. A new histodiagnostic marker detected by monoclonal antibodies. Am J Pathol 1992;140: Gown AM, Vogel AM. Monoclonal antibodies to human intermediate filament proteins II. Distribution of filaments in normal human tissues. Amer J Pathol 1984; 114: Shah KD, Tabibzadeh SS, Gerger MA. Immunohistochemical distinction of Paget s Disease from Bowen s Disease and superficial spreading melanoma with the use of monoclonal cytokeratin antibodies. Amer J Clin Pathol 1987; 88: Varma M, Amin MB, Linden MD, Zarbo RJ. Discriminant staining pattern of small glandular and preneoplastic lesions of the prostate using high molecular weight cytokeratin antibody A study of 301 consecutive needle biopsies. Mod Pathol 1997; 10:93A 21. Bacchi CA, Zarbo RJ, Jiang JJ, Gown AM. Do glioma cells express cytokeratin? Appl Immunohistochem 1995; 3: Dairkee SH, Puett L, Hackett AJ. Expression of basal and luminal epithelium-specific keratins in normal, benign and malignant breast tissue. J Nat Can Inst 1988; 80: Bolen JW, Hammar SP, McNutt MA. Reactive and neoplastic serosal tissue: a light-microscopic, ultrastructural, and immunocytochemical study. Amer J Surg Pathol 1986; 10: Hurlimann J, Gardiol D. Immunohistochemistry in the differential diagnosis of liver carcinomas. Amer J Surg Pathol 1991; 15: O Malley FP, Grignon DJ, Shum DT. Usefulness of immunoperoxidase staining with high-molecular-weight cytokeratin in the differential diagnosis of small-acinar lesions of the prostate gland. Virch Arch Pathol Anat 1990; 417: Brown DC, Theaker JM, Banks PM, Gatter KC, Mason DY. Cytokeratin expression in smooth muscle and smooth muscle tumors. Histopathol 1987; 11:477 Edição 03/09 ( ) PT_001 p. 5/5